Автор: admin

В.И.ШИШКИН
(1780-1845гг.)

Среди соратников А.Г.Орлова особо следует назвать Василия Ивановича Шишкина, крепостного крестьянина, который был личным секретарем и казначеем А.Г.Орлова. В.И.Шишкин творчески воспринял коннозаводческие взгляды и методы А.Г.Орлова, овладел техникой тренинга резвой езды. Через 3 года после смерти Орлова — в 1811 году В.И.Шишкин стал управляющим Хреновского конного завода, в течении двадцати лет, до 1831 г., возглавлял его и довел до рассвета. При Шишкине было закончено строительство завода. Он завершил работу по выведению орловских пород, особенно рысистой.

По свидетельству Шишкина , основную роль в создании Орловской рысистой породы сыграл сын СМЕТАНКИ и буланой датской кобылы — жеребец ПОЛКАН I. Но ПОЛКАН I еще не обладал главным свойством, которого добивался Орлов, т.е. способностью бежать резвой рысью. Это свойство приобрели дети ПОЛКАНА от выводных из Голландии серых кобыл, принадлежащих, по мнению специалистов, к ответвлениям фризской породы, улучшенных прилитием варварийской крови. В заводе использовали 7 жеребцов и 21 кобылу от ПОЛКАНА I, но в заводских книгах оставили след только 3 жеребца — его сыновья. Подлинным же родоначальником орловской рысистой породы стал рожденный в 1784 г. БАРС I, полученный от серой голландской матки. По своему экстерьеру, силе и рысистым способностям БАРС I соответствовал типу нарядного могучего рысака, которого стремился вывести А.Г.Орлов. 12 сыновей БАРСА I сыграли основную роль в формировании орловской рысистой породы.

До 1831 года, во время, пока заводом руководил А.Г.Орлов-Чесменский, а потом В.И.Шишкин, все рысаки обязательно проходили тренинг и испытания. Ведение этого незыблемого принципа, а также разработка первых правил рысистых испытаний, включая изобретение специального летнего легкого спортивного экипажа — беговых дрожек, являются наряду с применением новых методов подбора и отбора неоспоримой заслугой А.Г.Орлова-Чесменского и В.И.Шишкина.

В 20-ые годы XIV века, особенно со второй половины, стал значительно расширяться собственный конный завод В.И.Шишкина в селе Алексеевском Бобровского уезда Воронежской губернии. Вначале на конном заводе было всего несколько маток, но потом Шишкин, через подставных лиц, стал покупать на московских аукционах десятки молодых кобыл, которых сам же отправлял на продажу с Хреновского конного завода. Можно предположить, что эти кобылы были не хуже тех, что оставались на Хреновском конном заводе, который к тому времени был уже продан в государственную казну. Орловских рысистых кобыл Шишкин случал с МОЛОДЫМ АТЛАСНЫМ и его полубратом БЕЗЫМЯНКА 1823 г.р. Кроме того, систематически проводилась тайная случка Шишкинских кобыл с лучшими жеребцами-производителями Хреновского завода. В то время, как запрет на продажу рысистых жеребцов Хреновского завода соблюдался, продукция Шишкинского завода свободно продавалась. Именно благодаря В.И.Шишкину орловский рысак распространился в частных конных заводах и стал основной русской заводской породой.В сравнительно короткий срок Шишкину удалось вывести в своем заводе рысаков, значительно превосходящих Хреновских по резвости. Это еще более увеличило спрос на продукцию шишкинского конного завода. Хотя цены на резвых шишкинских рысаков достигали 30 тыс. рублей и более, коннозаводчики стремились приобретать их в качестве производителей. Таким образом в 1830-140-ых годах частное рысистое коннозаводство развивалось на базе конного заводи В.И.Шишкина. Возникло множество частных рысистых конных заводов, к 1850 году их было уже около 100.

Литература:

Е.В.Кожевников, Д.Я.Гуревич. Отечественное коневодство: история, современность, проблемы. Москва, ВО «Агропромиздат», 1990.

3

Изучением ритмов активности и пассивности, протекающих в нашем организме, занимается особая наука – биоритмология. Согласно этой науке, большинство процессов, происходящих в организме, синхронизированы с периодическими солнечно-лунно-земными, а также космическими влияниями. И это неудивительно, ведь любая живая система, в том числе и человек, находится в состоянии обмена информацией, энергией и веществом с окружающей средой. Если этот обмен (на любом уровне – информационном, энергетическом, материальном) нарушается, то это отрицательно сказывается на развитии и жизнедеятельности организма.

ИЕРАРХИЯ УПРАВЛЕНИЯ В ОРГАНИЗМЕ

Тело человека состоит из клеток, соединяющих их тканей и систем: все это в целом представляет собой единую сверхсистему организма.

Мириады клеточных элементов не смогли бы работать как единое целое, если бы в организме не существовал сложный механизм регуляции. Особую роль в регуляции играет нервная система и система эндокринных желез. Но в сложном механизме регуляции есть несколько уровней, первым из которых является клеточный.

В каждой клетке тела заключена генетическая информация, достаточная для того, чтобы был воспроизведен весь организм.

Эта информация записана в структуре дезоксирибонуклеиновой кислоты
(ДНК) и заключена в генах, расположенных в едре.

Клетка имеет свои внитереклеточные регуляторы, причем их структура одинакова и у микробов, и в клетках высших организмов. Одна группа этих регуляторов построена из продуктов обмена глюкозы (циклически нуклеотиды), главным образом представителем которых является циклический аденозимонофосфат (или цАМФ); вторая – из продуктов обмена жирных кислот
(простагландины). Так, из энергетических субстратов создается система регуляции для использование этих субстратов.

Оболочка клетки — мембрана играет большую роль она является своего рода антенной или рецептаром, настроенным на восприятие одних сигналов и нечувствительных к другим. В соответствие с сигналами, поступающими с рецептаров мембраны, клетка меняет свою активность, скорость процесса деления и т.д. Так благодаря мембране клетка отвечает только на нужный ей сигнал или согласовывает первый уровень регуляции — внутриклеточный – с требованиями, предъявляемыми клетке организмом.

Второй уровень регуляции – надклеточный – создается гормонами.
Гормоны – специальные вещества, вырабатывающиеся главным образом в эндокринных железах; поступают через кровь, они оказывают влияние на деятельность чувствительных к ним клеток.
Если вспомнить, что первичная жизнь зародилась в водной среде, то не может не восхитить, что состав и концентрация солей (ионов), омывающих клетку, практически точно соответствует солевой воде мирового океана в докембрийскрой периоде, когда в процессе эволюции создавалась структура современной клетки. В течение миллионов лет состав клетки остается постоянным, несмотря на столь сложные их преобразования в специализированные ткани и органы входе дальнейшей эволюции живой природы.
Даже механизм смерти как бы обходит стороной определенные показатели внутренней среды (например, концентрацию кальция и фосфора в крови), одинаков важные и для одиночной клетки и Мирового океана, и для нервной клетки головного мозга человека. Эти свойства охраняются вероятно, столь стойко ради сохранения самой жизни.

Неслучайно высокоспециализированных живых системах, включая человека, функционирует особая эндокринная железа обедняющая деятельность ряда эндокринных желез – пульт управления и координации. У человека – гипофиз расположенный, в хорошо защищенной косными образованьями «турецком седле».

Каждой периферической эндокринной железе соответствует в гипофизе специальный гормон – регулятор. Это создает ряд отдельных систем, между которыми осуществляется взаимодействие.

4

Гипофиз представляет, таким образом, третий уровень регуляции у высших организмов. Но гипофиз может получать сигналы, оповещающие о том, что происходит в теле, но он не имеет прямой связи с внешней средой. Между тем для того, чтобы факторы внешней среды постоянно не нарушали жизнедеятельность организма, должно осуществляется приспособление тела к меняющимся внешним условиям.
О внешних воздействиях организм узнает через органы чувств, которые передают полученную информацию в центральную нервную систему. В организме существуют устройство – регуляторю, передающую данную информацию непосредственно в рабочие органы и соответствующие клетки разных тканей – гипоталамус.

Гипоталамус выполняет множество функций. Во-первых, связь нервной системой, так как гипоталамус это типичная нервная ткань состоящая из нейронов, связанная со всеми отделами нервной системы. Во- вторых, гипоталамус регулирует гипофиз, так как является однокринной железой.

Таким образом, с помощью гипоталамуса осуществляется взаимосвязь между внешним миром и внутренней средой. Благодаря своему необычному устройству гипоталамус преобразовывает быстродействующие сигналы из нервной системы, в медленнотекущие, специализированные реакции эндокринной системы.
Гипоталамус – четвертый уровень регуляции в организме.

Пятый уровень регуляции – центральная нервная система, включающая и кору головного мозга.
Наконец, особая эндокринная железа, также находящаяся в мозге, — эпофиз – оказывает регулирующие влияние на гипоталамус, в частности изменяет его чувствительность к действию гормонов.
И все же именно гипоталамус, а не другие отделы нервной системы является центральным регулятором внутренней среды организма. Чем обусловлено такое значение гипоталамуса? В первую очередь тем, что гипоталамус – главный регулятор вегетативных (протекающих подсознательно) функций.

Нервная систем может вмешаться в течение автоматического осуществления некоторых функций, если возникнет необходимость приспособить деятельность организма к требованиям, предъявляемым внешней средой, но не контролирует эту деятельность без необходимости. Поэтому гипоталамус во многом функционирует автоматически, без надзора со стороны центральной нервной системы, повинуясь собственному ритму и сигналам, поступающим из тела.

Гипоталамус регулирует также функции, как репродукция, рост тела
(гормон роста), деятельность щитовидной железы (тиреотропный гормон), коры надпочечников (кортикотроин), функцию молочной железы (лактогенный гормон, или гормон, стимулирующий секцию молока). В гипоталамусе и прилегающих к нему отделах мозга – находится центр сна, а также центр, контролирующий эмоции. В гипоталамусе находятся центры аппетита, и центр теплопродукции и теплорегуляции.

В гипоталамусе имеются структуры, связанные с регуляцией удовольствия или наслаждения. Многие из этих центров функционируют взаимосвязано, например, отделы гипоталамуса, контролирующие аппетит, эмоции и энергетический обмен. В гипоталамусе имеются специальные структуры, или центры, с которыми связанна регуляция сердечной деятельности , тонуса сосудов , иммунитета , водного и солевого балансов, функции желудочно- кишечного тракта, мочеотделения и т.д. Более того, в гипоталамусе есть отделы, имеющие прямое отношение к вегетативной нервной системе в целом.
Вегетативная нервная система регулирует деятельность внутренних органов, а именно, контролирует повторяющиеся, автоматические процессы в теле. Сама вегетативная система состоит из 2 частей – симпатической и парасимпатической, которые оказывают на ткани и органы противоположные влияния. По существу, нет ни одной функции в сложной интеграции организма,

5 которая не требовала бы участия гипоталамуса. Но в целом все его функции можно разделить на 2 группы.

Во-первых, гипоталамус приспосабливает деятельность организмов к условиям среды, защищает организм от повреждающих влияний внешней среды, т. е. Противодействует факторам, могущим привести к смерти организма.

Во-вторых, гипоталамус – это высший орган постоянства внутренней среды. Вместе с регулируемыми органами гипоталамус работает как своеобразная замкнутая система, обеспечивая постоянство внутренней среды в соответствии с информацией, получаемой из внутреннего мира организма.
Гипоталамус тщательно контролирует постоянные, регулярные процессы, которые должны протекать циклически, независимо от внешнего мира. Но он также приспосабливает организм к давлению окружающей среды.
Более того, гипоталамические и гипофизарные процессы влияют на состояние не только тела, но и мозга и, можно сказать, на состояние духа. Те же самые гормоны, которые контролируют секрецию молока (лактогенный гормон), коры надпочечников (кортикотропин) и мобилизацию жира (липотропин), подвергаются в мозге биологическим превращениям. В результате от этих гормонов отсоединяются более простые по строению вещества, которые воздействуют на процесс запоминания и обучения, эмоциональную окраску событий, восприятие боли – т.е. на выработку мозгом многих решений. Таким образом, как бы материализуется пословица: “В здоровом теле – здоровый дух”.
Системы гипоталамуса, которые поддерживают постоянство внутренней среды, строго регулируются в соответствии с механизмами отрицательной связи. Они обеспечивают выполнение закона постоянства внутренней среды организма.

Стабильность не следует понимать как нечто неподвижное застывшее.
Само поддержание стабильности может быть связано с активной работой каждой системы в отдельности и всего организма в целом, а это означает, что стабильность – это усредненные колебания каждого явления, т.е. динамическое равновесие, достигаемое при правильной деятельности гомеостатических систем. Вместе с тем если стабильность – это необходимое условие существования организма, то любое стойкое нарушение следует определять как болезнь.
Дать определение слову «болезнь» ттрудно. Применительно к патологическим процессам, связанным с нарушением постоянства внутренней среды и регуляции в целом, болезнью, по определению, т.е. в строго теоретическом смысле можно считать состояние стойкого или интенсивного отклонения от стабильности.
Иными словами, любое стойкое5 нарушение гомеостаза является болезнью, ибо болезнью закономерно обозначают любой патофизиологический процесс, увеличивающий вероятность смерти. В правильности данного определения можно убедиться, узнав о роли стресса в возникновении так называемых болезней адаптации.
СТРЕСС И БОЛЕЗНИ
В организме в ответ на каждое изменение условий, требующее повышение работоспособности, возникает серия стереотипных приспособительных реакций, направленных на обеспечение его защиты. Совокупность этих защитных реакций известный физиолог Ганс Селье определил как адаптационный
(приспособительный) синдром, или стресс.
Повышение или понижение температуры окружающей среды, голод или жажда, эмоциональное напряжение или обездвиживание – все это вызывает ряд изменений в организме, которые объединяются в понятие “стрессорная реакция”.

Организм в этих случаях как бы не интересуется деталями, тем, что составляет особенность каждого из стрессоров, а реагирует в целом на повреждающий фактор. Стрессорная реакция выгодна для организма тем, что она стереотипна: организм имеет возможность сразу преступить к защите, использовав для этого одну закрепленную реакцию в ответ на все многообразие чрезвычайных раздражителей. Реакция адаптации, или стресса, включается всегда автоматически,

6 без участия сознания, а лишь под влиянием безусловных рефлексов – боли или изменения состава внутренней среды

Искусственное нарушение системы адаптации влечет за собой серьезные последствия. Но и в естественных условиях организм нередко дорого платит за свою способность защищаться путем приспособления. Большая группа болезней адаптации возникает именно в условиях стресса.
Рассмотрим классический пример стрессовой ситуации: встреча собаки и кошки.
Органы чувств на расстоянии дают сигнал в центральную нервную систему о том, что противник близко. Ситуация оценивается корой головного мозга , но сама оценка эмоциональна.

Именно эмоция является сильнейшим мобилизующим фактором. Регуляция эмоций в значительной мере сосредоточена в гипосталамусе.

Он посылает сигналы вегетативной нервной системе. Сигнал быстро поступает в надпочечники, и они выбрасывают свой гормон – адреналин. Выброс адреналина в кровь способствует расширению сосудов головного мозга сердца, легких и, напротив, сужению сосудов кожи и внутренних органов, вследствие чего происходит перераспределение объема крови, выгодное для борьбы.
Усиливается деятельность сердца, увеличивается артериальное давление.
Вся эта деятельность нуждается в обеспечении энергией, и адреналин мобилизует источники энергии жировые депо – жирные кислоты и из печени – глюкозу. Усиливается питание мышечной ткани и мозга. Все это, вместе взятое, способствует повышению температуры и создает оптимальные условия для протекания химических реакций.

Адреналин резко повышает способность сердца усваивать кислород. Для человека эта защитная мера может стать крайне опасной. Слишком интенсивное поглощение кислорода из крови при отрицательных эмоциях временно может создать кислородное голодание, что иногда приводит к недостаточности в работе сердца, и даже к инфаркту миокарда. Но при нормальном течении стрессорной реакции адреналин, быстро разрушаясь, успевает дать стимул для антистессорной защиты.
В гипоталамусе к этому времени происходит изменение в концентрации посредников – нейромедиаторов. Они активизируют выделение в кровь из гипофиза кортикотропина, гормона роста и пролактина. Эти гормоны мобилизуют жирные кислоты из жировых депо. Это необходимо, так как длительное использование адреналина энергетически невыгодно: адреналин вызывает вегетативную бурю. Кроме того, жирные кислоты обеспечивают сердцу в 6 раз больше энергии, чем глюкоза.

Кортикотропин (гормон гипофиза) ведает деятельностью коры надпочечников и усиливает антистрессорную защиту. Кора надпочечников всегда включается, когда необходима защита. Сначала мозговым слоем коры надпочечников вырабатывается адреналин. Затем под влиянием кортикотропина выделяется группа гормонов, главным из которых является кортизол. Кортизол обладает сходными с адреналином свойствами, но время действия кортизола значительно больше. Кортизол препятствует усвоению глюкозы в мышечной ткани и активизирует процесс превращения белка в глюкозу. Однако при выделении большого количества кортизола вследствие очень сильного эмоционального воздействия у человека может даже развиться временный сахарный диабет из-за неспособности быстро усваивать вновь образуемый сахар. Если у того или иного индивидуума имеются к тому же определенные предпосылки, то длительный стресс может привести и к стойкому диабету.

Белки являются структурными и функциональными элементами клеток.
Поэтому перевод белков в сахар очень не выгоден для организма. Белки берутся из тех тканей, которые быстро обновляются в организме и не несут определенной структурной функции. Такой тканью является лимфоциты, рассредоточенные в лимфатических железах, селезенке, костном мозге и химусе
– главном органе клеточного иммунитета. Неслучайно, что после сильного и длительного волнения легко заболеть простудным, вирусным заболеванием.
Связь между волнением и инфекцией

7 порождена использованием лимфоцитов для обеспечения энергетических потребностей в период стресса.

Но в разгар стресса все возможные последствия расчет не принимаются, напротив, обеспечение энергией – главное. Еще более суживается просвет сосудов внутренних органов, усиливается работа сердца, повышается давление крови в системе, ускоряется ток крови. Поэтому длительные отрицательные эмоции опасны для гипертоника. Стрессы способствуют возникновению гипертонической болезни.
Все гормоны повышают свертываемость крови, и позволяет избежать сильных кровотечений. Но этот защитный механизм может явиться причиной возникновения тромбоза сосудов и инфаркта миокарда у человека под влиянием эмоционального возбуждения.
В процессе борьбы все, что мешает должно быть заторможено. Поэтому кортизол подавляет не только иммунные реакции, но и воспаление, тем самым, уменьшая величину повреждений при травме.

Но если повреждение тканей велико, то часть белков из травмированной ткани, попадая в общий кроваток, достигает иммунной системы и, действуя на нее подобно «чужим» белкам, производит иммунизацию организма против собственных тканей. Антитела проникая в ткани, могут вызвать повреждение.
Это грозит животному болезнями и даже смертью после окончания борьбы от аутоиммунных заболеваний.

Кортизол, кортикотропин и пролактин тормозит активность полового центра и центра аппетита гипоталамуса, что целесообразно во время борьбы.

После окончания борьбы с ее высоким расходом энергии начинается фаза восстановления. Расширяются кожные сосуды, увеличивается потоотделение. Это охраняет от чрезмерного перегревания, возможного вследствие интенсивного сгорания жирных кислот и глюкозы в ходе борьбы. Избыток жирных кислот служит в период восстановления сырьем для синтеза холестерина, который необходим для ремонта поврежденных тканей с помощью деления клеток (каркас мембраны содержит много холестерина).

Все эти изменения происходят при каждом эмоциональном стрессе. Поэтому частые и ли длительные волнения, создавая ложную ситуацию защиты, формируют типичную болезнь старения – атеросклероз.

Затем срабатывает особый антидиуретический гормон – вазопрессин, – который задерживает выделение воды почками и помогает восстановлению потерянной крови. Усиливается функция щитовидной железы. Затухает выделение кортизола, что способствует восстановлению синтеза белка.

Так последовательно, этап за этапом регулируется механизм защиты и восстановление потерь.

Нарушение равновесия при стрессе возможно благодаря повышению гипоталамического порога. При его отсутствии стрессорная приспособительная реакция была бы кратковременной. Высшие организмы наделены высокой способностью защиты от стрессоров, что обусловлено появлением в процессе эволюции сложных гомеостатических систем. Создать необходимые отклонения для защиты возможно только за счет нарушения гомеостаза. Тем самым, защищаясь от внешних причин смерти, организм делает это ценой болезней адаптации.

После эмоционального напряжения наступает апатия – признак истощения запасов нейромедиаторов, необходимости покоя для восстановления. Стрессовая ситуация забывается организмом, если во время стресса не произошло серьезных нарушений в организме.

8
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ БИОРИТМЫ

Ввиду того, что каждая клетка представляет собой самостоятельную функциональную единицу и что активность действия отдельных клеток, логично начать рассмотрение биоритмов с клеточного уровня.

Содержимым клетки является протоплазма, в которой постоянно идут два противоположных процесса: анаболизма и катаболизма.

Анаболизм – это биологический процесс, при котором простые вещества соединяются между собой, что приводит к построению новой протоплазмы, росту и накоплению энергии.

Катаболизм – это противоположный анаболизму процесс расщепление сложных веществ на более простые, при этом ранее накопленная энергия освобождается и производится внешняя или внутренняя работа.

Таким образом, анаболические процессы ведут к наращиванию протоплазмы, а катаболические, наоборот, – к уменьшению и ее деструктуризации. Но эти два процесса, сочетаясь, взаимно усиливают друг друга. Так, процессы распада клеточных структур стимулируют их последующий синтез, а чем больше сложных структур накапливается в протоплазме, тем активнее может идти последующее расщепление с высвобождением большого количества энергии. В этом случае наблюдается максимальная жизнедеятельность клетки, а, следовательно, всего организма в целом.
Руководят этим ритмом свет и температура. Чем сильнее эти два фактора, тем выражение циклоз (перемешивание протоплазмы) и активнее ферменты. К тому же с 3 до 15 часов происходит сдвиг внутренней среды организма в кислую сторону. Умеренная физическая нагрузка дополнительно способствует сдвигу
КЩР (кислотно-щелочного равновесия) в сторону закисления. Таким образом, светлое время суток способствует активизации катаболических процессов в каждой клетке организма.
С уменьшением освещения и понижением температуры уменьшается и физическая активность. Все это вместе вызывает загустение протоплазмы клеток, уменьшение в них циклоза. В итоге клетки переходят в неактивное состояние.
Теперь в них реализуется программа восстановления, накопления, чему способствует также сдвиг с 15 до 3 часов КЩР в щелочную сторону.

Таким образом, главным водителем и синхронизатором внутриклеточных биоритмов является смена дня и ночи.

Угнетают биоритм клеток несколько факторов.
1. Элементарное несоблюдение ритма бодрствования и сна. Днем спать, ночью работать. Надо обязательно отказаться от ночных смен и от противоестественного образа жизни.
2. Организм имеет свой собственный электрический заряд. Ввиду того, что поверхность Земли и околоземные слои атмосферы имеют отрицательный заряд, ноги заряжаются отрицательно. Голова за счет дыхания положительно заряженным воздухом и контакта с ним приобретает положительный заряд. Но средний заряд туловища должен быть нейтральным, а с ним и общий заряд тела человека при разности потенциалов между ступнями ног и макушкой головы достигает в среднем 210-230 вольт. Эти показатели являются важнейшими при нормальной жизнедеятельности организма, что влияет на внутреннюю среду и биотоки. Ввиду того, что современный человек изолирован от Земли (обувь на электроизоляционной подошве, синтетическая одежда, искусственные половые покрытия, мебель из пластика и т.д.), подпитка организма отрицательными зарядами через ноги сильно затрудняется. В результате организм приобретает избыточный положительный заряд, который смещает внутреннюю в кислую сторону, и ориентируют макромолекулы организма в пространстве в неблагоприятную для их функционирования сторону.

9
СУТОЧНЫЕ БИОРИТМЫ
ПОДДЕРЖАНИЕ СИНХРОННОСТИ С ВРАЩЕНИЕМ ЗЕМЛИ

Каждый организм, существующий на Земле, является своеобразными часами.
Все организмы – плоды эволюции, на протяжении трех миллиардов лет жизнь на
Земле развивалась и приспосабливалась, непрерывно и бесконечно передавая информацию от клетки к клетке, из поколения в поколение. Все живые организмы несут в себе все изменения, накопленные в этом долгом процессе развития, поэтому мы так хорошо приспособлены к неустанному вращению на шей планеты.

Физиологическое время, так же как и местное время на вращающейся планете, имеет циклический характер. Для любых часов, внешних или внутренних, подстройка (сдвиг) на один или нескольких полных циклов не дает заметного эффекта. Однако сдвиг биологических часов на часть цикла приводит к ощутимым физиологическим последствиям, как показывает феномен перепада времени при трансмеридианных перелетах. Такое смещение внутри цикла называется сдвигом фазы, то есть положения повторяющегося процесса в его собственном цикле (например, фазы Луны).

Помимо эффекта перепада времени, открытого лишь недавно в связи с трнсмередианными перелетами, существует постоянная необходимость подстраивать фазу биологических часов из-за небольшого расхождения между собственным периодом этих часов и периодом вращения Земли. Несоответствие этих периодов на час или около того обычно для многих биологических видов, имеющих достаточно точные внутренние часы. У человека, например, период часов близок к 24 часам. Отклонение на час составляет всего 4% суток, – очевидно, это вполне допустим о. Из-за близости периода к земным суткам биологические часы этого класса были названы циркадианными (от лат. Circa – около, приблизительно и dies – день, сутки).

Час по сравнению с сутками кажется незначительным, но эффект разности периодов быстро накапливается. Но для живых организмов важна синхронность и, чтобы ее поддерживать, нужно постоянно вносить поправку. Если фазу убегающих или отстающих часов нельзя было сдвигать, то, они должны были все время двигаться (для компенсации одного часа на экваторе нужна скорость 40 миль в час). Если бы часы были абсолютно точными и фаза неуправляемой, то их владелец был бы навсегда прикован к временной зоне своего рождения.
Более того, эти идеальные биологические часы должны быть невосприимчивы к любому фактору, сдвигающему фазу, например, охлаждению.

Не имея возможности подстраивать фазу своих 25-часовых внутренних часов, – а эту способность утратили отдельные, в том числе многие слепые, — их владельцы, оставаясь на месте, будут смещаться во времени и утрачивать согласованность с окружающим 24-часовым миром. Если расхождение составляет ровно час в сутки, то согласованность будет восстанавливаться периодически, каждые 24 дня. Если улучшить соответствие собственного периода часов внешнему периоду, это не снимет проблемы, а лишь удлинит процесс утраты и приобретения синхронности. Следовательно, для того чтобы поддерживать синхронность наших внутренних часов с вращением Земли требуется нечто большее, чем просто близкое соответствие двух периодов: требуется сигнал, внешний такт, который бы ежедневно подстраивал фазу наших часов к местному времени.

Сигнал времени должен быть строго связан с вращением планеты и ежедневно достаточно точно повторяться. Таким сигналом времени для большинства биологических видов является свет. Постоянное освещение с интенсивностью лунного света оказывается достаточным, чтобы остановить ход циркадианных часов у плодовой мушки и у грибов в лаборатории. У млекопитающих часы менее чувствительны, а у человека еще меньше, но и для нас лучший способ узнать время – посмотреть на свет.

10

ВРОЖДЕННЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЧАСЫ ЧЕЛОВЕКА

( 25 – ЧАСОВОЙ ПЕРИОД )

Что может быть привычнее смены дня и бодрствования, однообразные череды наших дней и ночей? Одновременно с вращением Земли «ткань» нашего сознания совершает обороты, от безотчетных фантазий сонного уединения до коллективных фантазий общественной жизни. Каждый, кто пытался вырваться из этого круговорота, знает, что такой порядок вовсе не навязан жестоко чередованием света и темноты, хотя и уклоняться от него долго не удается. Мерный ход геофизического маятника имеет свое подобие внутри каждого из нас и непросто в виде привычки подчиняться ритмам планеты – внутри нас идут подлинные физиологические часы, составляющие часть нашего наследственного багажа. В обычных условиях ход этих врожденных биологических часов полностью подчиняется грандиозным геофизическим часам, чей моделью они являются. Но все же внутренние часы «тикают» и оказывают свою важную роль в нашей повседневной жизни. Давайте же рассмотрим те редкие ситуации, когда удается расслышать независимое, самостоятельное биение биологических часов.

В Баварии был произведен эксперимент в условиях изоляции от времени. В самом начале месячного эксперимента, поведение испытуемого изучается при обычном 24-часовом режиме освещения: каждый раз вечер в 23 часа свет выключался, а утром в 7 включался в соответствие с распорядком, принятым
«снаружи». Испытуемый не имеет возможности контролировать освещение, за исключением ночника, но настолько тусклого, что он в счет не идет.
Регистрируемые показатели обнаружили ритмическое колебание с периодом 24 часа; цикл сон-бодрствование – один из многих, лишь наиболее бросающийся в глаза.

Доверим теперь контроль освещения в изолированном помещение самому испытываемому. Обычно его (или ее) ритм температуры тела и чередование сна – бодрствование в таких условиях сохраняется, но начинается запаздовать ежедневно примерно на час. Сдвиг будет 24 часа каждые 25 внешних дней, то есть каждые 24 внутренних дня. Если газета продолжает поступать к испытуемому «раз в день» — когда он спит, то примерно через 25 внешних дней настанет время, когда сегодняшняя газета придет в лабораторию раньше, чем живущему в изоляции от времени будет передана вчерашняя.

Некоторые люди в ходе экспериментов, переключаются на 25 часовой цикл, показывают удивительные результаты: человек в условиях изоляции от времени обычно уже через неделю переключаются с 25-часового периода (примерно
8часов сна и 17 часов бодрствования) на периоды вдвое корче, либо, вдвое длиннее. Водном из первых экспериментов средняя продолжительность ночного сна без пробуждения составляла 19 часов. Подобная картина встревожила исследователей: столь долгий сон у здорового человека представлялся ненормальным. Но испытуемые сочли такие марафонские дистанции сна и бодрствования вполне удобными и даже не замечали, что сон порой длится всего 4 часа, а иной рас и 18 часов, а рабочий день мог продолжаться 30 часов без перерыва. Вовремя замысловатых сочетаний, интервалов активности- покоя ритм температуры тела строго выдерживает 25-часовой период. Юрген
Ашофф директор Института физеалогие поведения имени Макса Планка в Андексе первым описал этот внутренний температурный ритм, тем самым доказав строгую регулярность циркадианных биологических часов у человека даже в условиях, когда иные проявления жизнедеятельности этим часам не подчиняются. Ашофф обнаружил, что на протяжении особенно длинных циклов активности-покоя температура тела может подниматься и спадать дважды. При таких примерно 50- часовых «сутков» испытуемый по – прежнему к каждому завтраку получает очередную газету, сохраняет трех разовый режим питания (правда, за каждый раз съедает немного больше обычного, но все же постепенно несколько теряет в весе) и не замечает ничего особенного. Трудно описать удивление и недоверие испытуемого, когда после двух или трех недель изоляции, к нему входит исследователь и возвещает окончание условно месячного эксперимента.
Убедить испытуемого может лишь пачка уже полученных (будущих) газет.

11
Более продолжительные записи спонтанного чередования активности-покоя были получены в эксперименте с сусликами и хомячками, которых годами содержали в одиночном заключении, в изоляции от всех сигналов времени. У этих животных внутренние часы, по-видимому, более надежно синхронизируют сон и бодрствование, чем у нас с вами. Тем не менее и у них обнаружилось неуклонное изменение циркадианного периода, за несколько лет достигшее всего несколько ми нут. Некоторые намеки на такую закономерность получены и для человека. Рекорд пребывания в условиях временной и социальной изоляции составляет на сегодня около шести месяцев. Впрочем, возможно, нам просто не известны более длительные и, скажем, более эффективные, но не зарегистрированные эксперименты, проводившиеся в мрачных подземельях средневековых замков.
СВОБОДНЫЙ ХОД И ЗАХВАТЫВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЧАСОВ
Биологические часы с периодом 25 часов, присущи нам, равно как и другим приматам, был по-настоящему открыт лишь 20 лет назад, но не у человека, а у слепой беличьей обезьяны, жившей в лаборатории Курта Рихтера в
Медицинской школе при Университете им. Джона Хопкинса. Обезьянка свободно бродила по лаборатории и подвергалась действию всех ежедневных периодических факторов, за исключением света. Она чередовала сон и бодрствование, как и сам Рихтер, но с иным периодом. Слепая обезьянка доказала, что обладает собственными внутренними часами, которым она следовала столь же неуклонно, как люди следуют суточному циклу вращающейся планеты. Каждый месяц в течение нескольких дней время активности обезьянки совпадало с рабочим днем экспериментаторов, но всякий раз постепенно появлялось накопление сдвига: обезьянка становилась «совой», с точки зрения человека, — впрочем, с ее «точки зрения», люди становились бы
«жаворонками». Через две недели распорядок дня обезьянки запаздывал настолько, что ее завтрак приходился на поздний вечер и ночь: наша «сова» превращалась в «жаворонка». Еще через неделю ее режим дня снова становился как у людей. Этот цикл повторялся примерно каждый месяц на протяжении нескольких лет. Обезьянка придерживалась своего внутреннего течения времени, независимого от периодики Солнца, Луны и людей в лаборатории.
Эта независимость от внешнего времени была обнаружена также в поведение некоторых слепых людей. Молодой человек в детстве лишился зрения. В студенческие годы он мучался, безуспешно пытаясь преодолеть хроническую бессонницу и дневную сонливость. Примечательно, что этот недуг преследовал его по 2 – 3 недели кряду каждый месяц. Молодой человек вел дневник, оказавшийся очень кстати, когда он, в конце концов, обратился за помощью к врачу. Реймонд Майлз с коллегами заметили, что время дневной сонливости студента ежедневно запаздывает на час, пока не сливается с ночным сном.
Спустя неделю сонливость вновь появляется, но уже утром, а ночной сон одновременно нарушается бессонницей. Этот цикл повторяется приблизительно каждые 25 дней.

Врачи предложили ему отказаться от бесплодной борьбы за соблюдением
24-часового режима. Они посоветовали ему спать тогда, когда он действительно хочет спать, и оберегать его сон от всяких беспокойств в условиях больничного стационара. Впервые за многие годы его ежедневный уклад жизни стал регулярным: весь день – бодрость, ночь – непрерывный сон.
Однако его «день» и «ночь» более не совпадали с астрономическими – студент перешел на 25-часовой ритм.

Когда же он вернулся на месяц к обычной жизни, его сон вновь оказался, разбит на куски, несмотря на его героические усилия, применения кофеина и снотворных. Но теперь уже было ясно, что его дневная сонливость оказалась замаскированной продолжением внутреннего 25-часового ритма. Подобным недугом страдает около полвины слепых людей.

Биологическим ритмом с периодом 25 часов обладают не только слепые, но и совершенно здоровые, зрячие люди. Хотя естественный ход их внутренних часов ежедневно отстает на час, в норме они согласованны с 24-часовым циклом чередования дня и ночи и им удается «идти в ногу с ним». Тем не менее, многие слепые, да и некоторые зрячие люди лишены этой способности

12 ежедневно на час подстраивать свои внутренние часы, не могут поддерживать синхронность с вращением Земли и ритмом жизни их окружения.

У людей с нормальным зрением, живущих в условиях ежедневного чередования света и темноты, такие случаи исключение. Но, когда человек умышленно покидает белый свет, скажем, спускаясь в вечную тишину подземной пещеры или просто затворяясь в комнате без окон, его ритм сна- бодрствования практически всегда возвращается к своему естественному периоду около 25часов. Очевидно, и природа, и общество постоянно торопят нас: чтобы не отстать от 24-часового мира, мы вынуждены спешить, каждый день, опережая себя на час.

У человека переход к внутренней системе отсчета времени менее очевиден, чем у других млекопитающих, быть может, потому, что наша сознательная жизнь слабее связанна с физиологическими процессами. Порой достаточно небольшого толчка, чтобы вывести ритм сна или какого-либо другого отдельного показателя из-под влияния мощной волны биологических приливов и отливов. Тем не мение наши внутренние часы надежно определяют общую картину распределения сна и гарантируют, что примерно раз за один оборот планеты вокруг оси мы будем спать (или отчаянно хотеть спать).
Более того, если бы человек уснул, внутренние часы обеспечивают спонтанное пробуждение в определенной фазе цикадного цикла, которая зависит от фазы засыпания.
АВТОМАТИЧЕСКАЯ УСТАНОВКА ВНУТРЕННЕГО БУДИЛЬНИКА
В начале января 1969 года 23-летний Жак Шабер решился провести полгода «вне времени», в условиях, предельно изолированных от всех мыслимых сигналов времени: в пещере при температуре 6ос и 100% влажности, на глубине 65 метров, в районе Ниццы и Канн, на юге Франции. При взгляде на растр его сна создается впечатление аритмии: в отсутствие 24-часового периодического стимула видимая регулярность сна-бодрствования нарушается. Без внешних часов, задающих время ложится, и вставать, длительность сна и бодрствования как будто меняется случайно. Так ли это на самом деле или у нас просто нет ключа для расшифровки возможной закономерности?

Будем исходить из того, что у человека есть цикадные часы. Каково бы ни был их неизвестный период, часы продолжают тикать, неустанно отсчитывая время, несмотря на то, что их владелец подвергаемый охлаждению или перегреву, переходит из темноты к свету, от возбуждения к унынию, получает хорошие или плохие известия, когда ему вздумается. Если эти циркадианные часы в какой-то мере определяют время его непроизвольного пробуждения, то длительность сна должна закономерно зависеть от той точки внутреннего цикла
(фазы), в которой он уснул.

Прежде всего, нам надо приписать значение фазы каждому часу, когда сон начинался или кончался на протяжении всех 127 суток «изоляции от времени».
К сожалению, сама фаза – величена ненаблюдаемая, за исключением того, что ее косвенным показателем можно считать температуру тела. Но одно свойство этих внутренних «главных часов» дополнительно известно: они идут на удивление точно.

Если мы правильно выведем периодичность часов, то можно предсказать время засыпания и время пробуждения. Эта предсказуемость обнаруживает ритмическую организацию, скрытую в узоре несинхронезированных циклов сна- бодрствования

Можно было бы ожидать зависимость продолжительности засыпания, если бы мы, например, чаще всего просыпались в определенной фазе циркадианного цикла или, уснув позже обычного, просыпались соответственно позже и, наоборот, уснув раньше – просыпались раньше. На самом деле, однако, ни одна из этих зависимостей не следует из данных эксперимента. Общепринятое представление о том, что восстановительная функция сна пропорциональна его деятельность, не подтверждается результатами исследования сна, по крайне мере столь продолжительного, каким мы имеем обыкновение наслаждаться по ночам.

13

Первые, еще не вполне ясные сведения об этой закономерности сна собраны при исследовании отдыха железнодорожных машинистов: оказалось, что продолжительность дремоты и эффектные попытки уснуть всегда зависят от времени суток. Спустя несколько лет Чарльз Сайслер и Эллиот Вайцман стали анализировать «пещерные» записи Шабера, просто предполагая существования внутренних часов, и попытались угадать период путем сведения к минимуму вариаций длительности сна в каждой фазе. Полученный таким образом
«магический» период оказался в области от 24 до 25 часов и совпал с периодом ритма температуры тела.

Время засыпания и пробуждения находится в определенной зависимости и напоминает перископ подводной лодки. Неизвестно когда ион впервые покажется над водой? Если всплытие почти вертикально или если волны очень пологие, прорыв на поверхность может, случится в любой точке волны. Но если траектория всплытия имеет большой наклон или если волны достаточно крутые, то прорыв никогда не произойдет на восходящем склоне волны.

Но если волны будут круче – настолько, что вода будет вздыматься быстрее, чем подлодка – то, в этом случае восходящая часть волны оказывается совершенно не доступной для появления из-под нее. На сто пробных всплытиях все случаи протыкания поверхности воды соберутся в кучки, разделенный совершенно пустыми интервалами, где волна поднималась круче, чем путь подлодки.

Полная длинна волны, от одного пика до другого, соответствует длительности одного цикла циркаднианных часов. Волна соответствует какому- то ритму в человеческом мозге (никто пока не знает, какому именно), что, подобно температуре тела и десятку других физиологических показателей, плавно поднимается и опускается в такт с циркадианным циклом. Это «нечто» задает тот порог, переступая через который, спящий (в данном случае всплывающая подлодка) просыпается. Разные участки волны соответствуют изменения уровня порога пробуждения в разных фазах циркадианного цикла.
Эта модель показывает существование «запретных» фаз – фаз, при которых перископ никогда не сможет совершить прорыв.
Сотня подводных лодок, всплывающих одна за другой, будут показываться на поверхности не в виде непрерывной последовательности, а компактными группами, повторяющимися с периодом волны, словно волны, открывают и закрывают ворота, – разумеется, если эти волны достаточно круты по сравнению с траекторией всплытия подводной лодке. Слабые ритмические воздействия, то есть более пологие волны, только модулируют последовательные прорывы перископов, не собирая их в дискретные кучи. Есть такая критическая крутизна волн, сверх которой часть цикла становится строго запретной, как будто временно закрываются непроницаемые ворота.

Подобному принципу, видимо подчиняется время спонтанного пробуждения у мужчин и женщин. На протяжение суточного цикла нашего сознание переживает приливы и отливы. Пробуждение от сна, видимо наступает, когда что-то в мозге, постепенно изменяется на протяжение сна, достигает порогового уровня, который в свою очередь, как и все внутри нас, колеблется с циркадианным периодом. Если это что-то начинает плавно меняется в определенной фазе (в момент засыпания), оно достигает порога в более поздней, заранее предсказуемой фазе, – и вы проснетесь. Продолжительность вашего сна может меняется в довольно широких пределах в зависимости от времени засыпания. Она составляет в среднем 8 часов только потому, что люди обычно ложатся спать примерно в одной и той же определенной фазе своего циркадианного цикла. Если ваш циркадианный ритм имеет большую амплитуду, ваш сон может оказаться коротким (всего 4 часа) или длинным (целых 18 часов), смотря по тому, в какой части вы стартуете. можно переключится с самого короткого на самый длинный сон, отсрочив момент засыпания настолько, чтобы опоздать к минуемому ритма изменения порога пробуждения.
Следовательно, внутри циркадианного цикла есть отрезок шириной в несколько часов, в котором вы практически наверняка не проснетесь сами по себе. Если по какой-либо причине ваш организм не зависит так от фазы (ритм порога пробуждения у вас более пологий), то длительность сна может определятся не столько временем суток, сколько иными факторами – скажем, усталостью. В этом случае по мере запаздывания

14 засыпание продолжительность сна несколько сокращается, а далее, при еще большем запаздывание, понемногу возрастать: никаких разрывов плавной кривой, никаких запретных для пробуждения зон. Такое состояние возможно в результате длительного пребывания в условиях полярного дня (у эскимосов, живущих летом под открытым небом, ритмы сильно сглаживаются) или после трансмеридианного перелета (который временно сбивает и ослабляет циркадианные колебания).

Время окончание сна и начала бодрствования – это всего лишь полдела. А вот как насчет времени окончания бодрствования и начала сна? Возможно, циркадианные закономерности имеют отношение и к этой, второй стороне вопрос, но несколько иначе: время сна и время бодрствования существенно различаются. В циркадианном цикле существует одна широкая зона, где спонтанное пробуждение практически запрещено, лишь узкий диапазон – на самом деле два диапазона, относящихся друг от друга примерно на 12 часов,
— где засыпание хотя и не запрещено по-настоящему, но происходит сравнительно редко. К тому же график, связывающий фазу пробуждения с длительностью последующего бодрствования, выглядит как снежная метель.
Разброс точек огромен, но положение еще хуже: через облако точек невозможно провести какую-либо определенную кривую, потому что в запретной для пробуждения зоне их крайне мало, а то и вовсе нет.

Обнаружена только обратная зависимость: длительность бодрствования, предшествовавшего данному засыпанию, удлиняется примерно на час для каждого часа отсрочки начала сна. После некоторой определенной фазы засыпания длительность предшествовавшего бодрствования совершает резкие скачок, так как при этом фаза предыдущего пробуждения избегает запретную зону. Таким образом, обнаружена обратная зависимость, но не для последующего пробуждения. Однако при этом точки разбросаны вдвое шире, чем для предсказуемой фазы рассмотренной ранее закономерности последующего пробуждения. Сон имеет тенденцию начинаться вблизи минимума температуры тела, – но только эта одна слабая статическая закономерность связывает его с циркадианным циклом. Вероятно, у человека волевой контроль в большей степени распространяется на окончание бодрствования, чем на окончание сна, поэтому время засыпания зависит от многих факторов, а не только от циркадианнных часов.

Вся наша повседневная жизнь строго укладывается в 24-часовые рамки, в том числе и интенсивность физиологических функций, колеблется в соответствие с наиболее заметным циклом чередования сна-бодрствования.
Этот факт имеет совершенно очевидные практические следствия, но для их внедрения в клинику десятилетия. Пример, лежащий на поверхности: ежедневное повышение и снижение порога чувствительности наших зубов.
Расположение их колебания во времени таков, что идти на прием к дантисту лучше после обеда, а в случае, если вы, скажем, только что прилетели из
Японии в Чикаго, в дневные часы лучше вообще отказаться от его услуг.
Эффективность обезболивания максимальна тоже после полудня: доза наркоза, необходимая утром, днем может оказаться избыточной. Аллергические реакции возникают быстрее и проявляются тяжелее в начале ночи, чем в полдень.
Печень удерживает низкий уровень алкоголя в крови вечером гораздо лучше, чем утром.

Поставим диагноз значительно проще, если рассматривать клиническую норму с учетом ее ритмичности. Скажем, нормальная температура тела ночью ниже 36,6 ос, поэтому «нормальное» показание термометра в 3 часа ночи – симптом лихорадки. Аддисова болезнь (бронзовая болезнь) и болезнь Иценко –
Кушинга обусловлена нарушением функции надпочечников (соответственно недостаточности и избыточностью), поэтому для их диагностики требуется измерять уровень гормона кортизола (гидрокортизола) в крови. Теперь уже общепризнанно, что проба на кортизол без учета времени забора крови обессмыслена.

Не только диагноз, но и терапевтические меры могут быть более эффективными, если их строить на основе циркадианного цикла. Поскольку многие типы делящихся клеток предпочитают

15 определенное время суток для репликации ДНК, циркадианные вариации особенно ярко проявляются в токсичности различных лекарственных препаратов и эффектах облучения, применяемого с целью поразить делящиеся опухолевые клетки. Нет ничего особенного в том, что доза, при которой 80% популяции подопытных организмов выживет в одно и тоже время суток, в другое окажется смертельным для тех же 80% осыбей. Эта мрачная статистика, однако, весьма перспективная, если стоит задача избирательно убить опухолевые клетки, не повредить здоровые. Эрхад Хаус с коллегами добился значительного повышения процента вживания среди мышей, больных раком, не увеличивая дозы лекарства, но сконцентрировал ее в то время суток, когда опухолевые клетки предположительно более чувствительны, чем нормальные.

Врачи и ветеринары, применяющие гормональную терапию, давно знают, насколько важно правильно выбрать время для введения препарата. Например, при недостаточной функции надпочечников больным обычно делают инъекцию кортизона по утрам, когда в норме активность коры надпочечников максимальна. Если ежедневно требуема только однократная доза препарата, утренние инъекции годится и для собак, но для кошек, у которых циркадианные ритмы организованны по-другому, кортизон следует вводить по вечерам.
Введение кортизона в иное время суток будет подавлять деятельность и без того ослабленных надпочечников, и пациент, в конце концов, станет жертвой хронического недуга – Аддисоновой болезни.

Ритмические закономерности связывают секрецию гормонов мозга, нарушение сна и более серьезные психические заболевания, включая клиническую депрессию. Томас Веер, Фредерик Гудвин и Норман Розенталь из
Национального института здоровья в Бетесде и Даниел Крипке из Госпиталя управления ветеринаров в Сан-Диего предположили, что эти прежде неизлечимые болезни часто являются вторичным следствием расстройства циркадианных ритмов. Уже показано, что некоторые виды депрессии поддаются лечению солнечным светом или его искусственным заменителем, поддаваемым в нужное время суток.

Считается, что действие света опосредовано его влиянием на секрецию мелатонина – гормона, выделяемого в головном мозге и тесно связанного с циркадианными ритмами. Для нормального ежедневного контроля секреции мелатонина нужен свет, существенно более яркий, чем тот, который обычно бывает в помещениях. Однако современный человек редко должным образом
«засвечивает» себя, причем время пребывания на свету у разных людей весьма различается. Остается только гадать, насколько могут быть распространены расстройства циркадианных ритмов.
ПОДСТРОЙКА БИОЛОГИЧЕСКИХ ЧАСОВ

Часы слишком хороши, если вы не имеете возможность их подстраивать.
Некорректируемые биологические часы были бы совершенно бесполезны, если бы их период не был в точности равен периоду вращения Земли. И все же, даже если бы часы были устойчивы к температурным подскокам в случае лихорадки, холодной или жаркой погоды, не реагировали на гормональные и эмоциональные расстройства, некоторое различие между внутренним и внешним периодом было бы не исбежно. Очевидно, для поддержание синхронности недостаточно просто близости периодов. Для этого нужно ритмический сигналов, механизм ежедневного согласия и подстройки. Основа целесообразности любых биологических часов именно в такой подстройке фазы, в способности по сигналу перепрыгивать из одной временной зоны в другую и таким образом сохранять правильную фазу, не перемещаясь в пространстве, несмотря на неизбежное не совпадение периодов.
Этот процесс называется захватыванием ритма. Один ритм может быть захвачен другим ритмом с иным периодом по средствам регулярного повторяющегося сигнала. Для циркадианных ритмов обычным, естественным сигналом является свет. Под воздействием света внутренние часы немного отстают или, наоборот, уходят вперед. Существуют и другие свойства настройки биологических часов, но подавляющие большинство живых существ приспособились к тому событию, которое надежнее всего повторяется каждый день, — к чередованию света и темноты – и выработали наибольшую чувствительность своих циркадианных часов именно к этому фактору.

16

Общая закономерность, – ведущая роль света как сигнала времени – оспаривалась только в отношение человека, частично потому, что люди, как и большинство других организмов, иногда в отсутствие регулярного цикла освещения используют для ориентации другие органы чувств. Но главная причина, заставившая усомнится в роли света для человека, состояла в том, что «дневной свет», использовавшийся в первых лабораторных экспериментах по изучению изоляции от времени, оказался не столь эффективным для захватывания циркадианных ритмов человека по сравнению со светом такой же интенсивности для ритмов других животных. Следует ли из этого заключить, что часы человека уникально безразличны к действию света? Отнюдь, скорее это говорит о том, что комнатный свет слишком слаб для биологических часов человека, чтобы приравнивать его к дневному.

Есть всякие основания предполагать, что ведущие циркадианнае часы у человека находятся в мозге и прямо связанны с глазами эпифизом (шишковидной железой). Альфред Леви с коллегами из Национального института здоровья в
Бетесде установили, что свет подавляет секрецию мелатонина в эпифизе у человека, как и у других млекопитающих, но для горожан нужно на удивление много света, больше, чем бывает в помещении: для эпифиза у человека комнатный (электрический) свет – все равно, что ночь. Однако даже рассеянный свет с улицы сразу подавляет секрецию мелтонина. Этот гормон головного мозга имеет прямое отношение ко сну и к циркадианным часам.
Например, у грызунов ежедневно инъекции мелатонина могут захватить и синхронизировать часы. Если окажется, что у человека мелатонин опосредует сдвиг фазы циркадианных часов, то данные Льюи будут представлять интерес для антропологов, специалистов по дизайну, для тех, кто работает в разные смены и совершает трансмеридианные перелеты. Пока лекарство для сдвига фазы будет создано и получит одобрение минздрава, для путешественников приятным средством может быть пребывание на солнцепеке. Разумеется, солнечный свет не менее важен и для тех, кто никуда не ездит, но нуждается в ежедневной синхронизации своих внутренних ритмов. Неудача такой синхронизации может привести к сонливости в дневное время и бессоннице ночью — достаточно распространенным расстройством сна. В этой связи могут представлять интерес данные Даниэля Крипке с соавторами, которые исследовали количество, и распределение во времени света, падающего на среднего нормального человека в течение среднего дня. Оказалось, что даже на юге солнечной Калифорнии количество света столь мало и распределенною столь нерегулярно, что остается лишь диву даваться, каким образом современному человеку удается (и удается ли?) поддерживать свои циркадианные ритмы поддерживать в должном порядке.

Спонтанные циркадианные ритмы обнаружены едва ли не у каждого вида живых существ. Возможно, исключение составляют обитатели морских глубин и подземных пещер, а также прокариоты (бактерии и сине-зеленные водоросли, клетки которых не имеют ядра и митохондрий). Циркадианные колебания обычно наблюдаются у более высокоорганизованных одноклеточных организмов и у изолированных тканях многоклеточных организмов. Тем не менее, и у позвоночных, и у беспозвоночных животных часть нервной системы обычно играет роль циркадианного ритмоводителя для всего организма. Мишель Менакер с сотрудниками показал, что у некоторых птиц (не у всех) эту функцию выполняет эпифиз, ритмично выделяющий в мозге гормон мелатонин.
Деятельность эпифиза регулируется светом, проникающим сквозь темную часть черепа. У воробья даже удается сдвинуть фазу циркадианного ритма, пересадив ему эпифиз птицы, живущей в иной временной зоне.

У грызунов эпифиз выделяет мелатонин тоже ритмично, но под контролем скопление нейросекреторных клеток – супрахиазменных ядер, расположенных слева и справа в гипоталамусе, над перекрестием зрительного нерва. Эти парные часы получают информацию о свете и темноте от глаз. Ежедневные порции мелатонина в свою очередь синхронизируют циркадианные колебания. У обезьян подобную роль играют супрахиазменные ядра. Люди – пациенты с травмами в этой области гипоталамуса – страдают расстройствам ритма, что позволяет предпологатьсходную роль

17 супрахиазменных ядер и у человека. Фазу ритмов этих ядер можно сдвинуть светом через зрение, электрическим раздражителем, инъекцией в мозг аналога нейромедиаторов, вызывающих нормальные разряды нейронов, а также мелатонином. Покрайне мере у грызунов удаление эпифиза позволяет позволяет супрахиазменным ядрам быстрее приспосабливаться к новым временным зонам.
Быть может, панацеей от десинхроноза, вызываемого трансмеридианным перелетом, окажется какой-нибудь препарат, подавляющий функцию эпифиза на то время, пока мы приспосабливаемся к чужому распорядку дня.

Секреция эпифизом мелатонина стимулируется психомиметиками – такими препаратами, как ЛСД, мескалин и кокаин, — и подавляется препаратами, используемыми для лечения психозов. Недавно выяснилось, что бензодиазепин, широко применяемый антидепрессант, подстраивает фазу циркадианных часов у грызунов, возможно, действуя на нейромедиаторы в супрахиазменных ядрах гипоталамуса. Это указывает на некоторую связь между психическими заболеваниями и расстройствами циркадианных ритмов, особенно между депрессией и нарушением сна.

Любопытно, что человеку для подавление секреции мелатонина требуема гораздо больше света, чем другим млекопитающим. Интересно, разделяют ли домашние собаки со своими хозяевами эту странную не чувствительность к свету? Быть может, это последствие комнатного освещения в ночное время на протяжение жизни тысячи поколений? Если бы циркадианные ритмы человека реагировали на тусклое освещение (что, кстати, наблюдается у лабораторных грызунов), они должны были бы быть в постоянном разладе, и люди, помимо других проблем, постоянно испытывали бы дополнительный стресс. Индивидуумы, менее чувствительны к свету, могли страдать от этого, их репродуктивная система в меньшей степени была бы подвержена стрессу, стал быть, они имели бы большой успех при размножение. Что, если человек и его домашние животные испытывали давление естественного отборов на нечувствительность к тусклому свету? И если так, то значительно большая чувствительность могла сохраниться и у людей, живущих доныне в каменном веке: у тасадеев с филиппинских островов Минаданно, у маори и у жителей Огненной Земли, предки которых меньше подвергались действию ночного освещения – гипотического нарушителя циркадианных ритмов. Будет ли эта врожденная, генетически наследуемая чувствительность безвозвратно утрачена еще до конца нашего века?

Если синхронность циркадианных ритмов действительно поддерживается путем ежедневной экспозиции при дневном освещение, то интересно, каким образом это достигается? И что даст исследование этого процесса для понимания природы внутренних часов?

Модно поставить несложный опыт с фоточувствительным организмом, циркадианный ритм которого остается четким и устойчивым, если нет никаких сигналов времени. Удобный биологический объект для этого – комар. Как и большинство других животных, комары обладают выраженным циркадианным ритмом активности-покоя, сохраняющемся даже в замкнутом помещение при постоянной темноте и неизменной температуре – в этом случае его период составляет около 23 часов. В таких условиях активность комара регистрируется по звуку его полета. Специальные приборы позволяют подсчитывать за каждый час число минутных интервалов, когда слышится занудный писк. В камере с комарами этот писк постепенно нарастает и перед рассветом достигает крещендо, переходя в тонкий протяжный вой, затем смолкает – и вновь усиливается перед закатом
(или, точнее говоря, когда комары чувствуют приближение утренних или вечерних сумерек). У девственных самок кровососущего комара Cuiex pipiens quinquefasciatus, которыми занимались Эрик Петерсон, более четко выражен вечерний пик летней активности, и именно он выбран за нуль фазы в циркадианном цикле насекомого.

Что может быть сигналом времени для комара? Чтобы не запутывать эксперимент, сигнал следует давать один раз в течение определенного периода времени. Петерсон использовал белый свет, по интенсивности соизмеримый с естественным дневным. Комары находились в постоянной темноте, и только один раз за весь эксперимент был дан яркий свет. В разных камерах этот световой

18 импульс приходился на разную фазу циркадианного цикла, и в каждой камере наблюдали, что ритм активности комаров возобновлялся, но с подстроенной фазой. В настоящем опыте ритм после воздействия стимула некоторое время может быть искаженным даже подавленным, но, в конце концов, возвращается к норме.

Подстройку фазы можно считать сдвигом в сторону опережения или задержки. Опыт не позволяет сделать выбор в пользу одного из этих двух вариантов итерпритации процесса, происходящего внутри часов. Возможно, этот процесс вовсе не поддается описанию в терминах опережения или задержки. Дабы избежать допущения о ненаблюдаемом, принято говорить о подстройке фазы как о переходе от старой фазы – фазы ритма, на которую пришлось начало стимула, — к новой фазе – фазе сдвинутого ритма, экстраполированной назад, к моменту окончания стимула. (В этом случае, если стимул постепенно ослабевает и сходит на нет, за его конец принимают точку, относящуюся от начала на один период цикла.)

Поскольку известно, что циркадианные часы поддаются захватыванию, следует ожидать, что величена сдвига фазы при подстройке зависит от старой фазы: ведь стимул, вызывающий один и тот же эффект в любое время, не может быть полезным сигналом времени. Какова же зависимость новой фазы от старой?
Если бы стимул не вызывал никакого эффекта новая фаза была бы равна старой
(плюс положительного стимула – но она постоянна). Между тем, данный стимул оказывал некоторое сигнальное воздействие на биологические часы, то есть ход часов был замедлен (или, возможно, ускорен).

Каким образом происходит подстройка фазы? Результат подстройки, не вдаваясь в сам процесс, можно описать – к счастью, ибо до сих пор никто не знает механизм ни одних циркадианных часов. Сущность принципа подстройки состоит в том, что любой сигнал времени (например, 14 часов дневного света) по-разному действует на ход внутренних часов, в зависимости от того, когда именно в цикле часов этот сигнал начался. В первом приближении конечный результат действия сигнал времени можно рассматривать просто как сдвиг фазы внутренних часов: если бы эффект не был по происшествие периода после начала сигнала, часы вернулись бы к исходной, «старой» фазе, однако на деле они оказываются в другой, «новой фазе». В данном случае часы подстройки ничем не отличаются от невозмущенных (интактных) часов, которые еще период назад, в момент окончание сигнала, уже находились в новой фазе. Поэтому конечный результат подстройки для возмущенных часов таков, как будто сигнал мгновенно сдвинул фазу часов из старого положения в новое. В характере зависимости новой фазы от старой таится многое. Кривые такой зависимости были неоднократно описаны в специальной литературе, но под разными названиями. В реферате будет использоваться сокращенное название термина
«кривая подстройка фазы», или сокращенно, КПФ.

Трудно переоценить важность получения КПФ для человека. Знание КПФ имеют решающие значение для разработки мер профилактики десинхроноза, возникающего из-за «перепада времени» – после трансмеридианных перелетов, при сменной работе, а также, возможно, при периодической серьезной депрессии, бессоннице и слабости в дневное время. Регулярное пребывание на дневном свету в строго определенное время суток может порой стать щадящей заменой кофеина, снотворных таблеток и антипрессантов. В настоящее время проводятся широко масштабные эксперименты по изменению КПФ человека. Они должны открыть возможности повышения эффективности захватывания циркадианных ритмов человека ежедневным циклом света-темноты.

Если сигнал времени (дневной свет) повторяется регулярно, всякий раз, подстраивая часы в соответствии с КПФ, и если к тому же сама КПФ все время остается неизменной, то последствия (результирующую фазу) можно предсказать с математической точностью. Результаты захватывания хорошо объяснимы и вполне согласуются с данными экспериментов. Регулярное периодическое повторения воздействия одним и тем же стимулом может привести к вечному хаотическому блужданию фазы; либо к стабильному захватыванию, кода всякий раз к началу

19

воздействия часы приходят в одну и туже фазу: либо к ситуации, когда к началу сигнала часы приходят то в одну то в другую фазу – через раз: либо тоже самое, но с повторением каждые 4 или 5 периодов и т. д. Все зависит от соотношения собственного периода часов и периода стимуляции, а также, разумеется, от силы и характера стимула и от устройства часов. Для таких часов, которые сразу после воздействия стимула возвращаются к своему циклу (лишь со сдвигом фазы), чтобы предсказать результат, достаточно знать КПФ.

Какие формы может принимать КПФ? Начнем с буквальной модели часов, к часовой стрелке механических часов подвешен груз, который тянет стрелку вниз, а за ней изменяет скорость хода и весь механизм часов. Представьте себе, что циферблат часов рассчитан на 24часа, а не на 12, как обычно.
Тогда в 0 и 12 часов груз не будет влиять на скорость движения стрелки, но в 6 часов он может его ускорить, а 18 – напротив, замедлить. Если снять груз, часы будут показывать не то время, что с грузом. Что же именно будут показывать часы? Это зависит от веса груза и от того, как долго он будет висеть и в каком часу его подвесят? То есть кратковременное приложение груза в 6 часов вызовет некоторое опережение фазы, а в 18 часов – небольшую задержку.

Циркадианные часы похожи на механические в трех отношениях: их период после возмущения быстро возвращается к норме, соответствующим образом подобранный стимул может заставить их отклониться от диагональной линии « новая фаза «, и величина этого отклонения плавно зависит от времени воздействия.

Однако циркадианные часы фундаментально отличаются от модели: их КПФ не всегда является простым изгибом диагонали. Это свойство циркадианных часов было открыто совсем недавно, и из него вытекают удивительные следствия. Их КПФ легче представить в виде » бублика» или тора.
Какого рода кривые могут разместиться на торе? Если КПФ для каждого значения старой фазы дает единственное значение новой, то кривая должна быть замкнута в кольцо: за один оборот старой фазы новая фаза, непрерывно изменяясь в одном направлении, вернется к своему исходному значению, замкнув собственный цикл. Если новая фаза = старая фаза, то КПФ пройдет по диагонали нашей координатной сетки, начиная с точки пересечения двух координатных осей, пересечет экватор, при этом, совершая один виток и проходя через центральное отверстие, и вернется к исходной точке, замыкая кольцо. Такой тип подстройки характерен для любых биологических часов при очень слабом стимуле.

Теперь рассмотрим ситуацию, когда фазы оказывают несколько большее воздействие чуть более сильный стимул – КПФ изменится ненамного.
Применительно к модели часов, даже если эффект от стимула не мал, КПФ остается качественно той же: по-прежнему она замкнута в кольцо, один раз проходящее через отверстие тора. Это – единственный тип кривой, свойственный любым часам, которые называются простыми, которые могут лишь ускорять и замедлять свой ход, причем только в зависимости от внешних условий (силы воздействия) и собственной мгновенной (текущей) фазы. Такой тип подстройки часов называется подстройкой типа один, или нечетной подстройкой.

В придельном случае этого нового типа подстройки фазы достаточно сильный стимул независимого от времени воздействия возвращает систему всякий раз в одно и тоже состояние: новая фаза постоянна и не зависит от старой. Такой тип подстройки, представленный КПФ, которая вовсе не делает витков во круг тора, называется подстройкой типа 0, или четной подстройкой, потому что кольцо КПФ образует нуль (четное число) витков. Иногда его называют сильной подстройкой, поскольку он с необходимостью предполагает опережение и (или) задержки фазы, превышавшие по величине половину цикла.
Нечетная подстройка, как мы уже знаем, представлена КПФ, которая навивается на тор +1 раз. Иногда ее называют слабой подстройкой, потому что она получается при очень малых сдвигах фазы и всегда бывает при крайне слабых воздействиях. Однако важно именно число витков, а не величина смещения фазы. Последняя бывает обманчивой.

Вопросы о топологии КПФ впервые были поставлены (и решены) менее 20 лет назад. Как это часто бывает в науке, появление теории позволило признать, наконец, явление, которое давно уже

20 было описано, но как-то все не укладывалось в головах ученых, пока для него не были построены концептуальные рамки. Как и многие другие новые понятия в науке, четная подстройка фазы не воспринималась в течение десятилетия, несмотря на опубликование экспериментальных данных.

Первые сведения о четной подстройке фазы были получены на одноклеточной свободноплавающей водоросли – жгутиконосце Gonyaulax. Она бурого цвета от хлорофилла и сопутствующих пигментов, которые очень эффективно используют в течение дня солнечный свет. Ночью Gonyaulax занята совсем другим делом: размножается путем деления клетки пополам. По ночам она еще светится тусклым еле заметным голубым светом – до тех пор, пока клетки не подвергнутся механическому возбуждению. Если проплывающая мимо рыбка заденет клетки, они тут же ярко вспыхнут, и мы увидим тянущийся за рыбой мерцающий шлейф биолюминесценции. В лабораторных условиях, без всяких рыб, фотоумножитель показывает, что клетки все равно спонтанно светятся, причем особенно ярко, – когда по их внутренним часам ночь (при изоляции от обычного цикла света-темноты пик свечения наблюдается каждые 23 часа).

В эксперименте большое число одинаковых пробирок с водорослями содержались в условиях изоляции от времени. На каждую пробирку действовали импульсом яркого света – в разное время, при различных старых фазах циркадианного цикла клеток. Для разных пробирок, (по мере возрастания старой фазы) импульс приходит спустя все большее время после максимума свечения. Подстройка часов во время светового импульса происходит в каждой пробирке в зависимости от величины старой фазы. Последующие максимумы свечения наступают соответственно с опережением или опозданием. При старой фазе около 6 часов реакция клетки резко меняет знак: от значительной задержки фазы к еще большему опережению. Так проявляется критический момент в механизме циркадианной ритмичности.

Или, быть может, это лишь видимость критического момента. В самом деле, данные о задержках и опережениях фазы правильнее было бы назвать одним из вариантов объяснения данных. Рассмотрим другой вариант. Пики свечения можно соединить и непрерывной линией, изгибающейся вдоль диагонали, параллельной полосе световых импульсов, и другой кривой, лежащей на 23 часа ниже, и еще ниже и так далее – нет никакого разрыва. Непрерывные кривые изгибаются вдоль горизонтали, а не диагонали, и повторяются одна под другой с интервалом 23 часа. Новая фаза в момент окончания стимула (или спустя 23, 46, или 69 часов после этого) есть время, истекшее с момента предыдущего пика свечения. И здесь тоже нет разрыва. С таким же парадоксом мы сталкивались при пересечении линии смены дат.

Дело в том, что ни один из двух графиков не доказывает ни разрывность, ни непрерывность: на самом деле мы располагаем лишь горсткой эмпирических точек, и любая кривая, проведенная через них, есть не более чем линия интерпретации наблюдателя. Выбор непрерывной или разрывной кривой — дело вкуса.

Тем не менее, с годами накапливалось все больше данных, собранных в разных лабораториях на разных организмах, но при одинаковой схеме эксперимента. Все труднее стало рисовать правдоподобную разрывную кривую.
Непрерывность кривой теперь не вызывает сомнения. Тем не менее, следуя прокрустовой логике, непрерывную кривую обычно разрезают на два куска и вставляют между ними 24-часовой прыжок, не содержащий ни одной экспериментальной точки. Таким путем данные экспериментов обычно подгоняются под мнимый нечетный тип подстройки фазы пои сохранении видимости опережений и задержек фазы, разделенных точкой разрыва. После такой искусственной процедуры можно позволить себе порассуждать о генетическом, биохимическом и эволюционном значении столь резкого скачка фазы. Однако это умственное упражнение до сих пор оставалось бесплодным. К тому же считается простым совпадением то обстоятельство, что скачок фазы точно равен периоду ритма, а также то, что опережающая ветвь кривой, вверху у самого разрыва, имеет в точности тот же наклон, что и запаздывающая ветвь, внизу у самого разрыва.

21

Если этот прыжок фазы, не содержащий ни одной экспериментальной точки, оказывается артефактом, то его альтернатива – непрерывная кривая – приводит к еще более странному следствию.
СИНГУЛЯРНОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЧАСОВ

Для плавной подстройки фазы характерна КПФ, однозначная про любых значениях старой фазы: на поверхности тора эта кривая всегда имеет вид замкнутого кольца. У некоторых организмов она делает петлю, проходя через отверстие тора один раз (нечетная подстройка), у других она вообще не делает витков (четная подстройка). Может ли это быть основанием для классификации механизмов часов или механизмов действия стимулов?

Но, с другой стороны, каждый организм должен подстраивать фазу по нечетному типу, по крайне мере при очень слабых, очень коротко временных стимулах. В этом случае новая фаза = старая фаза (диагональная КПФ – прототип любой нечетной подстройки). Вряд ли нужно доказывать, что этот вывод из мысленного эксперимента прекрасно подтверждает на деле для любого организма. Справедливо ли обратное утверждение: можно ли организовать с исходно нечетным типом реакции заставить подстраиваться по четному типу, усилив стимул? Увеличив время действия света на комара с 7,5 минуты до 2 часов, мы получим кривую, которая меняет свою топологию с нечетной на четную. Шестикратное усилие стимула вызывает разительную перемену, однако эффект можно получить и меньшим изменением, переходя от самого продолжительного стимула, который все же еще вызывает нечетную подстройку, к ближайшему, более длительному – кратчайшему, способному вызвать четную реакцию.

Так одним ударом мы опровергли гипотезу о том, что топологически разные типы подстройки обусловлены различиями в механизме часов или в характере воздействия. Оказалось, что разнообразие типов подстройки свидетельствуют не о многообразии механизмов, как могло показаться, но, напротив, доказывает универсальность, стереотипность поведения! Но тогда перед нами новая загадка. Если подстраивать любые циркадианные часы, начиная с любой старой фазы, то зависимость новой фазы от величены стимула будет плавной. Однако невозможность плавно перейти от нечетного к четному типу подстройки, от закрученного кольца к незакрученному. Как можно изогнуть, деформировать кольцо, навивающееся на тор и проникающее сквозь его отверстие, чтобы это кольцо улеглось на одной стороне тора? Без ножниц никак этого не сделать. То же в природе. Например в случае с комаром, если величена стимула превышает некий критический порог, то КПФ резко меняет форму: прежде она проходит через все значение новой фазы, а теперь избегает целый ряд значений. Стало быть, существует какая-то «уязвимая» старая фаза, в которой при переходе стимулов критического порога новая фаза совершает прыжок.

Под прыжком подразумевается резкое, скачкообразное изменение, разрыв.
На самом деле это преувеличение: за исключением событий в молекулярной физике и квантовой механике, всякое изменение происходит непрерывно, даже если его непрерывность проявляется в очень сжатом масштабе времени.
Подлинный разрыв – конечный результат бесконечно малого изменения – не только редок, но и принципиально ненаблюдаемый: никогда нельзя с уверенностью утверждать, что причина, в самом деле, была меньше любой на перед заданной конечной величены. Между тем в отношение подстройки фазы вывод однозначен: новая фаза должна меняться на конечную величину при бесконечно малом изменения старой – это настоящий разрыв. Откуда такая уверенность? Да просто дело в том, что здесь не нужны точные измерения: это топологическая проблема. Кольцо, навитое на тор, надо переделать так, чтобы оно лежало на одной стороне тора. Это нельзя делать непрерывно. При критическое величине стимула кольцо придется в каком-то месте разрезать, разогнуть, вынуть из отверстия тора и снова воссоединить. Чистая топология без помощи эксперимента не может предсказать, что следует ожидать вблизи такой точки сингулярности (особой точки), — она может лишь указать направление поиска: там должно случится что-то особенное, исключительное с точки зрения физиологии, нечто большее, чем просто

22 подстройка старого ритма. В экспериментах двадцати летней давности на это уникальное «нечто» не было и намека. Лишь теперь тщательно спланировав эксперименты, в которых четко регистрируются смещение фазы, плавно зависящие от внешних условий, доказывают существование чего-то необычного, никогда прежде не виданного. Удивительная вещь: топология дает совет, как обнаружить точку сингулярности путем лабораторного опыта. Эта «схема ловушки сингулярности» позволила осуществить первые эксперименты с целью выявления сингулярности биологических часов.

На сегодня подавляющие большинство математических моделей биологических часов остаются непроверенными или непроверяемыми. К счастью, во многих вопросах без них можно спокойно обойтись: основные биологические свойства живых часов нетрудно получить путем логических рассуждений о подстройке фазы. Более того, эти рассуждения можно подкрепить простыми и наглядным фаз в виде цветных диаграмм. Такие диаграммы позволяют увидеть непосредственно, увидеть поразительные следствия, вытекающие из открытия подстройки четного типа, не прибегая к головоломным топологическим доказательствам.

Начнем с самого простого – с крайних, идеализированных случаев нечетной и четной подстройки. Пусть при нечетной новая фаза равна старой, а при нечетной новая фаза остается неизменной независимо от старой. Для удобства примем именно эту фазу за нулевую. Тогда при нулевой старой фазе любой стимул – и довольно сильный, и пренебрежимо слабый – оставит новую фазу тоже нулевой. Предположим, что она останется нулевой и при всех промежуточных величинах стимула.

Что можно сказать о стимулах некой промежуточной величены, действующие при других значениях старой фазы? По-видимому, разумно предполагать, что малые изменения величены стимула и времени его воздействия приведут к столь же малым изменениям новой фазы. Без этого постулата непрерывности вообще ничего сказать нельзя: поскольку стимул невозможно повторить с абсолютной точностью, ни один полученный результат ничего не дает для предсказанья исхода нового эксперимента.

При постоянности воздействия любого стимула и величены старой фазы в некоторой точке, при определенном сочетание величены стимула и значения старой фазы, получается неопределенность, хотя близлежащие точки вокруг нее представляют все разнообразие цветов радуги. Эта странная точка – точка сингулярности.

Эту точку можно сравнить с тем как временные зоны сливаются в географический плюс – точку, лежащую вне времени, а изохроны приливов на карте Мирового океана сливаются в амфидромные точки. Подстройка биологических часов означает перемещение их в другую временную зону. Здесь, как в случае с изохронами приливов, складывается замкнутый путь, вдоль которого каждая временная зона (фаза) встречается только однажды, в строгой последовательности. Значит, внутри этого контура непременно должна существовать точка в неопределенной зоне.

В топологии есть теорема об этой неустранимой, неизбежной неопределенности фазы, так называемая теорема о нестягиваемости. В ней рассматривается попытка стянуть все точки многообразия к его границам так, что бы они приняли окраску ближайших пограничных точек, при этом, однако, не нарушая связности множества (не делая в нем разрывов и не выкладывая отдельных точек), когда соседние цвета плавно переходят друг в друга. В теореме доказывается, что это не возможно: хотя бы одна точка должна оставаться неопределенной.

Стало быть, должно существовать уникальное сочетание величены стимула и времени воздействия, после которого не произойдет закономерной подстройки фазы. Что же случиться? Измениться вид ритма? Наступит аритмия? Полная неподвижность? Ответ на этот вопрос может дать только эксперимент.

Что же представляют собой данные биоритмологического эксперимента? Это не сами значения фаз, а времена событий, по которым нам предстоит вычислить фазы. Как на деле измеряется старая

23 фаза? Это доля цикла, прошедшая с его начала (обычно за начало цикла принимают какое-либо наблюдаемое дискретное событие вроде момента пробуждения) до воздействия стимула. Длительность цикла равна собственному периоду биологического ритма, скажем, 24 часам или около того. Чтобы измерить новую фазу, отмечают время с момента приложения стимула. Новая фаза – доля периода, истекшая от регистра следующего события от момента, наступившего через 1 период после стимула. Практически обычно новую фазу измеряют не через один период после стимула (когда организм, быть может, еще не оправился после возмущения, вызванного стимулом), а спустя нескольких периодов, когда колебания вернуться к норме, «устаканяться».
Кроме того, из соображений удобства интерпретации новую фазу принято измерять спустя несколько периодов после окончания, а не начала стимула – впрочем, это не сказывается на результатах. Ясно, что для коротко временных стимулов как «воздействие в течение одного полного цикла после включения фактора» (даже если в течение большей части этого промежутка фактор на самом деле был включен).

Если у нас есть выбор часов и набор стимулов, то результат каждого воздействия можно представить отдельно вдоль оси старых фаз. В этом случае график будет иметь вид двумерной решетки, повторяющийся периодически в обоих направлениях. По горизонтали период отражает ритмичность циркадианных часов до воздействия стимулов: неважно, действует ли стимул сейчас или спустя ровно один цикл, когда часы снова будут в той же фазе, — результат должен быть одинаковым. По вертикали период отражает ритмичность циркадианных часов после воздействия: по завершении подстройки часы продолжают идти по-прежнему (за исключением, быть может, восстановительного интервала).

Соединив экспериментальные точки на решетке, мы получим обычные кривые подстройки фазы (КПФ) для стимула определенной величены. Однако при увеличении стимула нечетная КПФ постепенно все больше изгибается, но все еще лежит вдоль диагонали. По достижении некоторой величины стимула кривая подстройки становится четной – она уже изгибается вдоль горизонтали. Каким образом осуществляется данный переход?

Изображения двумерной решетки можно выстроить в ряд бок обок вдоль горизонтали, слой за слоем в порядке увеличения стимула. Новая фаза повторяется по вертикали, старая фаза повторяется слева направо, а сила или длительность стимула возрастает в «глубину». Каждый слой в этой пачке состоит из 2*2 ячеек, как паркетный пол, и такую фигуру вполне естественно назвать кристаллом времени.

В кристалле времени кривые подстройки фазы сливаются и образуют волнообразную поверхность, напоминающую спираль. Таким образом, оказывается, что поверхность подстройки фазы напоминает серпантин или винтовую лестницу. Внутри должно находится нечто странное: либо провал, либо ось винтовой поверхности, область с бесконечной крутизной. Способа залатать отверстие куском поверхности, просто имеющем достаточную крутизну просто не существует: вертикальная ось (настоящий разрыв) – неизбежность.
Следовательно, переход от нечетной подстройки к четной осуществляется через винтовой спуск. Здесь поверхность должна стать вертикальной или исчезнуть вообще. В обоих случаях ее высота в этом месте остается неопределенной.
Такой стимул определенной величины, приложенный в уязвимой фазе, как раз и создает нашу сингулярность, то есть особенность, разрыв. Вблизи этой точки любое сколь угодное малое изменение времени и силы воздействия вызовет сколь угодно большое изменение результирующей новой фазы. Если кристалл времени окрасить в цвета радуги и посмотреть на него сверху вниз, то он предстанет в виде цветного прямоугольника, внутри которого должно быть место, где все цвета сливаются в бесцветную серую точку – точку сингулярности.
КРИСТАЛЛЫ ВРЕМЕНИ

Предположение о том, что млекопитающим присущи внутренние часы, которые ежедневно синхронизируются суточным циклом, возникло из экспериментов Мейнарда Джонсона в Гарварде

24 незадолго до второй мировой войны, но о нем скоро забыли. Лишь в 50-х годах
Фрэнк Браун из Северо-западного университета и Колин Питтендрих из
Принстона возродили концепции часов и захватывания (синхронизации). Идея использовать ежедневный стимул для подстройки фазы циркадианных часов родилась в диссертации Кеннета Роусона в 1956 году. Эта способность подстраивать фазу по сигналу времени – важнейшее условие полезности любых циркадианных ритмов. Роусон в своих опытах использовал млекопитающих, хотя они оказались не лучшими объектами для исследования подстройки фазы . И вскоре биологи освоили для этого другие организмы, порой экзотические, но каждый из которых давал исследователю новые возможности.

В экспериментах на одноклеточной водоросли Conyaulax было получено одно из первых, хотя до сих пор непризнанных, свидетельств четной подстройки. Одновременно или несколько раньше аналогичные данные были получены на обыкновенной плодовой мушке Drosophila pseudoobscura в лабораториях в Принстоне.

С начала ХХ века плодовые мушки стали самым подробно изучаемым многоклеточным организмом на планете. В настоящее время составлен огромный каталог ее мутантов – незаменимый инструмент в руках исследователя. Такой инструмент совершенно необходим: всякий критический эксперимент нуждается в тщательном контроле, без которого эксперимент вряд ли будет однозначным. До тех пор пока биолог-экспериментатор не поставит вопрос абсолютно точно,
Природа будет отвечать уклончиво. Использование генетических маркеров позволяет создать необычайно однородную популяцию исследуемых организмов.
Изучая мутантов с различными нарушениями зрения, проводя искусственный отбор линий мух с измененным периодом часов или необычной чувствительностью к температуре, биологи уже продвинулись так далеко, что выделили, клонировали и картировали гены, контролирующие развитие циркадианных часов.

Зачатие плодовой мушки происходит обычным путем. Оплодотворенное яйцо развивается, и из него вылупляется крошечная личинка. Затем в жизненном цикле всякой мухи наступает стадия, когда личинка должна превратиться в половозрелую крылатую особь. На время этого превращения насекомое укрывается в толстой коричневой капсуле – это закованное в панцирь существо называется куколкой. Внутри оболочки каждой куколки почти все личиночные органы растворяются и образуют жидкую массу, из которой заново строится тело взрослой особи. Только мозг остается неизменным, и в нем продолжают тикать циркадианные часы. Наконец, приходит срок, когда самка должна выбраться на волю, опробовать свои крылья и подыскать себе партнера. Самка раздувает на голове маленький пузырек и выталкивает «крышку-люк» – выход из оболочки. Через несколько минут она на свободе. В естественных условиях, а также в лаборатории при чередовании 12 часов света 12 часов темноты это событие – вылупление взрослой особи — происходит в первые светлые часы.

Момент вылупления задают циркадианные часы. Куколка с каждым днем все более созревает, готовясь к моменту, когда она выйдет на свет и вступит в конкурентную борьбу. Эта готовность, нарастающая изо дня в день, зависит также еще одного фактора – времени суток предпочтительного для вылупления. Мушке нет смысла появляться, когда день уже кончился или подставлять свое нежное влажное тельце зною дня. Целесообразнее всего появиться рано поутру. Это можно обеспечить внутренний ритм – повышая или понижая порог готовности.

Если изменения порога не велики, мушки все равно будут вылупляться в любое время циркадианного цикла, но в одно время с большей вероятностью, чем в другое. Если же порог изменяется в широких пределах, если в некоторые часы он поднимается быстрее, чем нарастает готовность, то в эти часы не появится ни одна мушка. В зависимости от возраста зреющей куколки она присоединяется к той или другой кучки вылупляющихся, но никогда не начнет вылупление в промежуточные часы. Появления мушек будут распределены во времени дискретными пачками – это распределение отражает работу часов, задающих ритм изменения порога.

25

У эмбрионов плодовой мушки циркадианные часы не включаются сами собой автоматически. Если с момента зачатия мушки находятся в постоянной темноте, момент вылупления определяется возрастом и совершенно не зависит от времени суток. Если популяция состоит из особей разного возраста (в пределах нескольких дней), то моменты отдельных вылуплений образуют плавное распределение, охватывающее несколько дней, без признаков ежедневного сгущения и разрежения. Но если на этапе раннего развития будет подан какой- либо сигнал времени, то через несколько дней вылупление будет происходить
«кучно», раздельными пиками, отстоящими друг от друга на 24 часа. Одиночная вспышка света, например, запускает часы у всех эмбрионов. Их 24-часовой период – врожденный, генетически запрограммированный. Но у мутантов этот период может составлять, например, 19 часов.

При таких условиях содержания состояние внутренних часов чутко реагирует на малейшие вариации температуры, на самую незначительную засветку. Если личинки содержать при постоянном освещении, то оно остановит ход часов, даже если они были пущены. Оказывается, часы дрозофилы не замечают красного и желтого, – но голубой, даже такой слабый, как лунный свет, сразу подавляет циркадианные колебания. В лабораториях для этого используют яркие лампы дневного света. Если куколок, выращенных на свету, перенести в красную или желтую темноту, все часы разом, одновременно возобновят ход и будут тикать синхронно. Примерно через 17 часов наступит пик массового вылупления, потом еще через 24 и так далее, пока не созреют самые молодые куколки. Однако даже кратковременная вспышка света, прорезающая вечную ночь, способна сдвинуть все последующие пики вылупления
– как будто свет вызывает подстройку внутренних часов, переводя их из какой-то старой фазы, на которую пришлась вспышка, в некую новую. Эту новую фазу легко оценить, экстраполируя последующий ритм выступлений назад, к моменту начала вспышки света.

В экспериментах с дрозофилой подстройку фазы вызывают на ранней стадии развития у куколок. Специальный аппарат, способный на протяжении нескольких недель регистрировать появление мушек, позволяет наблюдать моменты. Когда циркадианные часы оказываются в нулевой фазе (вылупление), а следовательно, вычислять фазу в любое время, поскольку период часов составляет 24 часа. Таким образом, можно установить, на сколько, например, сдвинулась фаза часов под влиянием светового импульса, приложенного за несколько дней до момента вылупления.

При первых поисках сигуляции биологических часов в экспериментах, организованных по схеме «ловушки сингулярности», было использовано более
500 чашек Петри – применялось воздействие светом разной длительности и в разное время. Постоянно регистрировалось время выступленья, а по нему оценивалась новая, подстроенная, фаза ведущего циркадианного ритма. Во всех чашках наблюдалось по несколько пиковых мушек – каждый день по одному, в одно и то же время по показаниям внутренних часов. Первый пик составили самые старшие в группе особи. Их младшим сестрам понадобилось еще несколько дней, чтобы завершить созревание и подготовиться к «выходу на свет», который состоялся по такому же сигналу того же самого циркадианного ритма.
Когда все полученные пики вылупления – около полтура тысяч – были изображены в виде точек на кристалле времени, получился полностью законченный трех мерный график зависимости новой фазы от величены стимула и старой фазы.

Что это за поверхность, на которой лежат экспериментальные точки?
Ближайшие к нам изображены в виде крупных шестигранников, самые удаленные
– в виде крошечных. Красная линия отмечает границу поверхности внутри двух соседних единичных ячеек. Проследим за диагональю «новая фаза = старая фаза» снизу вверх на ближайшей к нам плоскости, при стимуле нулевой длительности для все более старой фазы. Это нечетный тип подстройки.
Дойдем до рефрактерной фазы, когда часы невосприимчивы к любому количеству света. Если в этой точке свернуться с диагонали в глубь, то по мере увеличения стимула вплоть до максимума экспериментальные точки будут встречаться на прежней высоте. (Существование такой точки

26 рефрактерности — нечувствительности – не является логической необходимостью, и в других случаях ее может не быть. Впрочем, постоянство новой фазы на боковых стенках, стенках кристалла времени не играет роли в наших рассуждениях.) Далее, при максимальной величине стимула на задней стенке кристалла, двигаясь справа налево на один цикл старой фазы, видно, что точки поднимаются и опускаются вокруг горизонтали. Волнистая поверхность четный тип подстройки. Здесь, на один цикл раньше той точки, от которой мы свернули вглубь, мы окажемся в той же самой нечувствительной фазе. Теперь будем уменьшать величину стимула при постоянной старой фазе: на этом пути возвращения из глубинны кристалла новая фаза, остается не изменой. Так мы вернулись в точку, лежащую на один цикл выше точки старта.
При этом мы обошли одну полную единицу ячейку кристалла времени совершив восхождение по одному витку спирали. Облако экспериментальных точек определило винтовую поверхность.

Это весьма примечательно. Обходя единичную ячейку, мы наблюдали только результат экспериментов, в которых воздействие не дает никакого эффекта, плюс серия опытов с такими сильными стимулами, что результат подстройки ритма всякий раз оказывался практически одинаковым. Трудно поверить, что столь поверхностное исследование поведения часов, столь бледные результаты могут таить в себе семена чего-то необычного. Однако биологические часы, как заметил однажды Г. К. Честертон по другому поводу,
«кажутся математически правильными, чуть более точными, чем они есть на самом деле. Их точность очевидна, а неточность скрыта. Их беспорядочность ожидает в засаде». Неизбежный вывод (собственно, ради него были затеяны эксперименты) состоит в том, что спиральная граница принадлежит винтовой поверхности, а винтовая поверхность должна содержаться где-то внутри себя, вдали от стимулов, дающих гладкую пограничную линию, некую особую ось. Ось этой винтовой поверхности – вертикальная линия, вдоль которой высота поверхности становится не определенной. На горизонтальном «полу» кристалла эта ось имеет проекцию – особую точку, уникальный стимул, некое сочетание момента и длительности воздействия светом. Что же произойдет при действие такого стимула?

Прежде всего, что это за стимул? Если яркость голубого света такова, что при нем едва можно читать, то длительность экспозиции – около минуты.
Свет надо дать около полуночи в обычном суточном цикле, то есть тогда, когда в природе света очень мало. Дикая дрозофила в этот час может увидеть лишь лунный свет: полная экспозиция в течение нескольких минут могла бы составить сингулярный стимул, но для маленькой куколке, скрытой под листьями или зарытой в песок, шансы такой засветки малы. Даже если бы это случилось именно в уязвимое фазе, дневной свет полностью перекрыл эффект сингулярного стимула.

Однако в XX веке подобные лабораторные организмы порой попадают в необычные условия, невозможные в природе. Их циркадианные часы, изолированные е от внешних сигналов времени, предаются свободному бегу – при этом они доступны и открыты действию исследуемых стимулов и наше любопытному взору. Что будет с чашечкой «куколок» после воздействия сингулярного стимула? Оказывается, последующее циркадианное поведение становится неопределенным вполне естественно, как и предсказывает винтовая поверхность подстройки фазы. Однако вероятны взаимно исключающих способов реализации такой неопределенности. Может быть, куколки погибнут, не дожив до их вылупления? Или они по прежнему будут вылупляться в виде суточных пиков, но положение этих пиков во времени будут не предсказуемым? На самом деле ни то ни другое. Просто вылупление происходит непрерывно. Начиная с момента сингулярного стимула до тех пор, пока какой-либо другой сигнал не даст покоящимся куколкам точку для отсечение времени, они остаются как бы вне времени, будто ждут толчка, который бы подтолкнул, запустил их стоящие часы. И в случае, когда часы ни разу не получали стимула с самого момента зачатия, и в случае, если такой стимул ранее обеспечил ритмичность, а затем другой, сингулярный, вновь приостановил ее, — картина одна: у каждой дрозофилы циркадианные часы не идут. В таком состояние отдельные особи выходят из метаморфозы в любой час суток, совершенно не ритмично.

27

Более того, если за тем восстановится циркадианный режим вылупление вторым импульсом света, то новая фаза совсем не будет зависеть от времени подачи этого второго стимула: всякий раз будет одна и та же фаза, как будто между двумя стимулами не прошло никакого времени, то есть если бы первый стимул по величине равнялся сумме двух. Получив первую дозу, циркадианная система куколке сразу замирает и далее продолжает «скучать» в ожидание новое порции света.
Таким образом, полученная в опыте поверхность подстройки фазы похожа на чудесную снежную гору с бесконечным спуском-серпанитинном, по которому хочется мчаться на лыжах, делая веток за витком по спирали вокруг сингулярности.
Топографическая карта фаз не только показывает точное местоположение сингулярности, ее ежедневное повторение, но, кроме того, еще и выделяет не предвиденное сжатие, смещение всей картины вниз (при движение слева на право, то есть в сторону малых величин стимула). Это означает, что позже, после перехода из постоянного света в темноту, тот же эффект достигается при более короткой экспозиции, при меньшей величены светого стимула. Иными словами, чем дольше насекомое остается в темноте, тем чувствительнее к свету остаются его часы. В течение двух-трех дней достигается двенадцати кратная цветовая адапция: если сразу после переноса куколок с непрерывного света в темноту световые импульсы воспринимают слабо, то после двух дней пребывания в темноте чувствительность часов возрастает настолько, что непрерывного освещения, даже более тусклого, чем лунный свет, уже достаточно, чтобы остановить их ход. За последнее время получены другие подтверждения такой своеобразной аксонометрии кристалла времени, хотя причина неизвестна. Может быть, это следствие постепенного восстановления пигмента, разрушенного за время долгого пребывания на свету: или дело в медленном ослабление циркадианных часов – ведь чем меньше амплитуда колебания, тем легче их нарушить; а возможно, имеют место обе причины. Для одних биологических видов собранно больше данных в пользу первого объяснения, для других – в пользу второго; механизмы могут быть различными.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Дильман В. М. Большие биологические часы. Введение в интегральную медицину. – М.: Знание,1986.
2. Малахов Г. П. Биоритмология и уринотерапия.- СПб.: АО «Комплект»,

1994.
3. Уинфри А. Т. Время по биологическим часам. – М.: Мир, 1990.

2

ПЛАН
1. Иерархия управления в организме.
2. Стресс и болезни.
3. Внутриклеточные биоритмы.
4. Суточные биоритмы: а) Поддержание синхронности с вращением Земли. б) Врожденные биологические часы человека

(25-часовой период). в) Свободный ход и захватывание биологических часов. г) Автоматическая установка внутреннего будильника.
5. Подстройка биологических часов.
6. Сингулярность биологических часов.
7. Кристаллы времени.
8. Список литературы.

Ярославский педагогический университет имени К. Д. Ушинского

Выполнили

студентки II курса ФИЯ

группы 421

Казакова Елена Сергеевна

и

Лундина Екатерина Павловна

Ярославль,1998.

Реферат на тему:

Разделение белков по размерам с использованием DDC-Na

2009

Разделение белков по размерам с использованием DDC-Na

Электрофорез белков в простой системе удобно использовать для их разделения, но не характеристики. Электрофоретическая подвижность каждого белка в простой системе зависит одновременно и от массы белка, и от его суммарного электрического заряда, и от конфигурации, и от жесткости упаковки белковой глобулы. Вклад каждого из этих факторов неизвестен и может существенно изменяться в зависимости от условий электрофореза. Для установления строгой корреляции между каким-либо одним из перечисленных параметров и электрофоретической подвижностью белка надо исключить влияние всех остальных.

Электрофорез в ПААГ с использованием DDC-Na позволяет разделять белки, различающиеся между собой только по молекулярной массе. Для этого смесь белков в исходном препарате обрабатывают не менее, чем трехкратным избытком DDC-Na (по весу). За счет гидрофобных взаимодействий детергент одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1,4 мг DDC-Na на 1 мг белка.

Огромный избыток полностью диссоциированных остатков сульфокислоты, привносимый детергентом, в большинстве случаев делает несущественной роль собственного заряда белка. Благодаря электростатическому отталкиванию тесно расположенных отрицательно заряженных остатков серной кислоты, белковая цепь распрямляется и приобретает форму жесткой палочки с поперечником -1,6 m и длиной, зависящей только от числа звеньев этой цепи, а следовательно — от молекулярной массы белка.

Одновременно с обработкой DDC-Na необходимо обеспечить возможность полного развертывания белковой цепи, а для этого — разорвать все ковалентные S-S связи внутри молекулы белка. С этой целью белок перед электрофорезом обрабатывают еще и высокой концентрацией (1%) (3-меркаптоэтанола при повышенной температуре.

Электрофретическая подвижность, т. е. скорость миграции при напряженности поля 1 В/см, жесткого комплекса белок DDC-Na оказывается связанной с молекулярной массой белка (М) простым соотношением A-BIgM, где А и В — коэффициенты, зависящие от пористости геля, температуры и других условий эксперимента. Величину и’ удобнее представлять в относительных единицах, выражающих отношение путей миграции белка и «лидирующего красителя» — бромфенолового синего. Обозначим это отношение Rf. Такая замена отразится только на значении коэффициентов А и В, о которых нам известно только то, что они в данных условиях опыта одинаковы для всех белков. Измененные величины коэффициентов тоже будут постоянными величинами в данном опыте. Поэтому вместо их определения пользуются методом сравнения с известными по своей массе «маркерами». Одновременно с электрофорезом изучаемой смеси белков, отдельным треком на той же пластинке, т.е. в тождественных условиях эксперимента, разделяют смесь известных маркеров. С их помощью по точкам строят зависимость lgM=f(Rf), которая, естественно, оказывается прямолинейной. Опираясь на эту зависимость, можно графически, по измеренным величинам Rf определить значения lg М, а следовательно и М для исследуемого белкА. Разумеется, вся предварительная обработка детергентом и Р-меркаптоэтанолом должна быть проведена строго одинаково для этого белка и всех маркеров.

Выбор буфера в этом варианте не играет роли, так как заряд белка определяется его комплексом с DDC-Na. Обычно используют нейтральный буфер, добавляя в него 0,1% DDC-Na, чтобы поддержать комплекс детергента с белками»

Для белков с молекулярной массой менее 12 тысяч дальтон определение М становится ненадежным. Для различных диапазонов масс белков рекомендуется использовать ПААГ различной пористости, согласно следующей таблице:

Диапазон М (тысяч дальтон) % ПААГ 12-43 15 16-68 10 36-94 7,5 57-212 5

Сам процесс электрофореза и окраски белков после его окончания производят как обычно, но DDC-Na от белка предпочтительно отмыть до окраски, вымачивая гель в 50% -ной ТХУ в течение ночи.

DDC-Na в комплексе с белком в некоторой мере препятствует окрашиванию (большой отрицательный заряд!).

Двумерный электрофорез в ПААГ

Полное разделение сложной смеси белков не всегда удается осуществить в ходе одного электрофоретического эксперимента. Всегда есть вероятность того, что в данной системе электрофореза различные белки мигрируют в одной зоне либо в силу близости их размеров, либо ввиду совпадения их электрофоретических подвижностей при выбранном значении рН, либо, наконец, в результате неблагоприятной для разделения комбинации этих параметров. Поэтому в сложных случаях фракционирования смеси белков имеет смысл использовать разделение в первом направлении как исходное для разделения во втором, перпендикулярном первому направлении при измененных условиях электрофореза.

Для этого трек первого направления (без осаждения и окраски белков в нем) вырезают и накладывают на стартовую зону пластинки второго направления (без карманов). Контакт между двумя гелями обеспечивают заливая место их соприкосновения расплавленным раствором агарозы в том же буфере. Электрофорез, естественно, ведут в направлении, перпендикулярном полоске. Каждая негомогенная полоса в ней может дать несколько пятен во втором направлении, если в новых условиях содержавшиеся в ней белки обретут различную электрофоретическую подвижность. В результате после осаждения и прокрашивания на пластинке появляется картина распределенных по всей поверхности пятен («фингерпринт»). Число пятен различных белков, которое удается зафиксировать на одной пластине может достигнуть нескольких сотен. На рис. 42 воспроизведена картина распределения пятен, полученных при двумерном электрофорезе белков из большой субъединицы одной из бактерий (в работе Mets, Bogorad Anal. Biochem. 57 200, 1974).

Извлечение белков из геля после электрофореза

Для целей аналитической идентификации белки из ПААГ (без осаждения и окраски) можно перенести на нитроцеллюлозный мембранный фильтр. Такие фильтры обладают способностью сорбировать основные белки. Перенос осуществляется путем вымывания белковых полос из геля током буфера в направлении, перпендикулярном поверхности пластинки. Фильтр накладывают непосредственно на влажный гель. Устройство для обеспечения тока буфера от геля к фильтру будет описано ниже в связи с электрофорезом ДНК.

В результате на фильтре получаются «реплики» белков, разделенных в геле. Для их идентификации можно использовать характерные реакции, иногда ферментативные или имунные (см. ниже), а также гибридизацию с мечеными радиоактивным фосфором ДНК или РНК, если эти белки in vivo связывались с ДНК или разделению подвергались рибосомальные белки, связывающиеся с РНК рибосом.

Электрофорез нуклеиновых кислот

Главное, что с точки зрения электрофореза отличает нуклеиновые кислоты от белков — это значительный по величине суммарный отрицательный заряд, обусловленный диссоциацией многочисленных остатков фосфорной кислоты в связях между нуклеозидами. рН окружающей среды мало влияет на этот заряд. Поэтому электрофорез можно вести не в буфере, а в любом подходящем ионосодержащем растворе, например в слабом растворе щелочи. Во всех случаях в жидкую среду вносят ЭДТА до концентрации 1—2 mM. Это необходимо для блокирования действия нуклеаз и предупреждения осаждения (особенно РНК) двухвалентными металлами.

Таким образом, разделение фрагментов ДНК и РНК электрофорезом приходится вести только по размеру. Однако размеры эти могут варьировать в очень широких пределах: от десятков нукле-отидных звеньев до многих сотен тысяч, а если выражать через молекулярные массы, то от нескольких тысяч до сотен миллионов дальтон.

Естественно, что для фракционирования относительно коротких фрагментов используют электрофорез в ПААГ, а для разделения высокомолекулярных ДНК, более крупнопористый носитель — агарозу. С ней мы познакомимся чуть позже. А пока в порядке связи с предыдущими параграфами уместно сделать несколько замечаний об электрофорезе ДНК в ПААГ. В нижеследующей таблице представлены рекомендации по выбору пористости геля в зависимости от размеров относительно коротких фрагментов ДНК, охарактеризованных числом пар оснований (п.о.):

В последнем диапазоне этой таблицы находятся предельные размеры ДНК, доступные автоматическому секвенированию последовательности нуклеотидов. Этот революционный метод анализа ДНК будет рассмотрен в следующей главе.

Сейчас же, прежде, чем перейти к электрофорезу в агарозе, я хочу познакомить учащихся и читателей с новыми идеями фракционирования крупных фрагментов ДНК в ПААГ с оригинальным использованием импульсов электрического напряжения, подаваемых на гель. Эти импульсы подаются поочередно в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Идея здесь заключается вот в чем. Даже очень длинная и гибкая молекула ДНК может протиснуться через относительно малые поры геля, если она вытянута в направлении продвижения к «основному» аноду, скажем, расположенному внизу пластинки. Напряжение на этот анод подается не постоянно, а импульсами. Второй, «вспомогательный» анод создает напряженность электрического поля, перпендикулярную основному направлению движения ДНК к низу пластинки. Напряжение на него подается тоже достаточно мощными, но более короткими импульсами, чем на основной анод, чередуясь с ними.

Назначение «перпендикулярного» электрического поля состоит в том, чтобы поворачивать длинные молекулы больших ДНК так, чтобы в момент подачи «продольного» импульса они находились в положении, благоприятном для движения вдоль пластинки вниз, к основному аноду. Чем длиннее цепи ДНК, тем медленнее они будут менять свою ориентировку и потому медленнее подвигаться в нужном направлении. Авторы метода утверждают, что таким образом в ПААГ им удавалось разделять фрагменты ДНК длиной до пяти миллионов пар оснований.

Предложено несколько вариантов использования этой идеи. В одном из них чередующиеся импульсы одинаковой силы направлены каждый под углом 45° к продольной оси пластины, навязывая таким образом молекулам ДНК движение зигзагом, своего рода «рыскание». (Идея, по всей видимости, почерпнута из практики проталкивания через густую толпу людей.)

Гели агарозы

Агароза — это особо чистая фракция природного, линейного полисахарида, агара, выделяемого из морских водорослей. Мы с ним уже встречались.

Молекулярная масса одиночных нитей агарозы лежит в пределах 10-100 тысяч дальтон. Агароза для электрофореза поставляется в виде лиофилизированного (высушенного в вакууме) порошка. Гелеобразование происходит при остывании даже очень разбавленного горячего раствора агарозы в буфере. При температуре 84-96° С (а у некоторых типов агарозы уже при 70°) нити полимера плавятся и образуют с окружающей водной средой однородную прозрачную жидкость. Она обладает ярко выраженным температурным гистерезисом — застывает при температуре порядка 40°С. Остывая до этой температуры, даже 0,4% -ные растворы агарозы образуют прочные гели. У легкоплавких типов агарозы температура затвердевания снижается до 30°. Такая особенность агарозы облегчает все манипуляции с ее растворами, не опасаясь их затвердевания. Более того,, расплавленную на кипящей бане взвесь агарозы в воде охлаждают до 50-55° и только при этой температуре добавляют концентрат буфера и все другие добавки, а затем заливают в форму для электрофореза. Это удобно и не связано с возникновением тепловых деформаций.

Остывая, хаотически ориентированные нити затвердевшей агарозы благодаря множественным водородным связям между нитями собираются в жгуты. Эти жгуты свободно перекрещиваясь, создают в окружающей их жидкости очень крупнопористую и, вместе с тем, жесткую пространственную сетку.

Размер пор геля агарозы, естественно, связан с концентрацией ее исходного раствора. Можно привести некоторые рекомендации по выбору этой концентрации, почерпнутые из опыта электрофореза нуклеиновых кислот:

Для нуклеиновых кислот вирусов и крупных плазмид 0,4-0,5%.

Для рестриктов ДНК, содержащих 5—20 тысяч пар оснований 0,7-0,8%.

Для более коротких рестриктов ДНК и двунитевых РНК рео-вируса 1,5%.

Для рибосомальных РНК — 1,75%.

Для иРНК и рестриктов ДНК до 1000 п.о. — 2% .

Приготовление пластины для электрофореза в агарозе очень просто. Нужного размера стекло оклеивают со всех сторон по ребру сплошной липкой лентой так, чтобы ее верхний край на несколько миллиметров выступал над поверхностью стекла. Последнее кладут на строго горизонтальный столик. Прямо на стекло выливают рассчитанный объем еще жидкого раствора агарозы. Затем в него близ одного края стекла устанавливают гребенку, подобную той, которую ставят в форму ПААГ перед его полимеризацией. Только на этот раз гребенку погружают в агарозу перпендикулярно стеклу (зубцы ее, однако, не должны касаться стекла). После застывания агарозы гребенку вынимают, образуя таким образом «колодцы» для препаратов. Электрофорез ведут в горизонтальном положении (в треках), накладывая фитили, идущие от резервуаров с буферами. Рабочее значение напряженности поля 2-5 В/см.

ДНК, особенно двунитевые, а также и РНК хорошо окрашиваются желтым флюоресцентным красителем — бромистым эти-дием. Этот краситель несет положительный заряд, что позволяет ему взаимодействовать с фосфатными группами нуклеиновых кислот. Кроме того он способен интеркалировать (встраиваться) между оснований двунитевой ДНК, что приводит к резкому усилению его флюоресценции при освещении ультрафиолетовым светом. Окраску можно производить и после электрофореза вымачиванием геля в течение 0,5—1 часа в водном растворе красителя (1 мкг/мл) или же вводить его непосредственно в гель. В последнем случае можно следить за движением полос в геле. Стеклянную пластину в этом случае освещают УФ-лампой снизу. Чувствительность окраски высока. Можно наблюдать и фотографировать полосы, содержащие 0,01 мкгДНК.

В конце электрофореза ДНК можно зафиксировать в геле осаждением из раствора, вымачивая гель в 70% -ном этаноле.

Пипетки

Конечно, современные микропипетки совсем не похожи на те, которые употребляют в школьном химическом кабинете. Их устройство таково. Довольно объемистую, пластмассовую (снаружи) рукоятку пипетки удобно держать четырьмя пальцами руки, оставив большой палец свободным для нажатия кнопки, торчащей из верхнего конца рукоятки. Книзу из нее выходит длинный, слегка конический металлический стержень, на конец которого плотно надевается конический полый наконечник из специальной пластмассы.

В рукоятке спрятан механизм, главную часть которого составляют очень точно подогнанные друг к другу тонкий цилиндр и поршень, отжимаемый кверху пружиной. Нажатием кнопки поршень перемещается вниз. Опустив наконечник в жидкость и освободив предварительно нажатую кнопку набирают в наконечник объем в 1, 2, 3 и более микролитров — в соответствии с калибровкой пипетки. Вторичным нажатием кнопки жидкость из наконечника полностью выталкивается. Наконечники поставляются стерилизованными и используются однократно.

Есть пипетки с возможностью предварительной регулировки объема жидкости, например, от 2-х до 20-ти микролитров. Регулировку осуществляют поворотом головки винта, который устанавливает длину хода поршня. Выбранный объем указывает связанный с винтом градуированный барабанчик.

Влияние вторичной структуры ДНК

В электрофоретическом поведении однонитевых (денатурированная ДНК, РНК) и двунитевых молекул нуклеиновых кислот многое определяется их размерами. В случае коротких полинуклеотидных цепей их нативная двунитевая молекула имеет более жесткую структуру, чем таких же размеров однонитевая молекула. Она труднее изгибается, проходя через пространственную сетку геля. В силу этого относительно короткие двунитевые фрагменты ДНК будут отставать при электрофорезе в ПААГ от денатурированных ДНК такой же длины. Такая ситуация будет иметь место даже для ДНК бактериофага ФХ-174 с молекулярной массой в 3,5 миллиона дальтон. Однако для более крупных молекул ситуация может измениться на противоположную. Длинная двунитевая цепочка оказывается уже достаточно гибкой: она продвигается через поры геля как бы «извиваясь ужом». Между тем однонитевая цепь той же длины сворачивается в рыхлый «хаотический клубок» такого размера, что его продвижение в геле оказывается более затрудненным. Денатурированная ДНК в этом случае при электрофорезе отстает от нативной. Естественно, что граница обращения описанного эффекта зависит от размеров пор геля.

Вирусные и митохондриальные двунитевые ДНК, а также плазмиды бактерий имеют структуру замкнутого двунитевого кольца. Нативное состояние такого кольца — «сверхскрученное» (ему отвечает минимум внутренних напряжений). Кольцо в целом сворачивается в «жгут», что сильно увеличивает его компактность (форма I). Если же хотя бы в одной из двух скрученных нитей кольца появляется единичный разрыв сахаро-фосфатной цепи, то жгут разворачивается и под действием сил электростатистического отталкивания фосфатных групп кольцо расправляется. Компактность молекулы уменьшается, ее наружные размеры увеличиваются (форма II). Что касается линейной двухните-вой молекулы ДНК (форма III), то в зависимости от среднего размера пор геля она может мигрировать быстрее или медленнее, чем сверхскрученное кольцо одинаковой с ней массы. Для крупнопористого геля решающим фактором может оказаться компактность формы I; для более мелких пор на первый план выступает большая гибкость линейной молекулы ДНК (форма III).

На рис. 1, на правом треке показан результат фракционирования ДНК E.coli: основной ее массы (2), кольцевой плазмидной ДНК (1) и сверхскрученной плазмиды (3) в 0,8% геле агарозы. (Telford, Science 195, 391, 1977). На левом треке того же рисунка указаны положения «маркеров» — плазмид известной молекулярной массы (соответствующие цифры указаны в миллионах дальтон).

Рис.1

Скорость миграции линейных двухнитевых молекул ДНК уменьшается с увеличением их массы, но лишь до определенного предела. При молекулярной массе более 5 миллионов в 1,6%-ном геле агарозы и при массе более 12 миллионов дальтон в 0,8% -ной агарозе молекулы мигрируют практически с одинаковой скоростью, независимо от их массы. В этих случаях решающую роль играет гибкость — способность очень длинных молекул, извиваясь, проходить через гель одинаково легко (или одинаково трудно) при любой длине.

Рибосомальные РНК могут иметь существенно более невыгодную для миграции в геле вторичную структуру, чем ДНК. Дело в том, что у крупных молекул РНК эта структура представлена многочисленными, торчащими во все стороны «шпильками». Это — места локального спаривания в жесткие двунитевые структуры отдельных, зачастую далеко отстоящих друг от друга по основной последовательности, комплементарных участков РНК. Такая молекула уже не может продвигаться через поры геля Собирая основной «сэндвич» (гель, фильтр и облегающие их листки фильтровальной бумаги) следует проверять, что между ними не остаются пузырьки воздуха.

Перенос ДНК на нитроцеллюлозный фильтр занимает 2—3 часа. Следует заметить, что короткие фрагменты ДНК на нитроцел-люлозном фильтре задерживаются плохо. Если это существенно, то лучше использовать фильтры из так называемой, «диазобума-ги» или «ДБМ-бумаги». Фирма Ватман выпускает ее под наименованием «Whatman 540».

Литература

Курашвили Л.В. Нарушения, липидного обмена при состояниях напряжения. II Захарьинские чтения. Тезисы докладов. — 1995. -С.127.

Курашвили Л.В. Активность липазы и ЛХАТ при длительном обезвоживании. В кн.: Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации больных. Тезисы докладов. — Пенза, 1995. -С.71-72.

Курашвили Л.В. Фосфолипидный статус при нарушении водно-электролитного обмена. В кн.: Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации больных. Тезисы докладов. — Пенза, 1995.-С.69-70.