Автор: admin

Федеральное агентство по образованию

Пензенский государственный педагогический университет

им. В.Г. Белинского

Факультет Естественно-географический

Кафедра Биохимии

Дипломная работа

Исследование соотношения в мышцах С- и Х-белков в норме и при патологии

Студент _________________________________________ Швецов Ю.А.

подпись

Научный руководитель

Зав. лаб. ИТЭБ РАН, д.б.н., профессор______________Подлубная З.А.

подпись

Научный руководитель

доц. каф. биохимии, к.б.н.__________________________ Соловьев В.Б.

подпись

К защите допустить. Протокол № от «____» ___________200_г.

Зав. кафедрой _____________________________________ Генгин М.Т.

подпись

Пенза, 2008 г.

содержание

Список использованных сокращений………………………………………….…4

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………..5

I. обзор литературы………………………………………………………………..8

Глава 1. САРКОМЕРНЫЕ ЦИТОСКЕЛЕТНЫЕ БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА тайтинА…………………………………………………………………………….8

1.1 Структура молекулы тайтина и его функции…………….………………8

1.2 Структура и функции молекул С-белка, Х-белка и Н-белка……..……10

1.3 Белки семейства тайтина в норме, при адаптации и патологии…….….14

Глава 2. Амилоидозы………………………………………..…….………….…16

2.1. Актуальность проблемы……………………………………………..……16

2.2. История изучения амилоидозов….……………………………………….17

2.3. Современные представления о строении и формировании амилоидных фибрилл…………………………………………………………………………..19

2.4. Изучение амилоидных фибрилл in vitro………………………………….25

Патологические проявления амилоидозов………………………………30

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ………………………………………….32

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ………………………………………….32

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ…………………………………..……….33

3.1. Экспериментальный и клинический материал…………………………..33

3.2. Выделение и очистка белковых препаратов……………………………..33

3.2.1. Очистка С-белка, Х-белка и Н-белка…………………………….………….35

3.2.2. Выделение тайтина из скелетных мышц………………………………….35

3.3. Определение концентрации белковых препаратов………………………34

3.4. Проверка чистоты белковых препаратов…………………………………35

3.5. Условия формирования амилоидных фибрилл………………………….36

3.6. Микроскопические исследования…………………………………………37

3.6.1 Электронная микроскопия…………………………………………………37

3.6.2. Поляризационная и флуоресцентная микроскопия………………..……37

3.7. Спектральные методы……………………………………………………..37

3.7.1. Метод кругового дихроизма……………………………………………….37

3.7.2. Метод флуоресцентного анализа………………………………………….38

3.7.3. Спектрофотометрический метод……………………………..………….38

III. Результаты и обсуждение………………………..………………….………40

Глава 4. образование амилоидных фибрилл белками семейства тайтина….40

Электронно-микроскопическое изучение агрегационных свойств молекул тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка скелетных мышц кролика…………………………………………………………..……………….40

4.2. Электронно-микроскопическое изучение агрегационных свойств Аβ(25-35)-пептида в сравнении с агрегацией молекул Х-белка…………….47

Подтверждение амилоидной природы агрегатов, образуемых белками семейства тайтина (тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка) при их взаимодействии со специфическими красителями на амилоиды Конго красным и тиофлавином Т………………………………………………………49

Изучение вторичной структуры тайтина и белков его семейства до и после образования амилоидных фибрилл ……………………………………..….53

4.5. Скорость образования амилоидных фибрилл Х-белка..……………..….55

Образование амилоидных фибрилл С-белком миокарда человека при ДКМП и С-белком миокарда кролика………………………..…………………57

Список литературы……………………………………………………………..61

Список использованных сокращений

ДКМП дилатационная кардиомиопатия

ДСН додецилсульфат натрия

ДТТ дитиотреитол

КД круговой дихроизм

кДа килодальтон

КК Конго красный

ЛММ легкий меромиозин

МДа мегадальтон

мкм микрометр

нм нанометр

ТТ тиофлавин Т

УФ ультрафиолет

ЭГТА этиленгликоль бис- (β-аминоэтиловый эфир N,N,N’,N-тетрауксусной кислоты)

ЭДТА этилендиаминтетраацетат

FnIII фибронектин-3-подобный домен

IgC2 иммуноглобулин-С2-подобный домен

PMSF фенилметилсульфонилфторид

λ длина волны

μ ионная сила

введение

Амилоидозы – большая группа конформационных заболеваний, которая характеризуется отложениями белка в виде нерастворимых фибрилл в разных органах и тканях, образующихся в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белков (Tan & Perys, 1994; Uversky & Fink, 2004). Их накопление разрушает структуру и функционирование органов и тканей, приводя к болезни и летальному исходу. Амилоидные отложения найдены при болезни Альцгеймера, Паркинсона, Дауна, диабете второго типа, наследственной амилоидной полинейропатии, системном амилоидозе и др. (Tan & Perys, 1994; Goedert, 2001; Dobson, 2001).

Известно много белков, образующих амилоидные фибриллы, таких как тау-белок, Аβ-пептид, ацилфосфатаза, миоглобин, амилин, транстиретин и другие (Guijarro et al., 1998; Chiti et al., 1999; Fandrich et al., 2001; Uversky & Fink, 2004). Несмотря на различие в белках-предшественниках амилоидов, образуемые ими амилоидные фибриллы имеют общие свойства: β-складчатую структуру с отдельными β-слоями, ориентированными параллельно главной оси фибриллы; нерастворимость in vivo; специфическое связывание с красителями Конго красным и тиофлавином Т (Klunk et al., 1989; Krebs et al., 2005). Важно отметить, что белки-предшественники амилоидов претерпевают трансформацию типа «α-спираль – β-складчатость», необходимую для образования амилоидных фибрилл (Uversky & Fink, 2004).

К сожалению, процессы, лежащие в основе аномальной агрегации белка и ее патологического проявления при болезнях, изучены еще недостаточно. Выяснение молекулярных механизмов амилоидозов, установление белковой природы депозитов и их свойств, развитие терапевтических методов лечения и предупреждения этих заболеваний, а также разработка их прижизненной диагностики являются актуальными задачами. Успешное решение этих задач во многом зависит от фундаментальных знаний амилоидогенеза: выяснения свойств амилоидов разных белков, знания факторов, регулирующих их образование и разрушение, их эффектов на жизнедеятельность разных клеток и т.д. В наибольшей мере это относится к мышечным амилоидозам как к наименее изученным. Амилоидные отложения найдены при кардиомиопатиях, миокардитах и миозитах в мышцах и кровеносных сосудах, однако их белковая природа до сих пор неизвестна.

Данная работа посвящена изучению способности белков семейства тайтина формировать амилоидные фибриллы. В настоящее время известна большая группа белков семейства тайтина (тайтин, С-белок, Х-белок, Н-белок и другие), относящихся к саркомерным белкам поперечно-полосатых мышц позвоночных. Они связаны с миозин-содержащими (толстыми) нитями и составляют 15% от общего количества белка в саркомере. С-белок в быстрых волокнах скелетных мышц и его изоформа Х-белок в медленных волокнах (Yamamoto & Moos, 1983; Starr & Offer, 1983) располагаются на поверхности толстых нитей с периодом 43 нм (Bennett et al., 1986; Soteriou et al1., 1993), связываясь одновременно с тайтином и миозином. Тайтин является продольным элементом саркомерного цитоскелета поперечно-полосатых мышц позвоночных.

Исследования показали, что тайтин и белки его семейства могут выполнять разные функции в саркомере. Предполагается, что они играют существенную роль в миогенезе при сборке толстых нитей и формировании структуры саркомера, участвуют в регуляции актин-миозинового взаимодействия при мышечном сокращении и в процессах сигнализации. Наличие 90% β-складчатой структуры в этих белках создает возможность формирования ими амилоидов. Изучение способности белков семейства тайтина формировать амилоидные фибриллы представляет большой интерес в связи с их возможным участием в развитии амилоидозов. Ранее при изучении агрегационных свойств белков, связанных в саркомере с миозиновыми нитями, было обнаружено, что один из них (Х-белок) образует in vitro спирально скрученные ленточные фибриллы (Bennett et al., 1985). Авторы указали на визуальное сходство этих структур с амилоидными фибриллами, образуемыми Аβ-пептидом в мозге при болезни Альцгеймера. Однако разные структурные параметры фибрилл Х-белка заставили авторов сомневаться в этом предположении и, возможно, поэтому тестирование их на амилоидогенность не было проведено. Эти наблюдения и высокое содержание β-складчатой структуры стимулировали наше исследование амилоидной природы агрегатов, образуемых Х-белком и другими саркомерными белками семейства тайтина.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. САРКОМЕРНЫЕ ЦИТОСКЕЛЕТНЫЕ БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА ТАЙТИНА

Сократительным аппаратом мышечной клетки является миофибрилла, которая состоит из наименьших сократительных единиц – саркомеров. Саркомеры расположены друг за другом вдоль оси миофибриллы. Каждый саркомер содержит упорядоченную систему цитоскелетных и сократительных белков и имеет длину 2.5–3.0 мкм (Squire, 1981; Шубникова и др. 2001). Основными сократительными белками саркомера являются миозин, актин и тайтин. Молекулы актина образуют тонкие (актиновые) нити, в состав которого входят также тропомиозин и тропонин. Толстые нити скелетных мышц кроме миозина содержат также другие белки, такие как тайтин, С-белок, Х-белок, Н-белок и др. (рис. 1).

Рис.1. Модифицированная схема саркомера (Gregorio et al., 1999).

1.1 Структура молекулы тайтина и его функции

Тайтин (= коннектин, титин) – гигантский эластичный белок скелетных и сердечных мышц млекопитающих (Maruyama et al., 1977; Wang et al., 1979) с молекулярным весом более 3 МДа (Labeit & Kolmerer, 1995). Он был открыт независимо двумя группами исследователей методом ДСН-гель-электрофореза (Wang et al., 1979; Maruyama et al., 1981). Тайтин является третьим по количеству (после актина и миозина) компонентом саркомера поперечно-полосатых мышц позвоночных. Молекулы тайтина длиной около 1 мкм и шириной 3–4 нм (Trinick et al., 1984; Itoh et al., 1986; Nave et al., 1989; Soteriou et al., 1993; Suzuki et al., 1994; Houmeida et al., 1995; Tskhovrebova & Trinick, 1997) перекрывают половину саркомера от М-линии до Z-линии (рис. 1), простираясь через I- и А-диски саркомера, формируя третью филаментную систему в миофибриллах (Fьrst et al., 1988). NH2-концы молекулы тайтина из смежных саркомеров перекрываются в Z-линии, а СООН-концы перекрываются в М-линии. На каждую половину саркомера приходится по шесть молекул тайтина, которые объединены в А-диске саркомера (Trinick 1981; Liversage et al., 2001) и, предположительно, разделяются на пары или на индивидуальные молекулы в I-диске саркомера (Funatsu et al., 1993).

Исследования последних лет показали, что этот гигантский полипептид имеет различное строение в разных зонах саркомера, что вносит свой вклад в их архитектуру и функционирование. Бульшая часть (~90%) молекулы тайтина состоит из повторяющихся иммуноглобулин-С2-подобных (IgС2) и фибронектин-3-подобных (FnIII) доменов (Labeit & Kolmerer, 1995) с β-складчатой структурой, содержащих около ста аминокислотных остатков (Improta et al., 1996; Muhle-Goll et al., 1998) (рис. 2). Кроме этих доменов тайтин содержит уникальные последовательности, расположенные по всей длине его молекулы: киназный домен вблизи М-линии саркомера; два участка связывания с кальпаиновой протеазой (р94) в I-диске и М-линии саркомера, а также эластичные N2B, N2A и PEVK элементы в I-диске саркомера. В концевых областях молекулы тайтина расположены фосфорилируемые участки.

1.2 Структура и функции молекул С-белка, Х-белка и Н-белка

Предположение о присутствии белков немиозиновой природы в структуре толстых, или миозин-содержащих нитей на основании электронно-микроскопических и рентгеновских исследований высказывались давно (Draper & Hodge 1949; Franzini-Armstrong & Porter 1964; Pepe 1967; Hanson et al., 1971), однако до начала 70-х годов природа этих белков была неизвестна. С-белок, Х-белок и Н-белок были обнаружены с помощью ДСН-гель-электрофореза как минорные примеси в препаратах миозина скелетных мышц кролика (Starr & Offer, 1971). В настоящее время эти белки охарактеризованы, и их количество в саркомере составляет около 5% от массы миозина.

С-белок впервые был выделен из скелетных мышц кролика (Offer et al., 1973). Его количество составляет около 2% от массы миофибрилл и около 4% от массы толстой нити.

Показана способность сердечного С-белка фосфорилироваться разными протеинкиназами в условиях in vivo и in vitro (Jeacocre & England, 1980; Hartzell & Titus, 1982; Hartzell & Glass, 1984; Hartzell, 1985; Lim et al., 1985; Gautel et al., 1995; Mohamed et al., 1998). Молекулярный вес С-белка скелетных мышц по данным ДСН-гель-электрофореза 135 кДа (Yamamoto & Moos, 1983; Starr & Offer, 1983), а по данным анализа нуклеотидной последовательности генов, кодирующих этот белок, составляет 128.1 кДа (Weber et al., 1993). Аминокислотный состав белка характеризуется довольно высоким содержанием пролина, что коррелирует с низким содержанием α-спирали в его молекуле. Методом седиментации показано, что С-белок связывается с высоким сродством с миозином (Callaway & Bechtel, 1981; Yamamoto & Moos, 1983). Электронно-микроскопические исследования подтвердили это связывание для С-белка: он декорирует реконструируемые миозиновые нити и паракристаллы легкого меромиозина (ЛММ) in vitro (Moos et al., 1975; Starr & Offer, 1978; Safer & Pepe, 1980; Фрейдина и др., 1980; Подлубная, 1981; Podlubnaya et al., 1990). Показана способность С-белка связываться с актином (Moos et al., 1976; Moos et al., 1978; Moos, 1981; Фрейдина и др., 1980) и тайтином (Koretz et al., 1993; Soteriou et al., 1993; Fьrst et al., 1992; Freiburg & Gautel, 1996). При снижении ионной силы ниже физиологических значений (μ ≤ 0.1).

Х-белок содержится в грубых препаратах С-белка, выделенного из миозина хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе (Starr & Offer 1982). Был разработан метод разделения Х- и С-белков с помощью колоночной хроматографии на гидроксиапатите (Starr & Offer 1982; Starr et al., 1979). Молекула Х-белка представляет собой гибкую ниточку длиной около 30–35 нм и диаметром 3–4 нм (Bennett et al., 1985). Молекулярный вес Х-белка скелетных мышц кролика по данным ДСН-гель-электрофореза составляют и 145–152 кДа (Yamamoto & Moos 1983; Starr & Offer 1983), а по данным анализа нуклеотидной последовательности генов, кодирующего этот белок, составляют 126.5 кДа (Weber et al., 1993).

Аминокислотный состав характеризуется высоким содержанием пролина, что соответствует низкому (4%) содержанию α-спирали.

Н-белок выделен из скелетных мышц кролика, точнее – из грубых препаратов С-белка, хроматографией на гидроксиапатите (Starr & Offer, 1982; 1983). Он составляет 0.3–0.4% от миофибриллярной массы. Молекула Н-белка содержит одну полипептидную цепь с молекулярным весом по данным ДСН-гель-электрофореза ~ 69–74 кДа (Starr & Offer, 1983), а по данным другого метода ~ 86 кДа (Vaughan et al., 1993). Молекулярный вес Н-белка скелетных мышц цыпленка и человека по данным анализа нуклеотидной последовательности генов, кодирующего этот белок, составляет 58.4 кДа и 51.9 кДа, соответственно (Vaughan et al., 1993). Аминокислотный состав Н-белка сходен с аминокислотным составом С-белка, но отличается от последнего более высоким содержанием пролина и аланина и более низким содержанием аспарагиновой кислоты, валина и лизина (Yamamoto, 1984). Молекула Н-белка содержит около 4% α-спирали (Starr & Offer, 1983). Н-белок взаимодействует с миозином и с актином (Starr & Offer, 1983).

Белки семейства тайтина могут участвовать в сборке толстых нитей и стабилизации их структуры. Известно, что С-белок, также как и тайтин (Wang & Wright, 1988), появляется в мышечной клетке на ранних стадиях миофибриллогенеза (Bahler et al., 1985). Имеются также данные о влиянии тайтина, С-белка и Х-белка на формирование миозиновых нитей in vitro (Koretz, 1979; Miyahara & Noda, 1980; Koretz et al., 1982; Вихлянцев 2005). Вероятно, что С-белок (вместе с тайтином) участвует в сборке и стабилизации структуры толстых нитей. Исследования in vitro показали, что Н-белок влияет на связывание С-белка с миозином (Yamamoto, 1984). Показано связывание С-белка и тайтина с актином в условиях in vitro. Предполагается, что физиологическое значение этого связывания в саркомерах скелетных мышц заключается в регуляции актин-миозинового взаимодействия. В экспериментах in vitro показано, что тайтин и С-белок активируют АТФазу актомиозина. Это влияние может быть обусловлено как модифицирующим действием С-белка и тайтина на миозиновый мостик, так и прямым их взаимодействием с актином (Moos et al., 1978, 1980; Moos, 1981; Muhle-Goll et all., 2001; Moolman-Smook et al., 2002; Squire et al., 2003). Х-белок и Н-белок также могут быть вовлечены в процесс мышечного сокращения, ингибируя АТФ-азную активность актомиозина (Yamamoto, 1984, Вихлянцев, 2005). В поддержку предположения о регуляторной роли С-белка в сократительной активности являются данные о фосфорилировании С-белка сердечной мышцы. В ранних исследованиях было показано, что уровень фосфорилирования С-белка в интактном сердце коррелирует со скоростью релаксации мышцы (Hartzell & Glass, 1984). In vitro фосфорилирование сердечного С-белка приводило к снижению его активирующего эффекта на АТФазу АМ (Hartzell, 1985). На основе полученных данных автором было сделано предположение, что С-белок участвует в механизме расслабления сердечной мышцы. Однако результаты дальнейших исследований показали, что фосфорилирование С-белка модулирует процесс сокращения сердечной мышцы, увеличивая доступность миозиновых головок к актину (Weisberg & Winegrad, 1996, 1998; Kunst et al., 2000; McClellan et al., 2001; Kulikovskaya et al., 2003; McClellan et al., 2004; Flashman et al., 2004). Действительно, согласно последним данным фосфорилирование сердечного С-белка приводит к усилению сократительной активности мышцы (Stelzer et al., 2006).

1.3. Белки семейства тайтина в норме, при адаптации и патологии

Структурно-функциональные свойства белков семейства тайтина в норме описаны выше. Эти белки являются важными компонентами сократительного аппарата мышечной клетки, участвуя в построении и стабилизации структуры саркомера. Влияние белков семейства тайтина на АТФазу актомиозина указывает на их важную регуляторную функцию в норме.

Поведение белков семейства тайтина при адаптации рассматривается на примере гибернации (зимней спячки). Показано, что у гибернирующего животного уменьшается площадь поперечного сечения мышечных волокон. Изменения структурно-функциональных свойств миозин-содержащих нитей скелетных мышц вносят вклад в подавление двигательной активности животного при зимней спячке (Лукоянова и др., 1996). В скелетных мышцах гибернирующих животных обнаружено снижение активирующего влияния тайтина и С-белка и увеличение ингибирующего влияния Х-белка на ферментативные и регуляторные свойства миозина (Вихлянцев и др., 2000; 2002).

Поскольку причину развития ДКМП большинство исследователей видит в повреждении сократительных структур миокарда, а условия микрогравитации приводят к «гипогравитационному мышечному синдрому» (Гуровский и др., 1975; Nemirovskaya et al., 2002), становится вполне понятным пристальное внимание исследователей к этим патологическим состояниям. Показано, что пребывание в условиях моделируемой микрогравитации приводит к уменьшению количества тайтина и Х-белка в m. soleus крыс и человека, что, наряду с другими изменениями в мышечном аппарате, будет вносить вклад в развитие «гипогравитационного мышечного синдрома» (Вихлянцев и др., 2006). Увеличение содержания тайтина в миокарде левого желудочка человека при ДКМП приводит к снижению уровня пассивного напряжения одиночных миофибрилл и волокон, что отражается на сократительной функции сердца (Макаренко и др., 2002, Макаренко, 2004).

Данные, полученные при исследовании свойств полифункциональных белков семейства тайтина в норме, при адаптации и заболеваниях дают основание предполагать, что изменения их структурно-функциональных характеристик может вносить вклад в развитие патологических процессов в мышцах. Выяснение роли тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка в патогенезе разных болезней является чрезвычайно актуальной задачей. В данной работе объектом нашего внимания являлись амилоидозы и, в частности, амилоидные свойства этих белков in vitro.

Глава 2. Амилоидозы

2.1. Актуальность проблемы

Амилоидозы – болезни, которые характеризуются отложениями нерастворимых фибрилл белка (амилоидных фибрилл) в разных органах и тканях, образующихся в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белков. Амилоидные отложения играют центральную роль в патогенезе болезней, от которых страдают миллионы пациентов (болезнь Альцгеймера, Паркинсона, Дауна, диабет II типа, наследственная амилоидная полинейропатия, системные амилоидозы, прионные амилоидозы и др.) (Uversky & Fink, 2004). Однако, процессы, лежащие в основе аномальной агрегации белка и ее патологического проявления при болезнях, изучены еще недостаточно.

Амилоидоз широко распространен среди многих представителей животного мира. Описаны первичные (идиопатические), вторичные (приобретенные), наследственные и старческие его формы (Виноградова, 1980). Амилоидные отложения могут достигать килограммов (как, например, фибриллярные скопления лизоцима в печени). Они найдены также в сердечной мышце при кардиомиопатиях, миокардитах и в скелетных мышцах при миозитах (Барсуков и др., 2005). При миокардитах (воспалительное поражение сердечной мышцы) амилоид имеет вид россыпи. Возможно тотальное поражение сердца или только предсердий, только желудочков или клапанов. При кардиопатическом амилоидозе амилоид откладывается в эндо-, мио- и эпикарде. Отложения амилоида в сердце приводят к резкому увеличению его размеров (амилоидная кардиомегалия). Оно становиться очень плотным, миокард приобретает сальный вид («резиновый миокард»). Миозит с включенными тельцами (амилоидами) сопровождается изнурительными мышечными болями. Амилоидные отложения обнаружены в скелетных мышцах, в миокарде, и по ходу межмышечной соединительной ткани, а также в стенках сосудов и нервах. Мышцы становятся плотными, полупрозрачными (Виноградова, 1980).

Уже сейчас амилоидозы – главная причина смерти после сердечно-сосудистых и раковых заболеваний. Диагностика большинства из них посмертная. Генезис этого заболевания, при котором возможно поражение любых органов и тканей и, следовательно, возникновение разнообразной клинической симптоматики, остается до конца не изученным. Возможно, причиной является спонтанное развитие амилоидоза, или наследственная передача болезни. Патогенез амилоидоза не уточнен, клинические проявления весьма пестрые и не всегда четко очерчены, лечение малоэффективно и редко диагностируется при жизни. Выяснение молекулярных механизмов амилоидозов, установление белковой природы депозитов и их свойств, развитие терапевтических методов лечения и предупреждения этих заболеваний, а также разработка их прижизненной диагностики являются актуальными задачами.

2.2. История изучения амилоидозов

Первое описание амилоидоза у человека относится к XVII веку, когда Боне сообщил результаты наблюдения больного с абсцессом печени и громадной селезенкой, содержащей множество белых камней (саговая селезенка). Дальнейшую историю изучения амилоидоза можно разделить на три этапа. Начало первого этапа связано с именем венского патолога Рокитанского (1842 г.), открывшего «сальную болезнь», развивающуюся у больных туберкулезом, сифилисом, риккетсиозами. Позже, как выяснил Меккель (1853 г.), «сальная», или «холестериновая» болезнь обычно является второй болезнью и может поражать многие органы. В 1854 г. немецкий физиолог Вирхов на основании характерного прокрашивания патологических структур мозга йодом, решил, что образующиеся массы имеют углеводную природу – «подобны крахмалу» и ввел термин «амилоид», происходящий от латинского «амилум» и от греческого «амилон». Через несколько лет Фридрайх и Кекуле на основании химического анализа доказали белковую природу амилоидного вещества, однако термин «амилоид», «амилоидоз» сохранился до настоящего времени. Второй этап изучения амилоидоза относится к 20-м годам XX столетия, когда Бенхольд (1922 г.) предложил окраску амилоида Конго красным, обнаружив эффект двойного лучепреломления в поляризованном свете. Этот эффект указывает на тот факт, что амилоидные образования представляют собой упорядоченные микроскопические структуры. Данный метод впоследствии стал первым диагностическим тестом для определения амилоидов в клинической практике. В 1959 г. Коген и Калкинс с помощью электронной микроскопии установили, что все типы амилоида человека и экспериментальных животных имеют фибриллярную структуру (Sipe & Cohen, 2000). Амилоид оказался образованием, в котором фибриллярные белки связаны с полисахаридами и другими компонентами. Приблизительно с 60-х годов начался третий этап в изучении амилоидозов, совпавший с бурным развитием техники, в том числе и медицинской. Благодаря использованию электронной микроскопии, спектральных, иммунологических, химических, разнообразных клинических методов удалось получить много данных о природе и свойствах амилоида и его ультраструктуре. Было показано, что амилоидные отложения во многих органах человека и животных имеют сходную фибриллярную структуру: фибриллы 6–13 нм в диаметре и длиной 100 нм – 1.6 мкм. Фибрилла может состоять из двух и большего количества нитей (протофибрилл), соприкасающихся или перекручивающихся друг с другом (Shirahama & Cohen, 1967; Suzuki & Terry, 1967). С помощью рентгеноструктурного анализа и инфракрасной микроскопии показано, что для амилоидных фибрилл при всех известных вариантах амилоидоза характерна складчатая упаковка полипептидных цепей, именуемая β-складчатой структурой (Glenner et al., 1974).

2.3. Современные представления о строении и формировании амилоидных фибрилл

Амилоидные отложения состоят из фибриллярных белков связанных с полисахаридами и другими компонентами. Физико-химические особенности амилоида определяют его тинкториальные свойства, выявляемые при использовании красителя Конго красного, тиофлавина Т или S.

Таким образом, термин «амилоидоз» объединяет болезни, которые характеризуются отложением белковых масс, имеющих фибриллярную ультраструктуру и обладающих двойным лучепреломлением в поляризованном свете. Значительный прогресс в выяснении структурных свойств амилоидных фибрилл был сделан с помощью рентгеновской дифракции фибриллярного материала, выделенного из биологических тканей, а также сформированного in vitro (Blake et al., 1996; Blake & Serpell, 1996; Sunde & Blake, 1997). Эти исследования показали, что все амилоидные фибриллы имеют β-складчатую структуру с отдельными β-слоями, ориентированными параллельно главной оси фибриллы. Это означает, что белок-предшественник амилоидов, не имеющий такой структуры, подвергается молекулярным перестройкам.

На сегодняшний день известно более 20 белков, образующих амилоидные фибриллы in vivo и участвующих в патогенезе амилоидозов (таблица 2), а также белки, амилоиды которых изучены только in vitro (таблица 3) (Uversky & Fink 2004). Аβ-пептид, инсулин, лизоцим, транстиретин, амилин, хантингтин, тау-белок, α-синуклеин, миоглобин, и другие различаются между собой по аминокислотным последовательностям, вторичным и третичным структурам. Однако, несмотря на это, образованные ими амилоидные фибриллы имеют β-складчатую структуру. Эксперименты in vitro со многими белками показали, что перед образованием амилоидов структура их молекул должна претерпевать трансформацию типа «α-спираль – β-складчатость», что, как правило, требует длительной инкубации и жестких условий, несовместимых с условиями in vivo: низкие значения рН, высокие температуры, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и т.п., Белки-предшественники амилоидов могут иметь β-структуру, или α-спираль или содержать обе структуры. Переход растворимой формы прионного белка в фибриллярную сопровождается уменьшением содержания α-спирали и увеличением β-структуры. Аβ-пептид при образовании амилоидных фибрилл также претерпевает трансформацию структуры от α-спирали к β-структуре. Все эти данные указывают на то, что белки, вторичная структура которых представлена α-спиралью, претерпевают трансформацию типа «α-спираль – β-структура» до или во время образования фибрилл. Однако процесс фибрилообразования не всегда требует перехода α-спирали в β-структуру. Так, белок транстиретин представляет собой тетрамер, где каждая субъединица содержит только β-структуру, а молекула α-синуклеина в нативной форме представляет собой развернутую структуру. К таким белкам можно отнести и исследуемые нами белки семейства тайтина, содержащие >90% β-cкладчатости.

Таблица 2.

Амилоидогенные белки и пептиды участвующие в патогенезе амилоидозов (см. ссылки в обзоре Uversky & Fink 2004).

Продолжение таблицы 2.

Таблица 3.

Амилоидогенные белки и пептиды, к настоящему времени не связанные с болезнями (см. ссылки в обзоре Uversky & Fink 2004).

Процесс олигомеризации и фибриллообразования происходит при взаимодействии молекул белка за счет электростатических, водородных и гидрофобных взаимодействий с образованием димеров – начальных строительных блоков (рис. 4). Например, значительный вклад в фибриллогенез Аβ-пептида вносят гидрофобные взаимодействия. Дальше димеры олигомеризуются в тетрамеры, октамеры и т. д. с образованием протофибрилл шириной 2–3 нм и длиной до 200 нм. Эти образования накапливаются в лаг-фазе, характерной для кинетики фибриллообразования. Окончание лаг-фазы связано с образованием протофибриллами фибрилл диаметром 7–8 нм. События, происходящие в лаг-фазе, представляют большой интерес, так как именно на этой стадии с помощью микроскопа можно наблюдать кинетику фибриллогенеза, а также морфологию постепенно формирующихся агрегатов (т. е. динамику процесса) (Zerovnik, 2002). Причем, один и тот же белок может образовывать амилоидные агрегаты разной морфологии, т. е. обладать полиморфизмом, как например, Аβ(1-40)-пептид, который образует зрелые структуры разного типа (рис. 5), такие как «ветвящиеся», «спиральные» и «ленточные» (Goldsbury et al., 2000). Полиморфизм был показан и для других белков, таких как амилин (Goldsbury et al., 1997), кальцитонин (Bauer et al., 1995), инсулин (Jimenez et al., 2002).

Рис. 4. Образование амилоидных фибрилл: (а) – нативная структура белка, (б) – промежуточное состояние, в котором части полипептидной цепи находятся в ненативной конформации, (в) – полностью развернутое состояние, (г) – образование межмолекулярного β-слоя, опосредованное развернутыми областями приводит к олигомеризации белка, (д) –дальнейшее образование β-складчатой структуры, (е) – образование протофибрилл, (ж) –формирование зрелых фибрилл (Jobansson, 2003).

Чемберлейн в 2000 г. показал, что фибриллы, образованные различными белками, обладают сходными структурными свойствами: все они образованы из протофибриллярных нитей, имеющих 2–5 нм в диаметре и содержащих от двух до пяти β-слоев. При этом размеры протофибрилл никак не связаны с количеством аминокислотных остатков белка-предшественника фибриллообразования. Так протофибриллы SH3 домена, включающего 90 аминокислотных остатков, состоят из двух β-слоев, а лизоцим, состоящий из 130 аминокислотных остатков, образует протофибриллярные нити, содержащие четыре β-слоя (Chamberlain et al., 2000).

2.4. Изучение амилоидных фибрилл in vitro

Первоначально, амилоидные фибриллы изучали, выделяя их из пораженных амилоидных отложений. В настоящее время для изучения амилоидных фибрилл, а также амилоидогенеза их формируют in vitro. Открытие того, что амилоидные фибриллы формируют не только белки, связанные с амилоидозами, значительно расширило эту область исследования (Dobson, 1999). Было показано, что при подходящих условиях образовывать амилоидные фибриллы in vitro могут многие белки, такие как лизоцим, миоглобин, Аβ пептид, амилин, тау-белок, хангтингтин, мышечная ацилфосфатаза и др. (Uversky & Fink 2004).

Отмечено, что амилоидогенные белки обладают различными способностями к формированию амилоидов, что отражается также в различной скорости этого процесса. Например, мышечная ацилфосфатаза человека способна формировать аморфные агрегаты после первых часов инкубации и только через 45 дней появляются пучки фибрилл (Chiti et al., 1999) (рис. 6). Аβ(1-40)-пептид после 4 часов инкубации образует аморфные агрегаты, и только после 48 часов – длинные фибриллы (Qahwash et al., 2003), а образование фибрилл α-лактальбумина занимает несколько дней (Goers et al., 2002).

За скоростью амилоидогенеза наблюдают с помощью классического амилоидного красителя тиофлавина Т, который специфически взаимодействует с амилоидными фибриллами (Krebs et al., 2005). При взаимодействии тиофлавина Т с амилоидными фибриллами происходит увеличение интенсивности флуоресценции красителя при спектрофлуорометрических измерениях и наблюдается желто-зеленая флуоресценция при флуоресцентно-микроскопических исследованиях. Молекула красителя состоит из бензтиазольного и аминобензольного колец свободно вращающихся вокруг общей С–С связи. Кребс и соавторы показали, что молекула тиофлавина Т связывается с амилоидными фибриллами специфически (Krebs et al., 2005). Они предположили, что связывание происходит в «каналах», которые тянутся вдоль β-слоев (рис. 7). Более того, тиофлавин Т связывается с амилоидными фибриллами так, что их молекулы параллельны друг другу и расположены вдоль длинной оси фибриллы (Krebs et. al., 2005). Было показано, что причиной возрастания интенсивности флуоресценции тиофлавина Т при его связывании с амилоидными фибриллами является жесткость окружения, препятствующая повороту бензтиазольного и аминобензольного колец молекулы друг относительно друга в возбужденном состоянии (Воропай и др., 2003).

Другой амилоидный краситель Конго красный также специфически взаимодействует с амилоидными фибриллами (Klunk et al., 1989). Конго красный – сульфонированый азокраситель с гидрофобной центральной частью, состоящей из бифенильной группы, расположенной между отрицательно заряженными концами молекулы красителя (рис. 8). При связывании Конго красного с амилоидными фибриллами наблюдается зеленое двойное лучепреломление в поляризационном микроскопе, и это свойство делает Конго красный наиболее используемым красителем для диагностики амилоидов. В спектральных исследованиях регистрируется сдвиг спектра поглощения Конго красного в состоянии, связанном с амилоидными фибриллами, в длинноволновую область спектра, а именно от ~490 нм к ~500 нм.

Рис. 8. Модель связывания Конго красного с амилоидными фибриллами. Показан антипараллельный слой, где каждая пятая цепочка белка имеет одинаковое N–C направление. Поэтому, молекула Конго красного может связываться с таким же типом аминокислоты в обеих полипептидных цепях (первой и пятой, как указано на рисунке). Следующая молекула красителя сможет связаться с третьей и седьмой цепочкой и т.д. (Klunk et al., 1989).

Связывание амилоидных фибрилл с Конго красным зависит от структуры амилоидных фибрилл, а именно от наличия β-складчатой структуры с отдельными β-слоями. Кланк и соавторы предложили модель связывания амилоидных фибрилл с Конго красным посредством связей между двумя отрицательно заряженными сульфоновыми группами Конго красного и двумя положительно заряженными аминокислотными остатками двух отдельных белковых молекул, которые определенным образом ориентированы в β-складчатой структуре фибрилл, образованной посредством бок о бок расположенных отдельных молекул (Klunk et al., 1989). Это означает, что белковые цепочки расположены на расстоянии 4.7 Е. Более того, каждая пятая цепочка расположена от первой на расстоянии 19 Е. Это, приблизительно, соответствует расстоянию между сульфоновыми группами КК (рис. 8). Данная модель показывает специфичность взаимодействия Конго красного с амилоидными фибриллами.

2.5. Патологические проявления амилоидозов

К настоящему времени выделяют следующие формы амилоидозов (Мягкова, 2000):

первичный (идиопатический) амилоидоз – развивается вследствие невыясненных причин;

вторичный (приобретенный) амилоидоз – развивается как осложнение после хронических заболеваний, при которых происходит распад тканей (туберкулез, бронхоэктатическая болезнь, хронический остеомиелит и др.);

наследственный (генетический, семейный) амилоидоз – врожденное нарушение белкового обмена;

старческий амилоидоз.

С другой стороны, амилоидоз разделяют на системный и локальный. Однако классификация системного амилоидоза основана на специфичности основного амилоидного белка.

Внешний вид органов при амилоидозе зависит от степени развития процесса. Если амилоидные отложения небольшие, внешний вид органа изменяется мало и амилоидоз обнаруживается лишь при гистологическом исследовании. При выраженном амилоидозе орган увеличивается в объеме, становиться очень плотным и ломким, а на срезе имеет своеобразный восковидный или сальный вид.

До сих пор остается нерешенным вопрос, касающийся механизма действия амилоидных фибрилл на органы и ткани. Исследования последних лет показали, что амилоидные агрегаты разных белков и пептидов вызывают нарушение жизнедеятельности клеток и их гибель. Как оказалось, цитотоксические свойства проявляют все амилоидные белки (Hashimoto et al., 2003; Qahwash et al., 2003; Sirangelo et al., 2004; Lee et al., 2006), однако неизвестно, чем обусловлена цитотоксичность этих агрегатов – механическим повреждением клеток, связанным с накоплением амилоидных отложений или особым молекулярным механизмом их взаимодействий внутри клетки.

цель исследования

Выяснение способности саркомерных белков семейства тайтина формировать амилоидные фибриллы in vitro.

задачи исследования

Изучить агрегационные свойства саркомерных белков семейства тайтина (тайтин, Х-, С- и Н-белки) in vitro.

Изучить агрегационные свойства Аβ(25-35)-пептида в сравнении с агрегацией молекул Х-белка.

Проверить амилоидную природу агрегатов, образуемых исследуемыми белками, поляризационной, флуоресцентной микроскопией и спектральными методами.

Изучить скорость образования амилоидных фибрилл.

Глава 3. Материалы и методы исследования

3.1. Экспериментальный и клинический материал

Экспериментальный материал: скелетные мышцы и миокард кролика.

Клинический материал: образцы миокарда пациента при ДКМП, взятые при проведении операции по пересадке сердца. Образцы миокарда человека были предоставлены ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава (г. Москва).

3.2. Выделение и очистка белковых препаратов

3.2.1. Очистка С-белка, Х-белка и Н-белка

Х-белок, С-белок и Н-белок очищали по методу (Offer et al., 1973). Фракции Х-, С- и Н-белков, полученные при хроматографической очистке миозина скелетных мышц на колонке с носителем DEAE-Sephadex А-50, концентрировали сульфатом аммония до степени насыщения 2.08 М и осаждали центрифугированием в течение 1 часа при 3000 g. Осадок растворяли в буфере, содержащем 0.3 M KCl, 4.8 мM K2HPO4, 5.2 мM KH2PO4, 0.1 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, pH 7.0, и диализовали против этого буфера до полного удаления сульфата аммония. Разделение белков проводили на колонке с гидроксиапатитом, уравновешенным в этом же буфере, для снятия белков с колонки использовали фосфатный градиент. Такая же процедура очистки применялась и для С-белка миокарда кролика и человека.

3.2.2. Выделение тайтина из скелетных мышц

Тайтин из скелетных мышц кролика выделяли по методу (Soteriou et al., 1993) с модификациями. Мышцы гомогенизировали в 3-х кратном (по отношению к массе мышц) объеме раствора, содержащего 50 мМ KCl, 5 мM ЭГТА, 1 мM NaHCO3,, 1 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, pH 7.0. Для уменьшения деградации тайтина в процессе выделения в раствор добавляли набор ингибиторов протеаз: 1 мM PMSF, 20 мкг/мл ингибитора трипсина, 10 мкг/мл леупептина.

Полученный мышечный гомогенат центрифугировали в течение 5–10 минут при 2500 g. Супернатант отбрасывали, а процедуру промывки повторяли 5–6 раз. К промытому осадку добавляли 2-х кратный объем экстрагирующего раствора, содержащего 0.9 М KCl, 2 мM MgCl2, 2 мM ЭГТА, 0.5 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, 1 мM PMSF, 10 мM имидазола-HCl, pH 7.0. Раствор также содержал 40 мкг/мл соевого ингибитора трипсина и 20 мкг/мл леупептина.

Экстракция проводилась на льду при 4˚С в течение 10–15 минут при непрерывном перемешивании. Экстракт осветляли в течение 40 минут при 14000 g и супернатант разбавляли в 3 раза охлажденной бидистиллированной водой, содержащей 0.1 мM ДТТ и 0.1 мM NaN3, для преципитации актомиозина (конечная ионная сила ~0.2). Через 1 час супернатант осветляли в течение 60 минут при 20000g. Для осаждения тайтина супернатант разбавляли в 5 раз (конечная ионная сила ~0.05) охлажденной бидистиллированной водой, содержащей 0.1 мM ДТТ и 0.1 мM NaN3. Через 40–60 минут осадок, содержащий преимущественно тайтин, собирали центрифугированием в течение 30 минут при 15000 g. Осадок растворяли в минимальном объеме буфера, содержащего 0.6 М KCl, 30 мM KH2PO4, 1 мM ЭГТА, 0.1 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, pH 7.0, и осветляли в течение 60 минут при 20000 g. Тайтин очищали методом гель-фильтрации на колонке с носителем Sepharose–CL2B, уравновешенным в этом же буфере.

3.3. Определение концентрации белковых препаратов

Концентрацию белков определяли спектрофотометрически с помощью спектрофотометра SPECOD UV VIS, используя следующие значения коэффициентов экстинции (Е2801 мг/мл): 0.543 для доколоночного миозина (Kielley & Harrington, 1960); 0.52 для колоночного миозина (Godfrey & Harrington, 1970); 1.08 для актина (Rees & Young, 1967); 1.37 для тайтина (Trinick et al., 1984); 1.09 для Х-белка, С-белка и Н-белка (Starr & Offer, 1982).

3.4. Проверка чистоты белковых препаратов

Чистоту выделенных препаратов миозина и актина скелетных мышц кролика проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза в 13% полиакриламидном геле по методу (Laemmli, 1970).

Чистоту тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза по методу (Fritz et al., 1989) с модификациями. Согласно нашей методике, разделяющий гель содержал 7% полиакриламида вместо 15%, а также 0.75 М трис-HCl буфер, pH 8.8, 0.1% ДСН, 10% глицерина, 0.05% тетраметилэтилендиамина и 0.05% персульфата аммония. Кроме этого, вместо концентрирующего геля с содержанием полиакриламида 5% согласно (Fritz et al., 1989) применялся концентрирующий гель по методу (Laemmli et al., 1970), содержащий 2.6–2.8% полиакриламида (соотношение акриламида к бис-акриламиду 36.5:1). Эти модификации способствовали лучшему фокусированию белковых полос в геле. Концентрирующий гель также содержал 0.125 М трис-HCl буфер, pH 6.8, 0.1% ДСН, 0.05% тетраметилэтилендиамина и 0.05% персульфата аммония. Модифицированный нами метод ДСН-гель-электрофореза позволил проводить электрофоретическое разделение белков с молекулярным весом от 3 МДа до 100 кДа, что дало возможность исследовать совместное поведение тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка.

Электродный буфер при проведении электрофореза содержал 0.192 М глицина, 0.025 М трис и 0.1% ДСН, рН 8.3. Электрофорез проводили при токе 3–5 мА первые 30–60 минут, после этого поднимали напряжение до 12–15 мА. По окончании электрофореза гели фиксировали в растворе, содержащем 10% этанола и 10% уксусной кислоты, в течение 20–30 минут. Затем гели окрашивали в течение 30–40 минут в растворе, содержащем 0.1% кумасси G-250 и R-250 (смешанных в пропорции 1:1), 45% этанола и 10% уксусной кислоты. Отмывка окрашенных гелей проводилась в 7% уксусной кислоте при постоянном перемешивании на качалке в течение 40–50 мин.

3.5. Условия формирования амилоидных фибрилл

Амилоиды формировали диализом растворов белков в течение 20 часов при 4-37°С против растворов, содержащих: 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.15 М глицин-КОН, рН 7.0; 0.15 М глицин-KOH, рН 7.5; 25 мМ NaCI, 10 мМ Hepes, pH 7.0; 50 мM NaCl, 10 мM Hepes, pH 7.0; 30 мМ MgCI2, 10 мМ имидазола, pH 7.0; 50 мM MgCl2, 10 мM имидазола, pH 7.0.

Для исследования скорости амилоидообразования раствор Х-белка диализовали против буфера, содержащего 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0 при температуре 4˚С. Через определенные промежутки времени отбирали пробы для электронно-микроскопических и спектральных исследований. Для экспериментов по исследованию цитотоксичности амилоидных образований Х-белок также инкубировали в растворе, содержащем 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0 при температуре 4˚С.

3.6. Микроскопические исследования

3.6.1 Электронная микроскопия

Для приготовления электронно-микроскопических образцов использовали препараты белков с концентрациями 0.1 мг/мл. Каплю раствора или суспензии белка наносили на медные сетки, покрытые коллодиевой пленкой (2% коллодий в амилацетате фирмы SPI-CHEM, USA), укрепленной углеродом. После удаления избытка суспензии полоской фильтровальной бумаги образцы окрашивали 2% водным раствором уранилацетата.

Электронно-микроскопические исследования проводили на микроскопе JEM-100В при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении 30000х. Увеличение микроскопа было тестировано по паракристаллам парамиозина с периодичностью 14.5 нм.

3.6.2. Поляризационная и флуоресцентная микроскопия

Исследуемые образцы, наносились на предметные стекла и высушивались на воздухе. Образовавшиеся белковые пленки окрашивались 1% водным раствором Конго красного (фирма SIGMA, USA) и затем исследовались на поляризационном микроскопе МКУ-1. Образцы также окрашивались 1% водным раствором тиофлавина Т (фирма SIGMA, USA) и исследовались с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-И 3.

3.7. Спектральные методы

3.7.1. Метод кругового дихроизма

Исследование вторичной структуры белка проводили методом кругового дихроизма. Спектры кругового дихроизма исследуемых белков, до и после образования ими фибрилл, регистрировали на спектрополяриметре Jasco J-600, используя кварцевые кюветы с оптической длиной 0.1 см. Спектры КД были измерены в области 200–250 нм. Обсчет спектров КД в далекой ультрафиолетовой области производился с использованием программы CONTINLL (http://lamar.colostate.edu/~sreeram/CDPro/).

3.7.2. Метод флуоресцентного анализа

Исследование амилоидной природы фибрилл, а также исследование скорости амилоидообразования было проведено с использованием классического флуоресцентного красителя амилоидных структур тиофлавина Т (ТТ). Измерения флуоресценции проводили в растворе красителя (250 мкл) и суспензии фибрилл (250 мкл) в соответствующем буфере (буфер указан в подписях под рисунками в изложении результатов). Молярное соотношение белка к красителю составляло 2:1. Интенсивность флуоресценции раствора регистрировали с помощью спектрофлуориметра PERKIN-ELMER — 44B при длине волны 488 нм и при длине волны возбуждения 420 нм. Ширина щели при возбуждении 5 нм, а при регистрации 10 нм. Из полученных значений интенсивности флуоресценции тиофлавина Т в буфере в присутствии белка вычитали значения интенсивности флуоресценции ТТ в буфере в отсутствие белка, получая интенсивность флуоресценции ТТ, связанного с белком.

3.7.3. Спектрофотометрический метод

Для подтверждения амилоидной природы фибрилл был также использован специфический краситель Конго красный (КК). Суспензию фибрилл (250 мкл) добавляли к раствору КК (250 мкл) в соответствующем буфере (буфер указан в подписях под рисунками в изложении результатов). Молярное соотношение белка к красителю составляло 2:1. Спектры поглощения КК в отсутствие и в присутствии белка регистрировали при 450–650 нм с помощью спектрофотометра SPECORD M 40.

III. Результаты и обсуждение

Глава 4. образование амилоидных фибрилл белками семейства тайтина

4.1. Электронно-микроскопическое изучение агрегационных свойств молекул тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка скелетных мышц кролика

Изучение амилоидогенеза разных белков in vitro проводят в условиях, которые часто не совместимы с условиями in vivo. Для образования амилоидных фибрилл белками семейства тайтина мы использовали условия, близкие к физиологическим. С помощью электронной микроскопии было показано, что исследуемые белки способны формировать разные амилоидные агрегаты, как и другие известные амилоидогенные белки (Chiti et al., 1999; Goldsbury et al., 2000; O’Nuallain et al., 2004; Uversky & Fink, 2004; см. рис. 5, 6).

Результаты электронно-микроскопических исследований представлены на рис. 9–14. Мы показали, что в растворе, содержащем 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0 Х-белок образует спирально скрученные ленточные фибриллы с осевой периодичностью ~60–70 нм, шириной ~40 нм и длиной более 1 мкм (рис. 9 А). Мы обнаружили, что такие же структуры Х-белок образует и в растворе, содержащем 0.15 М глицин-КОН, рН 7.5 (рис. 9 Б). Кроме этого Х-белок, а также С-белок и Н-белок образуют аморфные агрегаты, протофибриллы, линейные фибриллы и пучки линейных фибрилл в растворах: 50 мM NaCl, 10 мM Hepes, pH 7.0; 25 мМ NaCI, 10 мМ Hepes, pH 7.0; 50 мM MgCl2, 10 мM имидазола, pH 7.0; 30 мМ MgCI2, 10 мМ имидазола, pH 7.0; 0.15 М глицин-KOH, рН 7.5 (рис. 10–13).

На рис. 14 представлены электронные микрофотографии пучка линейных фибрилл тайтина скелетных мышц кролика в растворе 0.15 М глицин-KOH, рН 7.5. В этих условиях тайтин образует плотные пучки линейных фибрилл длиной ~3 мкм, шириной до 500 нм и аморфные агрегаты. Мы наблюдали, что аморфные агрегаты, протофибриллы длиной 100–200 нм и диаметром ~3 нм, линейные фибриллы диаметром ~7 нм и пучки линейных фибрилл длиной более 3 мкм и шириной до 500 нм могут присутствовать в одном и том же образце. Это, по-видимому, отражает разные стадии фибриллогенеза, характерные для формирования амилоидов (Kelly, 1998; Chiti et al., 1999; Goldsbury et al., 2000).

Для подтверждения амилоидной природы фибрилл тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка наши дальнейшие исследования были направлены на сравнение агрегатов, образуемых белками семейства тайтина, с агрегатами известных амилоидогенных белков и, в частности, Аβ-пептида, играющего важную роль в патогенезе болезни Альцгеймера.

4.2. Электронно-микроскопическое изучение агрегационных свойств Аβ(25-35)-пептида в сравнении с агрегацией молекул Х-белка

Для сравнения спирально скрученных фибрилл Х-белка с другими амилоидными фибриллами мы изучили агрегационные свойства Аβ(25-35)-пептида. Мы показали, что Аβ(25-35)-пептид, инкубированный в течение 24 ч при 37˚С образует подобно Х-белку (рис. 15 А) спирально скрученные ленты несколько микрон длиной и диаметром 25–27 нм с вариабельным осевым периодом 170–250 нм (рис. 15 Б, В).

Ленты построены из нескольких длинных и узких фибрилл диаметром 3–5 нм. На микрофотографиях они лучше видны, если смотреть вдоль ленты. Обнаруживаются также листовые агрегаты (рис. 15 Г), сформированные за счет боковой агрегации более коротких узких фибрилл. Такие агрегаты достигают в ширину ~50 нм. Таким образом, с помощью электронной микроскопии нами было установлено морфологическое сходство фибрилл Х-белка с амилоидами Aβ-пептида, найденными в мозге при болезни Альцгеймера.

4.3. Подтверждение амилоидной природы агрегатов, образуемых белками семейства тайтина (тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка) при их взаимодействии со специфическими красителями на амилоиды

Конго красным и тиофлавином Т

Основным методом выявления амилоидной природы фибрилл, образуемых разными белками, является их способность взаимодействовать со специфическими красителями Конго красным и тиофлавином Т (Klunk et al., 1989; LeVine, 1993, 1995; Krebs et al., 2005). Именно эти красители используют в клинической практике для определения амилоидных отложений in vivo и для исследования амилоидогенеза in vitro разными белками.

При окрашивании Конго красным фибриллярных структур, формируемых исследуемыми белками, мы наблюдали двойное лучепреломление в поляризационном микроскопе, а при окрашивании их тиофлавином Т – желто-зеленую флуоресценцию в люминесцентном микроскопе. На рис. 16 представлены данные связывания Х-фибрилл, сформированных в растворе, содержащем 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0, с красителями Конго красным и тиофлавином Т.

При спектральных исследованиях интенсивность флуоресценции тиофлавина Т в присутствии фибрилл Х-, Н- и С-белков и тайтина возрастала в ~10, ~9, ~7 и ~5 раз соответственно по сравнению с интенсивностью флуоресценции красителя в присутствии этих белков в молекулярной форме (рис. 17). Незначительное увеличение интенсивности флуоресценции тиофлавина Т наблюдается и в присутствии молекулярных форм тайтина, Х-, С- и Н-белков, что согласуется с литературными данными для белков, содержащих β-складчатую структуру (LeVine, 1993; 1995).

Рис. 17. Интенсивность флуоресценции тиофлавина Т (TT): А – в присутствии молекулярного X-белка (в растворе, содержащем 0.3 M KCl, 10 мМ К-фосфат, рН 7.0) и в присутствии фибрилл X-белка (0.15 М глицин-KOH, рН 7.5); Б – в присутствии молекулярного С-белка (0.3 M KCl, 10 мМ К-фосфат, рН 7.0) и в присутствии фибрилл С-белка (0.15 М глицин-KOH, рН 7.5); В – в присутствии молекулярного Н-белка (0.3 M KCl, 10 мМ К-фосфат, рН 7.0) и в присутствии фибрилл Н-белка (0.15 М глицин-KOH, рН 7.5); Г – в присутствии молекулярного тайтина (0.6 М KCl, 30 мМ KH2PO4, рН 7,0) и в присутствии фибрилл тайтина (0.15 М глицин-KOH, рН 7.5). Молярное соотношение красителя и белка 1:2.

При измерении спектральных характеристик раствора Конго красного в присутствии фибрилл тайтина, Х-, С- и Н-белков наблюдался сдвиг спектра поглощения красителя в длинноволновую область от ~490 нм к ~500 нм (рис. 18), что также является характерной чертой при связывании амилоидных фибрилл с Конго красным (Klunk et al., 1989).

Рис. 18. Спектры поглощения свободного красителя показаны линиями красного цвета. Спектры поглощения красителя Конго красного (линия синего цвета): А – в присутствии фибрилл X-белка (в растворе, содержащем 0.15 М глицин-KOH, рН 7.5); Б – в присутствии фибрилл С-белка (0.15 М глицин-KOH, рН 7.5); В – в присутствии фибрилл Н-белка (0.15 М глицин-KOH, рН 7.5); Г – в присутствии фибрилл тайтина (0.15 М глицин-KOH, рН 7.5). Молярное соотношение красителя и белка 1:2.

Проведенные исследования указывают на специфичность связывания красителей с фибриллярными агрегатами, образуемыми белками семейства тайтина, подтверждая их амилоидную природу.

4.4. Изучение вторичной структуры тайтина и белков его семейства до и после образования амилоидных фибрилл

В работах по изучению образования амилоидных фибрилл белками in vitro используется длительная икубация и условия, несовместимые с условиями in vivo (денатурирующие вещества, низкие значения рН, высокие температуры, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и т.п.) (Stine et al., 2003). Как известно, эти условия приводят к трансформации структуры молекулы белка с образованием β-складчатости, характерной для амилоидных фибрилл. (Juzczyk et al., 2005). Согласно литературным данным (Labeit & Kolmerer, 1995; Weber et al., 1993; Vaughan et al., 1993), молекулы белков семейства тайтина уже содержат β-складчатую структуру. Нами были проведены исследования вторичной структуры белков до и после образования ими амилоидных фибрилл. Как показано на рис. 20 молекулярные и фибриллярные формы Х-, С- и Н-белков характеризуются сходными спектрами кругового дихроизма (КД). Форма спектров фибрилл свидетельствует в пользу того, что в их составе практически отсутствуют α-спиральные участки, а преобладающими элементами являются β-складки. Молекулярная форма тайтина содержит ~10% α-спирали. После образования амилоидных фибрилл молекула тайтина содержит только β-структуру (рис. 19).

Рис. 19. Спектры кругового дихроизма (КД) в дальней Уф-области: А – Х-белка;

Б – С-белка; В – Н-белка; Г – тайтина. Спектры КД молекулярных форм Х-, С-, Н-белков (в растворе, содержащем 0.3 M KCl, 10 мМ К-фосфат, рН 7.0) и молекулярной формы тайтина (0.6 М KCl, 30 мМ KH2PO4, рН 7.0) показаны линией красного цвета. Спектры КД фибрилл Х-, С-, Н-белков и тайтина (0.15 М глицин-KOH, рН 7.5) показаны линией синего цвета.

Понятно, что при наличии у этих белков β-складчатой структуры, необходимой для образования амилоидных фибрилл, облегчается процесс формирования ими амилоидов in vitro и увеличивается опасность их быстрого роста в клетке.

4.5. Скорость образования амилоидных фибрилл Х-белка

Процессы формирования амилоидных фибрилл разными белками in vitro характеризуются разной скоростью (Kim et al., 2002; Stine et al., 2003; Hwang et al., 2004). Скорость фибриллообразования может зависеть от многих факторов: состава растворов, температуры, рН, и др. Но наибольшее влияние оказывает, скорее всего, тип вторичной структуры белка. Если белок содержит высокий процент α-спирали, то требуется трансформация типа «α-спираль – β-складчатость» (рис. 4). Так как белки семейства тайтина уже содержат β-складчатую структуру, то нет необходимости в изменении вторичной структуры. Скорость образования амилоидных структур белками семейства тайтина была продемонстрирована на примере Х-белка, так как он образует наиболее упорядоченные амилоидные структуры и методом электронной микроскопии можно визуально оценить, как происходит процесс фибриллообразования. Параллельно скорость образования амилоидных фибрилл Х-белком оценивалась по их связыванию с флуоресцентным красителем тиофлавином Т, который широко используется в качестве маркера амилоидов (LeVine, 1993).

В образцах белка происходило накопление их амилоидных структур, о чем свидетельствует возрастание флуоресцентного сигнала тиофлавина Т. Результаты представлены на рис. 20. Не происходит значительного увеличения интенсивности флуоресценции тиофлавина Т при связывании с Х-белком в первые часы инкубации (1–4 часа), так как фибриллы еще не сформированы, а присутствуют аморфные агрегаты (рис. 20 А). При дальнейшей инкубации интенсивность флуоресценции тиофлавина Т возрастала (рис. 20 Г), что соответствовало образованию амилоидных фибрилл, среди которых наблюдаются и аморфные агрегаты (рис. 20 Б). После 22 часов диализа интенсивность флуоресценции красителя при связывании с фибриллами достигала плато флуоресцентной кривой, что согласуется с данными электронной микроскопии: отмечается присутствие хорошо сформированных спирально скрученных ленточных фибрилл Х-белка (рис. 20 В). Они наблюдаются и после 26 часов диализа.

Рис. 20. А – аморфные агрегаты Х-белка (4 часа диализа), Б – линейные фибриллы и аморфные агрегаты Х-белка (17 часов диализа), В – спирально скрученные ленточные фибриллы Х-белка (22 часа диализа), сформированные в растворе, содержащем 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0. Негативное окрашивание 2% раствором уранилацетата. Шкала 100 нм. Г – скорость образования амилоидных фибрилл Х-белка.

Для многих амилоидогенных белков также характерна временная зависимость образования амилоидных фибрилл. Например, мышечная ацилфосфатаза способна формировать аморфные агрегаты после первых часов инкубации в присутствии трифлуороэтанола при рН 5.5 и температуре 25˚С, и только через 45 дней появляются пучки фибрилл (Chiti et al., 1999). Аβ(1-40)-пептид при рН 7.2, температуре 37˚С в присутствии 0.1% уксусной кислоты после 4 часов инкубации образует аморфные агрегаты и только после 48 часов – длинные фибриллы (Qahwash et al., 2003). Эксперименты со многими белками показали, что перед образованием амилоидов in vitro структура их молекул должна претерпевать трансформацию типа «α-спираль – β-складчатость», что, как правило, требует длительной инкубации и жестких условий, не совместимых с условиями in vivo (низкие значения рН, высокие температуры, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и т.п.). Согласно результатам нашего исследования, образование амилоидных фибрилл Х-белком происходит в мягких условиях (рН 7.0, температура 3–5°С, ионная сила, близкая к физиологической) и быстрее, чем в случае мышечной ацилфосфатазы человека и Аβ(1-40)-пептида. Следует также отметить, что в отличие от других белков, наличие 90% β-складчатой структуры у Х-белка способствует его быстрой агрегации в амилоидные фибриллы in vitro, что указывает на возможность быстрого роста его амилоидных депозитов in vivo.

4.6. Образование амилоидных фибрилл С-белком миокарда человека при ДКМП и С-белком миокарда кролика

Амилоидные депозиты нередко обнаруживаются в сердце и кровеносных сосудах при кардиомиопатиях и миокардитах. Особо следует отметить амилоидоз сердца (кардиопатический амилоидоз или амилоидная кардиомиопатия), который, как утверждают медицинские специалисты (Сторожаков и др., 2000), к сожалению, не включается в схему дифференциального диагноза даже при резистентной к лечению сердечной недостаточности и диагностируется посмертно. Учитывая все перечисленное выше, мы решили проверить, может ли С-белок, выделенный из сердца пациента с дилатационной кардиомиопатией, образовывать амилоидные фибриллы. Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) – заболевание миокарда неизвестной этиологии, диагностирующееся по расширению (дилатации) левого, правого или обоих желудочков. Нарушается систолическая функция желудочков, возможно развитие застойной сердечной недостаточности, часто наблюдается нарушение ритма желудочков и предсердий. В ходе развития ДКМП сердце постепенно, но необратимо, теряет свою функциональную активность (Хубутия, 2001; Шумаков и др., 2003).

Наши исследования показали, что в разных растворах (30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.01 М К-фосфат, pH 7.0; 30 мМ CaCl2, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 30 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 30 мМ MgCl2, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 50 мМ MgCl2, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.15 М глицин-КОН, рН 7.0) С-белок миокарда человека образует аморфные агрегаты и пучки линейных фибрилл длиной до 3 мкм и шириной до 500 нм (рис. 21 Г).

С-белок миокарда кролика в тех же условиях образует аморфные агрегаты и пучки линейных фибрилл длиной более 2 мкм и шириной до 500 нм (рис. 21 А–В). Амилоидная природа фибрилл С-белка миокарда человека и кролика была подтверждена поляризационной и флуоресцентной микроскопией, а также спектральными методами при взаимодействии их с Конго красным и тиофлавином Т (Марсагишвили и др., 2006).

Таким образом, с помощью разных специфических тестов мы показали, что белки семейства тайтина способны формировать амилоиды in vitro. Дальнейшие наши исследования должны быть направлены на тестирование токсических свойств амилоидов этих белков, на поиск подходов к их разрушению и предотвращению их образования.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Барсуков А., Шустов С., Шкодкин И., Воробьев С., Пронина Е. (2005) Гипертрофическая кардиомиопатия и амилоидоз сердца // Врач Вып. 10. С. 42–46.

Виноградова О.М. (1980) Первичный и генетические варианты амилоидоза // М. Медицина 224 с.

Вихлянцев И.М. (2005) Изучение тайтина и белков его семейства в скелетных мышцах в норме, при гибернации и микрогравитации // диссертационная работа. Пущино. 105 с.

Вихлянцев И.М., Макаренко И.В., Халина Я.Н., Удальцов С.Н., Малышев С.Л., Подлубная З.А. (2000) Изменения изоформного состава цитоскелетного белка тайтина – адаптационный процесс при гибернации // Биофизика. Т. 45. Вып. 5. С. 831–835.

Вихлянцев И.М., Алексеева Ю.А., Шпагина М.Д., Удальцов С.Н., Подлубная З.А. (2002) Изучение свойств С-белка скелетных и сердечных мышц сусликов Citellus undulatus на разных стадиях зимней спячки // Биофизика. Т. 47. Вып. 4. С. 701–705.

Вихлянцев И.М., Подлубная З.А., Шенкман Б.С., Козловская И.Б. (2006) Полиморфизм тайтина скелетных мышц при экстремальных условиях зимней спячки и микрогравитации: диагностическая ценность изоформ тайтина для выбора подходов к коррекции «гипогравитационного мышечного синдрома» // Докл. Акад. Наук. Т. 407. № 5. С. 692–694.

Гуровский Н.Н., Еремин А.В., Газенко О.Г., Егоров А.Д., Брянов И.И., Генин А.М. (1975) Медицинские исследования в космических полетах кораблей «Союз-12, 13, 14,» и орбитальной станции «Салют-3» // Космич. Биол. и мед. № 2. С. 48–53.

Лукоянова Н.А., Шпагина М.Д., Удальцов С.Н., Игнатьев Д.А., Колаева С.Г., Подлубная З.А (1996) Изменения в структурной организации реконструированных нитей миозина из скелетных мышц зимоспящих сусликов Citellus undulatus во время пробуждения // Биофизика. Т. 41. С. 116–122.

Макаренко И.В., Шпагина М.Д., Вишневская З.И., Подлубная З.А. (2002) Изменение структуры и функциональных свойств цитоскелетного эластичного белка тайтина при дилатационной кардиомиопатии // Биофизика. Т. 47. Вып. 4. С. 706–710.

Макаренко И.В. (2004) Роль полиморфизма тайтина в регуляции структурно-функциональных свойств миокарда в норме и при патологии // Диссертационная работа. Пущино. 107 с.

Марсагишвили Л.Г., Осипова Д.А., Вихлянцев И.М. (2006) С-белок миокарда человека образует амилоидные фибриллы // Тезисы докл. 9-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых ученых «Человек и его здоровье», 22 апреля, Санкт-Петербург, С. 207.

Мягкова Л.П. (2000) Энтеропатический амилоидоз: особенности клинических проявлений, место среди других форм амилоидоза. // Клиническая медицина. № 1. С. 11–14.

Подлубная З.А. (1981) Формирование сократительных структур в миогенезе // В кн.: Проблемы миогенеза. Л. с. 51–74.

Сторожаков Г.И., Гендлин Г.Е. (2000) Амилоидоз сердца // Сердечная недостаточность. Т. 1. № 1.

Фрейдина Н.А., Орлова А.А., Подлубная З.А. (1980) Электронно-микроскопическое исследование структуры С-белка и его взаимодействия с миозином, фрагментами миозина и актином // В кн.: Структурные основы и регуляция биологической подвижности. М. 160–163 с.

Хубутия М.Ш. (2001) Дилатационная кардиомиопатия // Вестник трансплантологии и искусственных органов, № 3–4. C. 32–40.

Шубникова Е.А., Юрина Н.А., Гусев Н.Б., Балезина О.П., Большакова Г.Б. (2001) Мышечные ткани // М: Медицина. 240 с.

Шумаков В.И., Хубутия М.Ш., Ильинский И.М. (2003) Дилатационная кардиомиопатия // ООО «Издательство Триада». 448 с.

Alyonycheva T.N., Mikawa T., Reinach F.C., Fischman D.A. (1997) Isoform-specific interaction of the myosin-binding proteins (MyBPs) with skeletal and cardiac myosin is a property of the C-terminal immunoglobulin domain // J Biol Chem. V. 272 (33). P. 20866–20872.

Bahler M., Moser H., Eppenberger H.M., Wallimann T. (1985) Heart C-protein is transiently expressed during skeletal muscle development in the embryo, but persists in cultured myogenic cells // Develop. Biol. V. 112. P. 345–352.

Bauer H.H., Aebi U., Haner M., Hermann R., Muller M, Merkle H.P. (1995) Architecture and polymorphism of fibrillar supramolecular assemblies prodused by in vitro aggregation of human calcitonin. // J. Struct. Biol. V. 115. P. 1–15.

Bennett P., Craig R., Starr R., Offer G. (1986) The ultrastructural location of C-protein, X-protein and H-protein in rabbit muscle // J. Muscle. Res. & Cell Motil. V. 7 (6). P. 550–567.

Bennett P., Starr R., Elliott A., Offer G. (1985) The structure of C-protein and X-protein molecules and a polymer of X-protein // J. Mol. Biol. V. 184. P. 297–309.

Blake C.C.F., Serpel L.C. (1996) Synchrotron X-ray studies suggest that the core of the transtyretin amyloid fibrils is a continuous β-sheet helix // Structure V. 4. P. 989–998.

Blake C.C.F., Serpel L.C. Sunde M., Sangren O., Lundgren E. (1996) A molecular model of the amyloid fibrils. The nature and origin of amyloid fibrils.// Ciba Found. Simp. V. 199. P. 6–21.

Callaway J.E., Bechtel P.J. (1981) C-protein from rabbit soleus (red) muscle // Biochem. J. V. 195. P. 463–469.

Chiti F., Webster P., Taddei N., Clark A., Stefani M., Ramponi G., Dobson Ch. (1999) Designing conditions for in vitro formation of protofilaments and fibrils // PNAS V. 96. P. 3590–3594.

Dobson C.M. (2001) The structural basis of protein folding and its links with human disease // Phil. Trans. Roy. Soc. Ser. B. V. 356. P. 133–145.

Draper M. H., Hodge A.J. (1949) Electron microscopy of muscle // Austr. J. Exp. Biol. Med. Sci. V. 27. P. 465–483.

Fandrich M., Fletcher M.A., Dobson S.M. (2001) Amyloid fibrils from muscle myoglobin // Nature V. 410. P. 165–166.

Flashman E., Redwood C., Moolman-Smook J., Watkins H. (2004) Cardiac myosin binding protein C: its role in physiology and disease // Circ. Res. V. 94 (10). P. 1279–1289.

Franzini-Armstrong G., Porter K.R. (1964) Sarcolemmal invaginations constituting the T-system in fish muscle tiber // J. Cell Biol. V. 22. P. 675–696.

Freiburg A., Gautel M. (1996) A molecular map of the interactions between titin and myosin binding protein C. Implications for sarcomeric assembly in familial hypertrophic cardiomyopathy // Eur. J. Biochem. V. 235. P. 317–323.

Fritz J.D., Swartz D.R., Greaser M.L. (1989) Factors affecting polyacrilamide gel electrophoresis and electroblotting of high-molecular-weight myofibrillar proteins // Analyt. Biochem. V. 180. P. 205–210.

Funatsu T., Kono E., Higuchi H., Kimura S., Ishiwata S., Yoshioka T., Maruyama K., Tsukita S. (1993) Elastic filaments in situ in cardiac muscle: deep-etch replica analysis in combination with selective removal of actin and myosin filaments // J. Cell Biol. V. 120. P. 711–724.

Fьrst D.O., Osborn M., Nave R., Weber K. (1988) The organization of titin filaments in the half-sarcomere revealed by monoclonal antibodies in immunoelectron microscopy: a map of ten nonrepetitive epitopes starting at the Z line extends close to the M line // J. Cell Biol. V. 106. P. 1563–1572.

Fьrst D.O., Vinkemeier U., Weber K. (1992) Mammalian skeletal muscle C-protein: purification from bovine muscle, binding to titin and the characterization of a full-length human cDNA // J Cell Sci. V. 102. P. 769-778.

Glenner G., Eanes E., Bladen H., Linke R. (1974) β-plated sheet fibrils. A comparison of native amyloid with synthetic protein fibrils // J. Histochem. Cytochem. V. 22. P. 1141–1158.

Godfrey J.E., Harrington W.F. (1970) Self-association in the myosin system at high ionic strength. II. Evidence for the presence of a monomer-dimmer equilibrium // Biochemistry. V. 9 (4). P. 894–908.

Goedert M. (2001) α-Synuclein and neurodegenerative diseases // Nature Rev. Neurosci. V. 2. P. 492–501.

Goldsbury C.S., Wirtz S., Mьller S.A., Sunderji S., Wicki P., Aebi U., Frey P. (2000) studies on the in vitro assembly of Aβ(1-40): implications for the search for Aβ fibril formation inhibitors // J. of Struct. Biol. V. 130. P. 217–231.

Gregorio C.C., Granzier H., Sorimachi H., Labeit S. (1999) Muscle assembly: a titanic achievement? // Curr. Opin. Cell Biol. V. 11. P. 18–25.

Guijarro J.I., Sunde M., Jones J.A., Campbell I.D., Dobson C.M. (1998) Amyloid fibril formation by an SH3 domain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA V. 95. P.4224–4228.

Hanson J., O’Brien E. J., Bennett P. M. (1971) Structure of the myosin-containing filament assembly (A-segment) separated from frog skeletal muscle // J. Mol. Biol. V. 58. P. 865–871.

Hartzell H.C. (1985) Effects of phosphorylated and unphosphorylated C-protein on cardiac actomyosin ATPase //J. Moll. Biol. V. 186. P. 185–195.

Hartzell H.C., Glass D.B. (1984) Phosphorylation of purified cardiac muscle C-protein by purified cAMF-dependent and endogenous Ca2+-calmodulin-dependent protein kinases // J. Biol. Chem. V. 259. P. 15587–15596.

Hartzell H.C., Titus L. (1982) Effect of cholinergic and adrenergic agonists on phosphorylation of a 165000-dalton myofibrillar protein in intact amphibian cardiac muscle // J. Biol. Chem. V. 257. P. 2111–2120.

Hashimoto M., Rockenstein E., Crews L., Masliah E. (2003) Role of protein aggregation in mitochondrial dysfunction and neurodegeneration in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases // Neuromolekular Med. V. 4. P. 21–36.

Houmeida A., Holt J., Tskhovrebova L., Trinick J. (1995) Studies of the interaction between titin and myosin // J. Cell Biol. V. 131. P. 1471–1481.

Hwang W., Zhang Sh., Kamm R.D., Karplus M. (2004) Kinetic control of dimmer structure formation in amyloid fibrillogenesis // PNAS V. 101. P. 12916–12921.

Improta S., Politou A.S., Pastore A. (1996) Immunoglobulin-like modules from titin I-band: extensible components of muscle elasticity // Structure V. 4. P. 323–337.

Itoh Y., Kimura S., Suzuki T., Ohashi K., Maruyama K. (1986) Native connectin from porcine cardiac muscle // J. Biochem. V. 100. P. 439–447.

Jeacocre S.A., England P.J. (1980) Phosphorylation of a myofibrillar protein of Mr 150000 in perfused rat heart, and the tentative identification of this as C-protein // FEBS Letters. V. 122. P. 129–132.

Juszczyk P., Kolodziejczyk A.S., Grzonka Z. (2005) Circular dichroism and aggregation studies of amyloid β (11-28) fragment and its variants // Acta Biochim. Pol. V. 52. P. 425–431.

Kelly J.W. (1998) The alternative conformations of amyloidogenic proteins and their multi-step assembly pathways // Curr. Opin. Struct. Biol. V. 8. P. 101–106.

Kielley W.W., Harrington W.F. (1960) A model for the myosin molecule // Biochim. Biophys. Acta. V. 41 (3). P. 401–421.

Kim Y., Randolph T.W., Stevens F.J., Carpenter J.F. (2002) Kinetics and energetics of assembly, nucleation, and growth of aggregates and fibrils for an amylodogenic protein // J. Biol. Chem. V. 277. P. 27240–27246.

Klunk W.E., Pettegrew J.W., Abraham D.J. (1989) Quantitative evaluation of Congo red binding to amyloid-like proteins with a beta-pleated sheet conformation // J. Histochem. Cytochem. V. 37. P. 1273–1281.

Koretz J.F., Irving T.C., Wang K. (1993) Filamentous aggregates of native titin and binding of C-protein and AMP-desaminase // Arch. Biochem. Biophys. V. 304 (2). 305–309.

Krebs M.R., Bromley E.H., Donald A.M. (2005) The binding of thioflavin-T to amyloid fibrils: localisation and implications. // J. Struct. Biol. V. 149. P. 30–37.

Kulikovskaya I., McClellan G., Flavigny J., Carrier L., Winegrad S. (2003) Effect of MyBP-C binding to actin on contractility in heart muscle // J. Gen. Physiol. V. 122 (6). 761–774.

Kunst G, Kress KR, Gruen M, Uttenweiler D, Gautel M, Fink RH. (2000) Myosin binding protein C, a phosphorylation-dependent force regulator in muscle that controls the attachment of myosin heads by its interaction with myosin S2 // Circ Res. V. 86 (1). P. 51–58.

Labeit S. & Kolmerer B. (1995) Titins, giant proteins in charge of muscle ultrastructure and elasticity // Science. V. 270. P. 293–296.

Laemmli H. (1970) Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacterophage T4 // Nature. V. 227 (5259). P. 680–685.

Lee E.K., Park Y.W., Dong Y.Sh., Mook-Jung I., Yoo Yu. J. (2006) Cytosolic amyloid-β peptide 42 escaping from degradation induces cell death // Biochem. Biophys. Res. Communs. V. 344. P. 471–477.

LeVine III H. (1993) Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer’s disease β-amyloid peptides: detection of amyloid aggregation in solution // Prot. Sci. V. 2. P. 404–410.

LeVine III H. (1995) Thioflavine T interactions with amyloid β-sheet structures // Amyloid. V. 2. P. 1–6.

Lim M.S., Sutherland C., Walsh M.P. (1985) Phosphorylation of bovine cardiac C-protein by protein kinase C // Biochem. Biophys. Res. Communs. V. 132. P. 1187–1195.

Linke W.A., Kulke M., Li H., Fujita-Becker S., Naegoe C., Manstein D.J., Gautel M., Fernandez J.M. (2002) PEVK domain on titin: an entropic spring with actin-binding properties // J. Struct. Biol. V. 137. P. 194–205.

Liversage A.D., Holmes D., Knight P.J., Tskhovrebova L., Trinick J. (2001) Titin and the sarcomere symmetry paradox // J. Mol. Biol. V. 305. P. 401–409.

Maruyama K., Kimura S., Ohashi K., Kuwano Y. (1981) Connectin, an elastic protein of muscle. Identification of “titin” with connectin // J. Biochem. V. 89. P. 701–709.

Maruyama K., Matsubara R., Natori Y., Nonomura S., Kimura S., Ohashi K., Murakami F., Handa S., Eguchi G. (1977) Connectin, an elastic protein of muscle // J. Biochem. V. 82. P. 317–337.

McClellan G., Kulikovskaya I., Winegrad S. (2001) Changes in cardiac contractility related to calcium-mediated changes in phosphorylation of myosin-binding protein C // Biophys. J. V. 81 (2). P. 1083–1092.

McClellan G., Kulikovskaya I., Flavigny J., Carrier L., Winegrad S. (2004) Effect of cardiac myosin-binding protein C on stability of the thick filament // J. Mol. Cell Cardiol. V. 37 (4). P. 823–835.

Mohamed A.S., Dignam J.D., Schlender K.K. (1998) Cardiac myosin-binding protein C (MyBP-C): identification of protein kinase A and protein kinase C phosphorylation sites // Arch. Biochem. Biophys. V. 358 (2). P. 313–319.

Moos C. (1981) Fluorescence microscope study of the binding of added C-protein to skeletal muscle myofibrils // J. Cell Biol. V. 90 P. 25–31.

Moos C., Dubin J., Mason C., Besterman J. (1976) Binding of C-protein to F-actin // Biophys. J. V. 16. P. 47a.

Moos C., Mason C.M., Besterman J. M., Feng I-N. M., Dubin J.H. (1978) The binding of skeletal muscle C-protein to F-actin and its relation to the interaction of actin with myosin subfragment-1 // J. Mol. Biol. V. 124. P. 571–586.

Moos C., Offer G., Starr R., Bennett P. (1975) Interaction of C-protein with myosin, myosin rod and light meromyosin // J. Mol. Biol. V. 97. P. 1–9.

Muhle-Goll C., Pastore A., Nilges M. (1998) The 3D structure of a type I module from titin: a prototype of intracellular fibronectin type III domains // Structure. V. 6. P. 1291-1302.

Nave R., Furst D.O., Weber K. (1989) Visualization of the polarity of isolated titin molecules: a single globular head on a long thin rod as the M band anchoring domain? // J. Cell Biol. V. 109. P. 2177–2187.

Offer G., Moos C., Starr R., (1973) A new protein of the thick filaments of vertebrate skeletal myofibrils. Extraction, purification and characterization // J. Mol. Biol. V. 74. P. 653–676.

O’Nuallain B., Williams A.D., Westermark P., Wetzel R. (2004) Seeding specificity in amyloid growth induced by heterologous fibrils // J. Biol. Chem. V. 279. P. 17490–17499.

Pepe F. A. (1967) The myosin filament. I. Structural organization from antibody staining observed in electron microscopy // J. Mol. Biol. V. 27. P. 203–225.

Podlubnaya Z.A., Freydina N.A., Lednev V.V. (1990) The axial repeats in paracrystals of light meromyosin and its complex with C-protein // Gen. Physiol. Biophts. V. 9. P. 301–310.

Qahwash I., Weiland K., Lu Yi., Sarver R., Kletzien R., Yan R. (2003) Identification of a mutant amyloid peptide that predominantly forms neurotoxic protofibrillar aggregates // J. Biol. Chem. V. 278. P. 23187–23195.

Rees M.K., Young M. (1967) Studies on the isolation and molecular properties of homogenous globular actin. Evidence for a single polypeptide chain structure // J. Biol. Chem. V. 242 (19). P. 4449–4458.

Safer D., Pepe F.A. (1980) Axial packing in light meromyosin paracrystals // J. Mol. Biol. V. 136. P. 343–358.

Sato N., Kawakami T., Nakayama A., Suzuki H., Kasahara H., Obitana T. (2003) A novel variant of cardiac myosin-bihding protein-C that is unable to assemble into

Shirahama T., Cohen A.S. (1967) High-resolution electron microscopic analysis of the amyloid fibril. // J. Cell. Biol. V. 33. P. 679–708.

Sipe J.D., Cohen A.S. (2000) History of the amyloid fibril. // J. Struct. Biol. V. 130. P. 88–98.

Siragelo I., Malmo C., Iannuzzi C., Mezzogiorno A., Bianco .R., Papa M., Irace G. (2004) Fibrillogenesis and cytotoxic activity of the amyloid-forming apomyoglobin mutant W7FW14F // J. Biol. Chem. V. 279. P. 13183–13189.

Soteriou A., Gamage M., Trinick J. (1993) A survey of interactions made by the giant protein titin // J. Cell Sci. V. 14. P. 119–123.

Squire J.M. (1981) The structural basis of muscular contraction // New York. London. P. 349.

Starr R. & Offer G. (1971) Polypeptide chains of intermediate molecular weight in myosin preparations // FEBS Lett. V. 15. P. 40–44.

Starr R. & Offer G. (1983) H-protein and X-protein. Two new components of the thick filaments of vertebrate skeletal muscle // J. Mol. Biol. V. 170. P. 675–698.

Starr R., Offer G. (1978) Interaction of C-protein with heavy meromyosin and subfragment-2 // Biochem. J. V. 171. P. 813–816.

Starr R., Offer G. (1982) Preparation of C-protein, H-protein, X-protein and phosphofructokinase // In: Methods in enzymology. New York. London. V. 85. Part B. P. 130–138.

Stine W.B., Dahlgren K.N., Krafft G.A., LaDu M.J. (2003) In vitro characterization for amyloid-β peptide oligomerization and fibrillogenesis // J. of Biol. Chem. V. 278. P. 11612–11622.

Stelzer J., Patel J., Moss R. (2006) Protein kinase A-medieted acceleration of the stretch activation responce in murine skinned myocardium is eliminated by ablation of cMyBP-C // Circ. Res. V. 13. P. 884–890.

Sunde M., Blake C.C.F. (1997) The structure of amyloid fibrils by electron microscopy and X-ray diffraction. // Adv. Prot. Chem. V. 50. P. 123–159.

Suzuki J., Kimura S., Maruyama K. (1994) Electron microscope filament lengths of connectin and its fragments // J. Biochem. V. 116. P. 406–410.

Suzuki K., Terry R.D. (1967) Fine structural localization of acid phosphatase in senile plaques in Alzheimer’s presenile dementia. // Acta Neuropathol. (Berl.). V. 8. P. 276–284.

Tan S.Y., Perys M.B. (1994) Histopahtology // Amyloidosis. V. 25. P. 403–414.

Trinick J., Knight P., Whiting A. (1984) Purification and properties of native titin // J. Mol. Biol. V. 180. P. 331–356.

Tskhovrebova L., Trinick J. (1997) Direct visualization of extensibility in isolated titin molecules // J. Mol. Biol. V. 265. P. 100–106.

Uversky V.N., Fink A.L. (2004) Conformational constraints for amyloid fibrillation: the importance of being unfolded // Biochim. Biophys. Acta. V. 1698. P. 131–153.

Vaughan K.T., Weber F.E., Einheber S., Fichman D.A. (1993) Molecular cloning of chiken myosin-binding protein (MyBP) H (86-kDa protein) reveals extensive homology with MyBP-C (C-protein) with conserved immunoglobulin C2 and fibronectin type III motifs. // J. Biol. Chem. V. 268. P. 3670–3676.

Wang K., McClure J., Tu A. (1979) Titin: major myofibrillar components of striated muscle // Proc.Natl Acad. Sci.USA. V. 76 (8). P. 3698–3702.

Wang K & Wright J. (1988) Architecture of the sarcomere matrix of skeletal muscle: immunoelectron microscopic evidence that suggests a set of parallel inextensible nebulin filaments anchored at the Z-line // J Cell Biol. V. 107 (6 Pt 1). P. 2199–212.

Weber F.E., Vaughan K.T., Reinach F.C., Fischman D.A. (1993) Complete sequence of human fast-type and slow-type muscle myosin-binding-protein C (MyBP-C). Differential expression, conserved domain structure and chromosome assignment // Eur J Biochem. V. 216 (2). P.661–669.

Weisberg A., Winegrad S. (1996) Alteration of myosin cross bridges by phosphorylation of myosin-binding protein C in cardiac muscle // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. V. 93 (17). P. 8999–9003.

Weisberg A., Winegrad S. (1998) Relation between crossbridge structure and actomyosin ATPase activity in rat heart // Circ Res. V. 83 (1). P. 60–72

Yamamoto K. & Moos K. (1983) The C-protein of rabbit red, white, and cardiac muscles // J. Biol. Chem. V. 258 (13). P. 8395–8401.

Yamamoto K. (1984) Characterization of H-protein, a component of skeletal muscle myofibrils // J. Biol. Chem. V. 259. P. 7163–7168.

Zerovnik E. (2002) Amyloid fibril formation // Eur. J. Biochem. V. 269. P. 3362–3371.

Пензенский Государственный Педагогический Университет

им. В.Г. Белинского

Курсовая работа на тему:

Биосинтез мембранных белков и их встраивание в биомембрану

Выполнила: студентка группы Бх-41

Данилова Елена

Проверил: к.б.н.,

Соловьев В.Б.

Пенза,2009

Содержание

Введение

1. Методы исследования переноса белков через мембраны

2. Встраивание белков в мембрану

2.1 Сигнальная гипотеза

2.2 Мембранная триггерная гипотеза

3. Полипептидные сигналы, отвечающие за сортировку белков и встраивание их в мембраны

3.1 Сигнальная последовательность, определяющая встраивание в эндоплазматический ретикулум

3.2 Стоп-сигналы переноса

3.3 Использование синтетических сигнальных пептидов

3.4 Сигнальные пептидазы

4. Растворимые и мембраносвязанные белки, необходимые для переноса

5. Сборка мультисубъединичных комплексов и обновление мембранных белков

Выводы

Литература

Введение

Процесс образования мембран начинается с синтеза белковых и липидных компонентов, которые затем должны быть доставлены к месту назначения. В состав мембран входят различные белки, для биосинтеза которых необходимы точные механизмы. В принципе имеются две главные проблемы, касающиеся сборки мембранных белков.

1. Все закодированные в ядре белки синтезируются общим пулом рибосом. В связи с этим возникает вопрос: как отдельные мембранные белки доставляются к месту назначения? Чем отличаются белки плазматической мембраны от белков внутренней митохондриальной мембраны или от белков мембран эндоплазматического ретикулума? Эту сложную проблему сортировки можно решить только при наличии определенных сигнальных последовательностей в каждом полипептиде, а также соответствующего аппарата узнавания.

2. Каков истинный механизм встраивания мембранных белков в мембрану и как при этом достигается правильная их ориентация относительно мембранного бислоя? Требуют ли механизмы встраивания и ориентации также наличия определенных сигнальных элементов и систем узнавания и если да, то каковы они? Какие свойства обеспечивают при встраивании мембранных белков формирование правильной третичной, а также четвертичной структуры в случае мультисубъединичных ансамблей?

За последние десятилетия в поиске ответов на эти вопросы достигнуты большие успехи, причем они становятся все более значительными. Это в большой мере обусловлено тем, что для выяснения роли специфических сигнальных полипептидных последовательностей в этих процессах стала использоваться рекомбинантная ДНК. Хотя не на все вопросы удалось найти ответы, полученные результаты все больше убеждают в том, что совершенно разные на первый взгляд системы в действительности обладают фундаментальным сходством. Например, не так давно было показано, что механизм секреции белков имеет много общего с механизмом синтеза белков плазматической мембраны. Совсем недавно достигнут большой прогресс в понимании общих принципов переноса белков через мембраны митохондрий, эндоплазматического ретикулума и грамотрицательных бактерий. Эти экспериментальные системы изучались наиболее интенсивно. И хотя между соответствующими процессами есть значительные различия, они имеют ряд общих особенностей.

1. Существует идентифицируемая часть полипептидной последовательности, которая служит участком узнавания, или «сигналом», направляющим отдельный полипептид к мембране, в которую он встраивается. Эти сигнальные участки часто расположены на N-конце новосинтезированного полипептида и отщепляются специфическими сигнальными пептидазами после встраивания его в нужную мембрану или переноса через нее. Для обозначения N-концевого сигнала различными авторами использовались следующие термины: сигнальный пептид, сигнальная последовательность, транзитный пептид, лидирующий пептид пре-последовательность.

2. Процессы трансляции и встраивания белков в мембрану можно разделить в эксперименте. Для сборки мембранных белков в большинстве случаев необходима энергия, отличающаяся по величине от той, которая требуется для их трансляции на рибосоме.

3. Связавшийся с мембраной-мишенью полипептид должен, кроме того, находиться в конформации, в которой может осуществляться его перенос через мембрану или встраивание в нее. Во многих случаях перенос белков через мембраны происходит от N-конца к С-концу, при этом необходимо, чтобы белок был, по крайней мере, частично развернут или слабо свернут. Полипептид может транслоцироваться в вытянутой форме в ходе энергозависимого процесса.

Особый интерес представляет процесс сборки мембранных белков. На рис.1 схематично показаны три общих механизма проникновения пептидного предшественника в мембрану. Механизмы А и Б являются вариантами схемы линейного вытеснения, согласно которой сигнальная последовательность направляет полипептид к переносящему устройству, которое включает в себя заполненный водой канал. Сигнальная последовательность может проходить прямо сквозь канал (механизм А) или оставаться связанной с мембраной, образуя, как показано на рис.1, петлю (механизм Б). В отсутствии какого-либо сигнала остановки процесса переноса полипептид будет транспортироваться через мембрану целиком. Однако если внутри полипептида имеется второй сигнальный пептид, называемый стоп-сигналом переноса, то процесс останавливается, и стоп-сигнал переноса становится трансмембранным сегментом зрелого мембранного белка. Фиксируя белок в мембране, стоп-сигнал переноса действует как сигнал сортировки.

Схема В на рис.1 иллюстрирует возможную роль самопроизвольного включения в мембрану гидрофобных элементов полипептидного предшественника. Этот механизм может реализовываться только тогда, когда включение в мембрану происходит после трансляции полипептида.

Рис.1. Три общие модели возможной сборки белков в мембране.

Две первые (А и Б) предполагают, что белок транспортируется в линейной форме через белковый канал. При наличии стоп-сигнала процесс останавливается, в противном случае через мембрану проходит весь белок. Модель В предполагает, что гидрофобные элементы полипептида самопроизвольно включаются в липидный бислой. Гидрофобный элемент может представлять собой одиночную спираль или более сложную структуру. Процесс может быть опосредован белками.

Проблема сборки белков очень важна. Этот процесс обычно не протекает самопроизвольно, лишь в результате взаимодействия между образующимися полипептидами и липидным бислоем. Напротив, он является энергозависимым и опосредуется белковыми структурами, которые пока не изучены в достаточной степени. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что перенос белков через мембрану (например, в полость эндоплазматического ретикулума) и сборка интегральных мембранных белков – это тесно связанные стороны одного и того же процесса. Логично ожидать, что проблемы транспортировки белков через мембраны и их укладки должны решаться одинаковым образом.

1. Методы исследования переноса белков через мембраны

Наиболее детально изучены бесклеточные системы, в которых гораздо легче количественно исследовать процессы переноса и протеолитического процессинга белков. Во всех этих системах используются мембранные везикулы или препараты органелл, у которых поверхность, обращенная в цитоплазму, «смотрит» наружу, поскольку перенос белков осуществляется из цитоплазмы. Этому условию удовлетворяют микросомы, полученные из эндоплазматического ретикулума секретирующих клеток, митохондрий и хлоропластов. Вывернутые везикулы можно получить из клеток Е. coli, они представляют собой удобный объект для изучения переноса белков в бесклеточной системе.

Полипептид-предшественник, находящийся во внешней среде, при соответствующих условиях будет переноситься внутрь пузырька или, по крайней мере, через мембрану пузырька или органеллы. За этим процессом обычно следят, добавляя протеазы во внешнюю среду. Степень защиты от протеолиза является мерой количества полипептида, транспортированного внутрь везикулы или органеллы. За ходом протеолитического процесса, осуществляемого сигнальной пептидазой, следят с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Белки, встроившиеся в мембрану, можно идентифицировать с помощью щелочной экстракции, при этом предполагается, что белки, которые связаны с поверхностью мембран, при такой обработке удаляются. Однако так бывает не всегда, поэтому результаты, полученные с помощью щелочной экстракции, необходимо интерпретировать с осторожностью.

В таких бесклеточных системах можно изучать биохимические условия переноса белков и идентифицировать необходимые растворимые компоненты. Кроме того, при этом можно варьировать природу переносимого полипептидного «субстрата».

При изучении бесклеточных систем были получены весьма важные данные об условиях, необходимых для переноса белков.

1. Посттрансляционный и котрансляционный перенос. Принято считать, что во всех исследованных системах перенос в мембраны или через мембраны может осуществляться независимо от трансляции. Убедительные данные на этот счет были получены для процесса переноса белков в хлоропластах и митохондриях, а также для переноса через бактериальную мембрану. Долгое время считалось, что перенос белков в эндоплазматический ретикулум или через мембраны эндоплазматического ретикулума всегда осуществляется параллельно трансляции, однако было четко показано, что такая параллельность не обязательна. Также важным считается то, что энергия, необходимая для переноса, не исходит от рибосомного биосинтетического аппарата.

2. Энергетические требования к переносу. Как правило, перенос белков в мембраны или через них энергозависим. Необходимым условием переноса как для прокариотических, так и для эукариотических систем является гидролиз АТР (или другого нуклеозидтрифосфата). Это было показано для следующих процессов: а) переноса белков в строму хлоропластов; б) транспорта белков в митохондриальный матрикс, внутреннюю и наружную мембраны; в) переноса белков через эндоплазматический ретикулум дрожжей и посттрансляционного встраивания мембранных белков в эндоплазматический ретикулум млекопитающих; г) переноса белков через цитоплазматическую мембрану Е.coli.

Еще одним независимым условием переноса белков в матрикс митохондрий и во внутреннюю мембрану митохондрий является наличие на последней трансмембранного потенциала. Этот потенциал, очевидно, необходим на ранней стадии процесса, при связывании белка с митохондрией.

3. Способность предшественника к переносу. Имеются веские доводы в пользу того, что ключевую роль в успешном переносе белка играет его четвертичная структура. Скорее всего это связано с тем, что сигнальная последовательность(ти), узнаваемая аппаратом переноса, должна быть доступна для него. Следовательно, для осуществления переноса белок должен быть неплотно свернут или частично развернут. Кроме того, если белки переносятся через мембрану в вытянутой конформации, то аппарат переноса должен быть способен к их развертыванию во время самого процесса переноса. Если бы белки- предшественники обладали стабильной четвертичной структурой, то они с трудом развертывались бы и, следовательно, не были бы способны к переносу.

Транспорт белков осуществляется в развернутом виде. АТР необходим для разворачивания полипептида. Разворачивание происходит до переноса или параллельно ему. На то, что именно АТР необходим для этого процесса, говорит тот факт, что транспорт укороченных предшественников в отличие от транспорта полноразмерного белка может осуществляться в отсутствии АТР. Впервые эти данные были сделаны на основе изучения митохондриальной мембраны. Для предотвращения свертывания предшественника в нативную конформацию необходим какой-либо растворимый белковый кофактор. Так, был выделен в водорастворимой форме, сходный порином митохондрий, предшественник белка наружной мембраны Е.coli OmpA, который был не способен к эффективному переносу через плазматическую мембрану, если в цитозоле отсутствовал белок, называемый «триггер-фактором». Известно также, что для переноса белков через мембраны эндоплазматического ретикулума млекопитающих или в эндоплазматичекий ретикулум необходим растворимый кофактор, а именно – сигнал-распознающая частица (СРЧ). Возможно, роль этого фактора состоит в предотвращении сворачивания предшественника полипептида.

2. Встраивание белков в мембрану

2.1 Сигнальная гипотеза

Белки встраиваются в мембрану разными способами, но детали этого процесса во многих случаях еще не установлены. Для объяснения механизма встраивания предложены две модели: сигнальная гипотеза и мембранная триггерная гипотеза. В сигнальной гипотезе предполагается, что белок включается в мембрану параллельно его трансляции на мРНК в полирибосомах; это так называемое котрансляционное включение. Когда лидерная последовательность выходит из рибосомы, она выявляется некой сигнал-распознающей частицей (СРЧ), которая блокирует дальнейшую трансляцию на уровне примерно 70 аминокислот, 40 из которых остаются в большом рибосомном комплексе, а 30 экспонированы в среду. СРЧ содержит шесть белков, с ней ассоциирована 7S-РНК, близкородственная «Alu-семейству» последовательностей ДНК с большим числом повторов. Блокирование трансляции не снимается до тех пор, пока комплекс СРЧ-лидерная последовательность – рибосома не свяжется с так называемым «отстригающим» белком (рецептором для СРЧ) эндоплазматического ретикулума. В этот момент начинается котрансляционное встраивание в эндоплазматический ретикулум. В процессе элонгации оставшейся части белка он перемещается через липидный бислой, поскольку рибосома остается присоединенной к эндоплазматическому ретикулуму. Таким образом образуется шероховатый (усеянный рибосомами) эндоплазматический ретикулум. Рибосомы остаются прикрепленными к эндоплазматическому ретикулуму втечении всего времени синтеза мембранного белка и освобождаются и диссоциируют на соответствующие субъединицы только после его завершения. Когда ранее синтезированная часть белка выходит в просвет эндоплазматического ретикулума, отщепляется лидерная последовательность, и присоединяются углеводы.

Интегральные мембранные белки не пересекают мембрану целиком; по-видимому, этому препятствует гидрофильная якорная последовательность на С-конце. Секретируемые же белки проходят сквозь мембранный бислой полностью и высвобождаются в просвет эндоплазматического ретикулума. К моменту их поступления внутрь везикулы углеводные остатки уже оказываются связанными с ними. Впоследствии секретируемые белки обнаруживаются в просвете аппарата Гольджи, где происходит модификация их углеводных цепочек, а затем они перемещаются к специфическим внутриклеточным органеллам или клеточным мембранам либо секретируются. Некоторые белки пересекают одну мембрану, а затем заякориваются в другой, соседней мембране, например внутренней мембране митохондрий.

2.2 Мембранная триггерная гипотеза

В этой гипотезе особое значение придается роли лидерной последовательности в изменении третичной структуры самого белка. Согласно этой гипотезе, лидерная последовательность индуцирует такую упаковку обычно гидрофобного интегрального белка, что последний может оставаться солюбилизированным в водной среде цитоплазмы, где он синтезирован. Мембранный липидный бислой является как бы триггером по отношению к третичной структуре белка – последний переходит в такую конформацию, которая обеспечивает его предпочтительное включение в бислой. Таким образом, белок претерпевает некий переход и сам встраивается в мембрану таким способом, чтобы установить необходимую поперечную асимметрию. Сразу после встраивания белка или его интеграции лидерная последовательность отщепляется. Триггерная гипотеза не предполагает специфического взаимодействия между рибосомой и мембраной, но это еще не означает, что синтез белка не может происходить на мембранах. Возможно, в одной и той же клетке действуют оба механизма.

3. Полипептидные сигналы, отвечающие за сортировку белков и

встраивание их в мембраны

Об аппарате и механизме переноса почти ничего неизвестно, немного больше известно о сигнальных последовательностях, присутствующих в полипептидах и направляющих каждый белок в нужное место. Успехов в этой области удалось достичь благодаря использованию техники рекомбинантных ДНК. С ее помощью были сконструированы гибридные полипептиды, в которые была включена тестируемая аминокислотная последовательность, принадлежащая другому белку. Таким образом можно было изучать влияние предполагаемой сигнальной последовательности на локализацию «белка-пассажира». Преимущества такого подхода удается использовать только в том случае, если вся информация, определяющая локализацию конечного продукта, заключена в первичной последовательности сигнала и если «белок-пассажир» является нейтральным участником процесса и, что существенно, подчиняется сигналу. Это условие выполняется во многих случаях, но известны и такие примеры, когда эффективность переноса или даже конечная локализация зависят от «белка-пассажира». Если «белок-пассажир» находится в конформации, не способной к переносу, то может происходить блокирование переноса химерного белка. Кроме того, функция некоторых сигнальных последовательностей зависит от их локализации в полипептиде или от взаимодействия с другими участками полипептидной цепи.

3.1 Сигнальная последовательность, определяющая встраивание в

эндоплазматический ретикулум

У большинства белков, встроенных в мембрану эндоплазматического ретикулума или пересекающих ее, на N-конце имеется «короткоживущий» сигнальный пептид. Это сигнальная последовательность непосредственно взаимодействует по крайней мере с двумя рецепторами, один из которых растворим (сигнал-распознающая частица), а другой находится в мембране. Можно было бы ожидать, что аминокислотная последовательность этого сигнального пептида будет очень консервативной и примерно одинаковой у всех переносимых белков, но ожидания эти не оправдались. Эти сигнальные участки не отличаются постоянством ни в отношении длины, ни в отношении аминокислотной последовательности, а многочисленные опыты по мутагенезу показали, что они могут претерпевать значительные структурные изменения. Данные о том, что сигнальные пептиды содержат всю информацию, необходимую для транспорта белков через мембраны эндоплазматического ретикулума или внутрь их, были получены в опытах с химерными полипептидами. Присоединение N-концевой сигнальной последовательности к обычным цитоплазматическим белкам, например к глобину, приводило к тому, что они транспортировались в полость эндоплазматического ретикулума.

С точки зрения «сравнительной анатомии» N-концевых сигнальных последовательностей три разных в структурном отношении участка: 1) положительно заряженный N-концевой участок (n-участок); 2) центральное гидрофобное ядро из 7-15 остатков (h-участок); 3) С-концевой участок (с-участок), который является полярным и содержит сайт, узнаваемый сигнальной пептидазой, которая находится на стороне эндоплазматического рутикулума, обращенной в полость.

От небольших изменений в сигнальных последовательностях зависит, будет ли «белок-пассажир» секретироваться в полость эндоплазматического ретикулума или он останется прикрепленным к мембране, и какой будет ориентация N-конца мембранного белка.

3.2 Стоп-сигналы переноса

Для неотщепляемых сигнальных последовательностей, которые играют роль N-концевых якорей в образовавшемся мембранном белке, характерно наличие относительно длинных гидрофобных участков. Отсюда следует, что перенос может останавливаться просто при наличии протяженного гидрофобного участка, который способен образовать трансмембранную α-спираль. В пользу тассского предположения свидетельствуют некоторые экспериментальные данные. Например, с помощью рекомбинантной ДНК в среднюю часть белка Е.coli, в норме секретирующегося через плазматическую мембрану, встраивали гидрофобные сегменты. Если их длина была не менее 16 аминокислотных остатков, то транспорт белка блокировался, и он оставался присоединенным к плазматической мембране. Можно возразить, что в данном случае речь идет о бактериальной системе, но все-таки механизмы переноса в про- и эукариотических системах сходны. Далее были сконструированы варианты G-белка вируса везикулярного стоматита с измененными мембранными доменами. Длина гидрофобного сегмента могла составлять не 20, а 8 остатков, при этом полипептид оставался трансмембранным, хотя транспорт в плазматическую мембрану блокировался. Таким образом, природа стоп-сигнала переноса точно не известна. Необходимо выяснить два вопроса: 1) участвуют ли в остановке переноса специфические белки аппарата переноса; 2) определяется ли остановка переноса гидрофобностью стоп-сигнала или какими-то более тонкими факторами? Было показано, что участки стоп-сигнальной последовательности, ответственные за блокирование переноса через эндоплазматический ретикулум, могут никак не влиять на транспорт через мембрану хлоропласта. Это означает, что упомянутые два процесса могут существенно различаться.

Определение старт- и стоп-сигналов подразумевает линейную схему переноса, начинающегося с N-конца; об этом свидетельствует поведение простых систем. Однако оказалось, что последовательности, которые блокируют перенос в одном случае, могут инициировать его в другом. Следовательно, важна не только природа самих стоп- или старт-последовательностей, но и их окружение в полипептиде.

3.3 Использование синтетических сигнальных пептидов

Синтезированы пептиды, соответствующие сигнальной последовательности дикого типа, а также мутантные сигнальные пептиды белка LamB наружной мембраны и исследовано их взаимодействие с модельными фосфолипидными мембранами и везикулами Е.coli. Показано, что пептид, соответствующий сигнальной последовательности дикого типа, эффективно ингибирует in vitro перенос предшественников как периплазматичекого белка, так и белка наружной мембраны, а пептид, соответствующий мутантной сигнальной последовательности, дефектной по экспорту, не ингибирует перенос в бесклеточной системе. Это означает, что сигнальные пептиды узнают какой-то общий рецептор в цитозольной или мембранной фракции. Кроме того, эффективность связывания этих пептидов с модельными мембранами (монослоем и бислоем) коррелирует с их способностью служить сигналом переноса. Корреляция между гидрофобностью сигнальной последовательности и способностью инициировать транслокацию обнаруживается и при использовании предшественника мальтозосвязывающего белка.

Эти данные согласуются с моделью, согласно которой первичная сигнальная последовательность определяет локализацию полипептидного предшественника в мембране путем неспецифических взаимодействий с липидным бислоем, после чего осуществляется более специфическое связывание с белковым рецептором. Сходная модель была предложена для амфифильных пептидных гормонов. Но сигнальный пептид в животных клетках до его связывания с мембраной взаимодействует с каким-то растворимым рецептором. Какое значение для сигнального пептида имеет его способность связываться с липидами – остается неясным.

3.4 Сигнальные пептидазы

Для удаления временных N-концевых сигнальных пептидов необходимы специфические белки. Наиболее полно охарактеризованы сигнальные протеазы из Е.coli. Большинство экспортируемых белков Е.coli содержат сигнальный пептид, который отщепляется на периплазматической поверхности внутренней мембраны с помощью лидер-пептидазы; ее структура представлена на рис.2.

Рис.2. Предполагаемая топология лидер-пептидазы из Е.coli.

Аминокислотные остатки пронумерованы. Прямоугольниками обозначены гидрофобные сегменты. Первый гидрофобный участок не был обнаружен экспериментально, вывод о его существовании был сделан исходя из его гидрофобности. Наличие и ориентация второго гидрофобного участка установлены экспериментально и, по-видимому, он функционирует как внутренняя сигнальная последовательность. Третий гидрофобный сегмент имеет слабо выраженный гидрофобный характер и является частью периплазматического домена.

Для переноса белков через внутреннюю мембрану эта пептидаза не нужна, но она необходима для высвобождения экспортируемого белка из цитоплазматической мембраны. In vitro очищенный фермент мог функционировать, будучи включенным в липосомы. Специфичность расщепления весьма высока, но не определяется исключительно аминокислотной последовательностью вблизи сайта расщепления. Сигнальная пептидаза, функционирующая в эндоплазматическом ретикулуме, имеет ту же специфичность, что и соответствующий фермент Е.coli, что неудивительно, если учесть сходство сигнальных последовательностей. Была очищена сигнальная пептидаза из микросом эукариот. Показано, что она ассоциирована с другими полипептидами, возможно имеющими отношение к механизму переноса.

У Е.coli имеется вторая сигнальная пептидаза, участвующая в процессинге пролипопротеинов. Эти полипептидные компоненты оболочки Е.coli замечательны тем, что при созревании их N-конец модифицируется с помощью глицерида. Пролипопротеиновая сигнальная пептидаза также находится в цитоплазматической мембране. После отщепления сигнальный пептид остается в цитоплазматической мембране и разрушается с помощью мембраносвязанного фермента протеазы ΙV.

В митохондриях и хлоропластах должно присутствовать несколько сигнальных пептидаз, поскольку процессинг происходит более чем в одном компартменте. Растворимую пептидазу из митохондриального матрикса удалось частично очистить, но охарактеризована она не полностью.

4. Растворимые и мембраносвязанные белки, необходимые для

переноса

Идентифицировано несколько цитозольных и мембраносвязанных белковых компонентов, необходимых для переноса. Наиболее детально охарактеризованы белковые факторы, участвующие во встраивании белков в эндоплазматический ретикулум млекопитающих (рис.3).

1. Сигнал-распознающая частица (СРЧ). Это растворимый рибонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из шести разных белков и молекулы 7S-РНК. СРЧ необходима для инициации переноса. Она связывается с сигнальной последовательностью образующегося полипептида во время его синтеза на рибосоме. Для препролактина, например, константа диссоциации составляет 1нМ. С помощью метода фотохимического сшивания был идентифицирован один из полипептидов (54 кДа), непосредственно взаимодействующий с сигнальной последовательностью предшественника. По некоторым данным, полученным для бесклеточных систем, связывание СРЧ ингибирует трансляцию или вызывает ее задержку. Впрочем, не исключено, что этот феномен является артефактом; во всяком случае, как было показано на модельных опытах, его не обязательно привлекать для объяснения кинетики переноса белков in vivo. Одна из вероятных функции СРЧ состоит в предотвращении неправильного свертывания образующегося полипептида, которое может блокировать перенос (например, из-за экранирования сигнальных последовательностей). Задержка трансляции должна уменьшать вероятность такого ошибочного свертывания и, следовательно, увеличивать эффективность переноса белков.

Рис.3. Схематическое изображение ранних стадий котрансляционного переноса полипептида через эндоплазматический ретикулум млекопитающих.

Сигнал-распознающая частица и СРЧ-рецептор (стыковой белок) хорошо охарактеризованы. Мембраносвязывающий сигнальный рецептор изображен как компонент канала через мембрану, но существование таких каналов и роль сигнального рецептора не бесспорны. После образования комплекса между сигнальным пептидом и мембраносвязанным рецептором на стадии 3 СРЧ и стыковочный белок могут диссоциировать и принимать участие в новом цикле, оставляя мембраносвязанную рибосому и образовавшуюся цепь присоединенными к аппарату переноса.

Некоторые небольшие белки (<8,5 кДа) транспортируются в эндоплазматический ретикулум независимо от СРЧ. В их число входят препропептид GLa лягушки, препромеллитин (оба они являются предшественниками секретируемых белков) и пробелок оболочки фага М13. Во всех этих примерах конформация предшественника такова, что белки должны оставаться способными к переносу даже в отсутствии СРЧ и рибосом.

2. Рецептор СРЧ, или стыковочный белок. Комплекс СРЧ/рибосома/образующаяся полипептидная цепь транспортируется в шероховатый эндоплазматический ретикулум, преодолевая энергию сильного взаимодействия между СРЧ, называемым также стыковочным белком. Рецептор СРЧ содержит субъединицу с молекулярной массой 73 кДа, присоединенную N-концом к мембране. Вероятно, рибосома также связывается со специфическими рецепторами, присутствующими в мембране.

3. Рецептор сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность на образующейся полипептидной цепи перемещается от СРЧ ко второму рецептору, находящемуся в мембране и называемому рецептором сигнальной последовательности. Об этом свидетельствуют результаты опытов по фотохимическому сшиванию, в которых используется метка, связанная с сигнальной последовательностью препролактина. Предполагаемый мембраносвязанный рецептор представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 35 кДа. Возможно, он образует часть канала, через который осуществляется перенос. С помощью такого же подхода с использованием поперечной сшивки и синтетического сигнального пептида был обнаружен еще один кандидат на роль рецептора сигнальной последовательности (45 кДа). Связь между этими двумя белками неизвестна и функции их до конца не установлены. Как только образовавшаяся полипептидная цепь связывается с мембраносвязанным рецепторм, СРЧ и ее рецептор могут освободиться от рибосомы и принять участие в новом цикле. О предполагаемом канале, участвующем в переносе, ничего неизвестно; очистка его является довольно сложной задачей.

5. Сборка мультисубъединичных комплексов и обновление

мембранных белков

После встраивания мембранного полипептида в мембрану он еще должен приобрести правильную конформацию, обеспечивающую его биологическую активность, а если речь идет о мультисубъединичных комплексах, то связаться с другими белками. В частности, у эукариот при этом должны произойти различные ковалентные модификации, например гликозилирование, ацилирование, сульфирование или образование дисульфидных связей. Даже когда такие модификации не являются необходимыми, процесс конформационного созревания может быть медленным и отстоять по времени от встраивания в мембрану.

Например, у Е.coli четко наблюдается сборка стабильных тримеров обоих белков, LamB и OmpF, после включения соответствующих мономеров в наружную мембрану, при этом созревание LamB занимает около 5 мин. В эукариотических клетках гликопротеин гемагглютинина вируса гриппа, прежде чем попасть из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи, должен сформировать правильную четвертичную структуру, соответствующую зрелой форме. Несвернутые молекулы гемагглютинина остаются в эндоплазматическом ретикулуме. Образование тримеров занимает примерно 7-10 мин. Сходная олигомеризация наблюдается также для G-белка вируса везикулярного стоматита.

Сборка многих субъединичных комплексов, содержащих разные субъединицы, тоже, по-видимому, происходит в эндоплазматическом ретикулуме. Примером служит никотиновый ацетилхолиновый рецептор, который содержит две α-субъединицы и по одной β-, γ- и δ-субъединице (рис.4).

Рис.4. Модель канала никотинового ацетилхолинового рецептора.

Показаны общий вид канала и его расположение в мембране, отмечены участки гликозилирования с наружной стороны и места связывания ацетилхолина на α-субъединицах.

С помощью антител можно различить отдельные формы α-субъединицы: 1) начальный продукт, встраивающийся в эндоплазматический ретикулум; эта форма не может связывать антагонист α-бунгаротоксин; 2) форма, способная связываться с α-бунгаротоксином и образующаяся через несколько минут после завершения трансляции в эндоплазматическом ретикулуме; 3) зрелый рецептор, содержащий все субъединицы (α2βγδ), который обнаруживается через 15мин после завершения трансляции в эндоплазматическом ретикулуме; 4) готовый рецептор на клеточной поверхности, появляющийся спустя примерно 2ч после трансляции. Созревание включает образование дисульфидных связей, олигосахаридный процессинг и ацилирование при участии жирных кислот. Вероятно, определенную роль в сборке, происходящей в комплексе Гольджи, играет фосфорилирование субъединиц.

Решающим фактором процесса сборки является, вероятно, стабильность таких стехиометрических комплексов, как ацетилхолиновый рецептор. По-видимому, в некоторых системах отдельные субъединицы синтезируются в значительном избытке и не образуют стабильных комплексов, а подвергаются протеолитическому расщеплению.

Изучался также процесс созревания и сборки структуры, образующей Na-канал. Необходимым условием созревания является образование дисульфидной связи между α- и β2-субъединицами, однако, это событие происходит спустя примерно 1ч после трансляции и транспорта субъединиц в аппарат Гольджи, а рецептор появляется на клеточной поверхности через 4ч после трансляции. В этом случае свободные α- субъединицы не подвергаются быстрой деградации, а сохраняются в межклеточном пуле и, возможно, используются в дальнейшем в качестве предшественников для формирования канала в растущих нейронах.

Созревшие мембранные белки подвергаются непрерывному обновлению. Период полуобновления Na-канала составляет около 30ч, что типично для поверхностных белков. Обновление большой субъединицы Na/К-АТРазы в растущих клетках в культуре происходит за время 20-40ч. По-видимому, деградация по крайней мере некоторых белков происходит в лизосомах.

Примеры обновления мембранных белков

Стабильность белков в клетке определяется множеством различных факторов. Особенно интересным примером деградации мембранных белков является гидроксиметилглутарил-СоА-редуктаза. Этот фермент находится в гладком эндоплазматическом ретикулуме и регулирует эндогенный синтез холестерола. Деградация его происходит довольно быстро (~2-4ч) и ускоряется при взаимодействии с холестеролом. Для ускорения процесса необходимо наличие мембраносвязанного домена фермента. При определенных условиях в культуре ооцитов китайского хомячка наблюдается сверхпродукция (более 500раз) этого фермента. В результате образуются мембранные трубочки, занимающие 15% клеточного объема и содержащие другие мембранные белки, а также липиды. Добавление холестерола приводит к быстрой деградации избытка мембран, что говорит о координации синтеза и деградации мембранных компонентов.

Другим интересным примером селективного метаболизма мембранных белков является гербицидсвязывающий белок (называемый также белком Dl или QВ) с молекулярной массой 32 кДа из тилакоидов хлоропластов. Этот белок синтезируется как предшественник, созревая внутри отдельных ламелл тилакоида, не собранных в граны, и является частью фотосистемы ΙΙ в ламеллах, входящих в граны. На свету скорость деградации этого полипептида в мембране намного выше, чем других белков. Причина этого явления неизвестна; возможно, оно связано с тем, что в фотосистеме ΙΙ на свету происходят какие-то повреждения.

Выводы

Клетки эукариот содержат много мембранных органелл и множество различных внутриклеточных мембран, каждая из которых обладает уникальным белковым составом. Любой мембранный белок, информация о синтезе которого заключена в ядре, должен безошибочно доставляться от места синтеза на рибосоме, находящейся в цитоплазме, к месту назначения. Для этого используется сложная система сигнальных последовательностей, содержащихся в любой зрелой форме полипептида или предшественника, а также рецепторы внутри клетки, способные эти сигналы распознать. Некоторые мембранные белки включаются в липидный бислой самопроизвольно, но в большинстве случаев правильная сборка белка внутри клеточной мембраны является энергозависимым процессом, который осуществляется с помощью специализированного аппарата. По-видимому, белки не могут включиться в клеточную мембрану до тех пор, пока они не приобретут частично развернутую конформацию. Разворачивание белков или поддержание их в развернутой конформации, необходимой для переноса, возможно, осуществляются при участии АТР и специфических белков в цитоплазме.

Литература

1. Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции: Пер. с англ. – М.: Мир, 1997.

2. Мари Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2-х томах. Т.2. Пер. с англ. – М.: Мир, 1993.

3. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке: Пер. с англ. – М.: Мир, 1980.

4. Страйер Л. Биохимия: Пер. с англ. – М.: Мир, 1984. – Т.1.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

1. Естественный отбор как элементарный эволюционный фактор

2. Формы естественного отбора

3. Элементарный эволюционный процесс

Заключение

Список литературы

ВВЕДЕНИЕ

В любом биогеоценозе противоречия между особями одного или разных видов разрешаются в борьбе за существование. Закономерным результатом борьбы за существование является гибель одних особей популяции и выживание и размножение других, т.е. естественный отбор. Принцип естественного отбора Ч. Дарвина имеет основополагающее значение в эволюционной теории. Естественный отбор является ведущим, направляющим, движущим фактором эволюционного развития органического мира. В настоящее время представления об отборе пополнены новыми фактами, расширились и углубились.

При увеличении численности популяции некоторые факторы среды, такие как пища (для животных) или свет (для растений), становятся лимитирующими. Это приводит к конкуренции за ресурсы между членами популяции. Организмы, индивидуальные особенности которых дают им преимущество в конкуренции, будут легче овладевать этими ресурсами, выживут и оставят потомство. Организмы, лишенные таких признаков, окажутся в невыгодном положении и могут погибнуть, прежде чем успеют произвести потомство. Совместное действие лимитирующих факторов среды и численности популяции создает давление отбора, интенсивность которого может быть различной.

Естественный отбор — основной движущий фактор эволюции живых организмов. К мысли о существовании естественного отбора пришли независимо друг от друга и почти одновременно несколько английских натуралистов : В. Уеллс (1813г.), П. Мэтью (1831г.), Э. Блайт (1835, 1837гг.), А. Уоллес (1858г.), Ч. Дарвин (1858, 1859гг.); но только Дарвин сумел вскрыть значение этого явления как главного фактора эволюции и создал теорию естественного отбора. В отличие от проводимого человеком искусственного отбора, естественный отбор обусловливается влиянием на организмы окружающей среды. Согласно Дарвину, естественный отбор — это “ переживание наиболее приспособленных ” организмов, вследствие которого на основе неопределённой наследственной изменчивости в ряду поколений происходит эволюция.

Сохранение благоприятных индивидуальных различий и изменений и уничтожение вредных — есть Естественный отбор, или переживание наиболее приспособленных. Действие естественного отбора не распространяется на изменения бесполезные, безвредные, они представляют либо колеблющийся элемент, вроде изменений наблюдаемый у некоторых полиморфных видов, либо закрепляются в зависимости от природы организма и свойств окружающих условий. Лучше всего понятен вероятный ход естественного отбора, взяв страну, в которой происходит некоторое физическое изменение, например климата. Относительные количества её обитателей немедленно подвергнутся изменению, а некоторые виды вымрут. На основании этого следует, что всякое изменение относительной численности одних обитателей глубоко повлияет на других обитателей независимо от изменения самого климата. В таких случаях ничтожные изменения, в каком-либо отношении полезные для особей того или иного вида в смысле лучшего приспособления их к изменившимся условиям, стремились бы сохраниться, и естественный отбор имел бы полный простор для своего улучшающего действия.

ЕСТЕСТВЕННЫЙ ОТБОР КАК ЭЛЕМЕНТАРНЫЙ ЭВОЛЮЦИОННЫЙ ФАКТОР

Сохранение благоприятных индивидуальных различий и изменений и уничтожение вредных я назвал естественным отбором или переживанием наиболее приспособленных

Ч. Дарвин

В современном понимании принцип естественного отбора включает в себя следующее:

индивидуальная изменчивость влияет на вероятность выживания и размножения особей в популяции;

индивидуальные черты особей в популяции наследственны (генетически предопределены), по крайней мере частично;

доля генов в популяции, которые увеличивают успех выживания и размножения особей, возрастает со временем.

Естественный отбор — основная движущая сила эволюции, и любой вид живых организмов, когда либо живший на Земле, так или иначе формировался под действием естественного отбора. Косвенных доказательств реальности отбора очень много — некоторые из них рассматриваются в разделе адаптации — но реально наблюдать этот процесс в природе довольно сложно. Для этого мы должны:

заметить какие-либо изменения внешнего облика особей в популяции того или иного вида,

показать, что эти изменения происходят под воздействием внешней среды и носят приспособительных характер,

доказать, что в данной популяции существует наследственная изменчивость по отбираемому признаку.

Подобно тому, как человек достиг значительных результатов, накопляя в каком-нибудь данном направлении индивидуальные различия, того же мог достигнуть и естественный отбор, но намного легче, так как действовал в течении несравненно более продолжительных периодов времени. Человек может влиять только на наружные и видимые признаки; природа заботится о внешних признаках лишь в той степени, в какой они полезны существу. Она может влиять на всякий внутренний орган, на каждый оттенок конституционных особенностей, на весь жизненный механизм. Человек отбирает для своей пользы, природа — только ради пользы организма. Каждая особенность строения, подвергшаяся отбору, утилизируется ею вполне, это вытекает из самого факта отбора данной особенности.

В общем, можно сказать, что естественный отбор ежедневно и ежечасно расследует по всему свету мельчайшие изменения, отбрасывая дурные, сохраняя и слагая хорошие, работая неслышно и невидимо, где бы и когда бы не ни представился к этому случай, над усовершенствованием каждого органического существа, в связи с условиями его жизни, органическими и неорганическими. Человек не видит этих медленно совершающихся изменений в их движении вперёд и успевает только замечать несходство современных форм жизни с когда-то существовавшими.

Хотя естественный отбор может действовать только на пользу данного организма и только в силу этой пользы, тем не менее признаки и строение, которые кажутся совершенно незначительными, могут войти в круг действия отбора. Когда насекомые, питающиеся листьями, зелёного цвета, а питающиеся корой — пятнисто — серые, альпийская куропатка зимой белая, а красный тетерев окрашен под цвет вереска, надо полагать, что эти окраски приносят пользу этим птицам и насекомым, предохраняя их от опасностей. Рассматривая эти различия между видами, которые кажутся несущественными, нельзя забывать, что на них прямым образом влияли климат, пища и пр. Также в силу закона корреляции надо отметить, что когда изменяется одна часть и изменения накапливаются путём естественного отбора, возникают и другие изменения, нередко самого неожиданного свойства.

Если изменения, проявляющиеся при одомашнении в известном периоде жизни, стремятся проявиться у потомства в том же периоде, — то и в природном состоянии естественный отбор будет действовать на организмы и видоизменять их во всяком возрасте путём выгодных для этого возраста изменений и путём их унаследования в соответствующем же возрасте. Естественный отбор может изменить и приспособить личинку насекомого к многочисленным условиям, совершенно отличным от тех, в которых живёт взрослое насекомое; а эти изменения, в силу закона корреляции, могут воздействовать и на взрослую форму. Точно также и обратно: изменения у взрослых насекомых могут и отразиться на строении личинки; но во всяком случае естественный отбор обеспечит их безвредность, потому что в противном случае обладающий ими вид подвергнется вымиранию. Естественный отбор изменяет строение детёнышей сравнительно с родителями и родителей сравнительно с детёнышами. У общественных животных он приспособляет строение каждой особи к потребностям всей общины, если только община вынесет пользу из этого подвергшегося отбору изменения особи. Чего не может естественный отбор — это изменить строение какого-нибудь вида без всякой пользы для него самого, но на пользу другому виду.

2. ФОРМЫ ЕСТЕСТВЕННОГО ОТБОРА

Выделяют три основные формы естественного отбора — стабилизирующий, движущий (или направленный), и дизруптивный (раздробляющий). Это деление довольно условно, и зачастую не всегда можно точно определить, к какой из форм относиться данный конкретный пример естественного отбора.

Стабилизирующий отбор направлен на поддержание в популяциях среднего, ранее сложившегося значения признака или свойства. Он действует при относительно постоянных (колеблющихся в определенных пределах) условиях внешней среды. При стабилизирующем отборе преимущество в размножении получают наиболее типичные особи в популяции, особи же, заметно уклоняющиеся от установившейся нормы, устраняются естественным отбором. Эта форма отбора самая обычная, но заметить ее сложно, так как в этом случае не происходит изменения морфологического облика организмов в популяции.

Движущим или направленным называется отбор, способствующий сдвигу среднего значения признака или свойства в популяции. Эта форма отбора возникает при изменении условий существования и приводит к установлению новой нормы взамен ранее существующей.

Дизруптивным или раздробляющим отбором (disrupt — разрывать, раздроблять, англ.) называют отбор, идущий одновременно в пользу нескольких уклоняющихся вариантов против особей с промежуточным значением признака. Эта форма отбора возникает в случаях, когда ни одна из групп генотипов не получает решающего преимущества в борьбе за существование из-за разнообразия условий, одновременно встречающихся на одной территории. Дизруптивный отбор способствует возникновению и поддержанию полиморфизма популяций, а в некоторых случаях может служить причиной видообразования (см. раздел симпатрическое видообразование).

3. ЭЛЕМЕНТАРНЫЙ ЭВОЛЮЦИОННЫЙ ПРОЦЕСС

Эволюционная теория утверждает, что каждый биологический вид целенаправленно развивается и изменяется для того, чтобы наилучшим образом приспособиться к окружающей среде. В процессе эволюции многие виды насекомых и рыб приобрели защитную окраску, еж стал неуязвимым благодаря иглам, человек стал обладателем сложнейшей нервной системы. Можно сказать, что эволюция — это процесс оптимизации всех живых организмов. Рассмотрим, какими же средствами природа решает эту задачу оптимизации.

Основной механизм эволюции — это естественный отбор. Его суть состоит в том, что более приспособленные особи имеют больше возможностей для выживания и размножения и, следовательно, приносят больше потомства, чем плохо приспособленные особи. При этом благодаря передаче генетической информации (генетическому наследованию) потомки наследуют от родителей основные их качества. Таким образом, потомки сильных индивидуумов также будут относительно хорошо приспособленными, а их доля в общей массе особей будет возрастать. После смены нескольких десятков или сотен поколений средняя приспособленность особей данного вида заметно возрастает.

Чтобы сделать понятными принципы работы генетических алгоритмов, поясним также, как устроены механизмы генетического наследования в природе. В каждой клетке любого животного содержится вся генетическая информация этой особи. Эта информация записана в виде набора очень длинных молекул ДНК (ДезоксирибоНуклеиновая Кислота). Каждая молекула ДНК — это цепочка, состоящая из молекул нуклеотидов четырех типов, обозначаемых А, T, C и G. Собственно, информацию несет порядок следования нуклеотидов в ДНК. Таким образом, генетический код индивидуума — это просто очень длинная строка символов, где используются всего 4 буквы. В животной клетке каждая молекула ДНК окружена оболочкой — такое образование называется хромосомой.

Каждое врожденное качество особи (цвет глаз, наследственные болезни, тип волос и т.д.) кодируется определенной частью хромосомы, которая называется геном этого свойства. Например, ген цвета глаз содержит информацию, кодирующую определенный цвет глаз. Различные значения гена называются его аллелями.

При размножении животных происходит слияние двух родительских половых клеток и их ДНК взаимодействуют, образуя ДНК потомка. Основной способ взаимодействия — кроссовер (cross-over, скрещивание). При кроссовере ДНК предков делятся на две части, а затем обмениваются своими половинками.

При наследовании возможны мутации из-за радиоактивности или других влияний, в результате которых могут измениться некоторые гены в половых клетках одного из родителей. Измененные гены передаются потомку и придают ему новые свойства. Если эти новые свойства полезны, они, скорее всего, сохранятся в данном виде — при этом произойдет скачкообразное повышение приспособленности вида.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В начале XX века, на заре генетики, многие исследователи отрицали роль естественного отбора как созидающего фактора. Основной эволюционной силой считался мутационный процесс как единственная причина возникновения новых признаков и свойств организма. Поскольку мутация — явление исключительно редкое (установлено, что в среднем мутирует один ген из миллиона), естественному отбору отводили роль простого «контролера», вступающему в действие только после появления нового генетического отклонения.

Однако дальнейшие исследования показали, что в природных популяциях любого вида существует огромный запас генетической изменчивости по самым разнообразным признакам. Таким образом, у естественного отбора всегда есть огромный материал для работы. В лабораторных экспериментах удалось установить, что с помощью отбора можно изменять практически любые свойства организма, даже такие, как доминантность или рецессивность тех или иных признаков.

Действительно, единственным источником «эволюционного материала» (наследственной изменчивости) является мутационный процесс. Но это не отрицает творческую роль естественного отбора: его можно сравнить со скульптором, который создает прекрасные предметы искусства лишь отсекая от глыбы мрамора «ненужные» куски.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Алексеев В.П. Становление человечества. М.,1984. Бор Н. Атомная физика и человеческое познание. М.,1961 Борн М. Эйнштейновская теория относительности.М.,1964.

Власова З.А. Биология. Справочник студента – М.,1997

Воронцов Н. Н., Сухорукова Л. Н. Эволюция органического мира – М., 1996.

Грин Н. Биология – М., 2003

Камлюк Л.В. Биология в вопросах и ответах – Минск, 1994

Лемеза Н.А. Пособие по биологии – Минск, 1998

Мамонтов С.Г. Биология – М., 2004

Сидоров Е.П. Общая биология – М.,1997

Ярыгин В.Н. Биология – М., 2001

14

Реферат

ЕСТЕСТВОЗНАНИЕ В НАУКЕ И КУЛЬТУРЕ

Содержание.

Глава 1. Естественно-научная и гуманитарная культуры 3

1.1. О взаимоотношениях двух типов культур 3

1.2. Интеграция естественно-научной и гуманитарной культур 8

Глава 2. Основные сведения о науке 10

2.1. Понятие о науке и взаимосвязь науки, техники и материального производства

2.2. Зарождение науки, основные тенденции её развития 13

2.3. Организация научных исследований в Российской Федерации 17

Библиографический список 23

Глава 1. ЕСТЕСТВЕННО—НАУЧНАЯ И ГУМАНИТАРНАЯ КУЛЬТУРЫ

О взаимоотношениях двух типов культур

Человек обладает знанием об окружающей его природе (Вселенной), о самом себе и собственных произведениях. Это делит всю имеющуюся у него информацию на два больших раздела — на естественно-научное (естественное в том смысле, что изучается то, что существует независимо от человека, в противоположность искусственному — созданному человеком) и гуманитарное (от «гомо» — человек) знание.

Под этими терминами понимают две различные традиции, которые сформировались в изучении природы, т.е. в естествознании, с одной стороны, и в исследовании явлений духовной жизни общества, т.е. в гуманитарных науках, с другой. Это различие обусловлено самой спецификой объектов изучения естественных и гуманитарных наук.

В природе действуют стихийные и независимые от человека процессы, в обществе ничего не совершается без сознательных целей, интересов и мотиваций. На этом основании естественно — научную культуру нередко противопоставляют культуре гуманитарной. Поскольку методы исследования в естествознании сформировались раньше, чем в гуманитарных науках, то в истории познания делались неоднократные попытки перенести их целиком и полностью, без соответствующих изменений и уточнений, в гуманитарные науки.

Такие попытки не могли не встретить сопротивления и критики со стороны специалистов, изучавших явления социальной жизни и духовной культуры. Иногда подобное сопротивление сопровождалось полным отрицанием какого-либо значения методов естествознания для исследования социально-культурных и гуманитарных процессов. Однако в последние десятилетия под влиянием научно-технической революции и возникновения новых общенаучных и междисциплинарных направлений исследования былая конфронтация между естествоиспытателями и гуманитариями все больше уступает место согласию и стремлению понять и использовать методы друг друга.

Самое главное различие между естественно — научной и гуманитарной культурами выражается в истолковании их подхода к основным функциям науки, важнейшие из которых — объяснение, понимание и предсказание явлений.

Сначала определимся с основными понятиями. Поскольку речь идёт о типах культур, то в определении нуждается само понятие «культура».

Культура (от лат. Cultura — возделывание, воспитание, образование, развитие, почитание) — определённый уровень развития общества, творческих сил и способностей человека, выраженный в типах и формах организации жизни и деятельности людей, а также в создаваемых ими материальных и духовных ценностях.

С помощью данного понятия подчёркивается надприродный, чисто социальный характер человеческого бытия. Культура — это всё, что создано человеком как бы в добавление к природному миру, хотя и на основе последнего.

Однако, мир человеческой культуры существует не рядом с природным, а внутри него и потому неразрывно с ним связан. Следовательно, всякий предмет культуры имеет природную основу и его социальное содержание и оформление.

В более узком смысле слово «культура» означает сферу духовной жизни людей. Она включает в себя предметные результаты деятельности человека, а также человеческие силы и способности, реализуемые в деятельности (знания, умения, навыки, уровень интеллекта, нравственного и эстетического развития, мировоззрение, способы и формы общения людей).

Каждая общественно-экономическая формация характеризуется определенным типом культуры, который меняется с переходом от одной общественно-экономической формации к другой. При этом наследуется все ценное из прошлого.

Развитие культуры, а значит, развитие любого общества зависит от множества факторов: производственно-экономических, социальных, политических, этнических, идеологических и т. д. Но всегда творцом культуры остается живой человек. Процессы овладения культурой новыми поколениями и механизмы их приобщения к достижениям культуры изучаются специалистами.

В настоящее время выявлено три типа трансляции культуры.

1. Способ приобщения культуры через обучение старшими поколениями младших. Этот тип культуры достаточно консервативен и господствует в традиционных обществах. Здесь люди неохотно включаются в процессы нововведений, не любят самостоятельности и инициативы. Творчество здесь не связано сo знанием чего-то принципиального.

Обучение взрослых и детей у своих сверстников. В этом случае новации и нововведения, самостоятельное творчество характерны для людей любого поколения. При этом типе культуры формируется высокий творческий потенциал общества. Именно такая передача культурных достижений свойственна всем великим цивилизациям Земли.

Приобщение к культуре, когда старшие поколения учатся у своих детей. Молодежь значительно легче схватывает новшества, она не отягощена грузом прошлого опыта, ее характеризует склонность к переменам, и у нее достаточно высоко развит творческий потенциал (подростки, например, гораздо быстрее осваивают компьютер, чем люди старшего поколения, то же относится и к современной радио-, теле- и видеопродукции). К такому виду культур переходит все большее количество народов, в том числе и Россия делает шаги в направлении от традиционной трансляции культуры к формированию современного творческого потенциала.

Интересен взгляд современных исследователей. Они рассматривают цивилизацию как нечто внешнее по отношению к человеку, противостоящее ему и на него воздействующее, в то время как культура всегда является внутренним достоянием человека, показывает меру его развития и служит как бы символом его духовного богатства. Сегодня все больше приверженцев получает триада: «человек, человечество, человечность», т.е. все опреде­леннее проявляется стремление уравнять ритмы истории и ритмы жизни человека и человечества, приподнять ценности гуманизма. В настоящее время коренные изменения в культуре происходят на протяжении жизни уже одного поколения. Потеря национального культурного разнообразия равноценна утрате разнообразия генетического и очень опасна для будущего человечества. Люди должны научиться жить вместе, что может стать основой новой морали и новых отношений в мире человечества. Единство человечества и национальное разнообразие — две стороны одной и той же медали.

Культура — одна из важнейших характеристик человеческой жизнедеятельности. Каждый индивид представляет собой сложную биосоциальную систему, функционирующую за счет взаимодействия с окружающей средой. Необходимые, закономерные связи индивида с окружающей средой определяют его потребности, т.е. такие вещи природной и культурной среды, которые необходимы человеку для его нормального функционирования, жизнедеятельности и развития. Большинство потребностей человека удовлетворяется посредством труда. Система человеческой культуры — это мир вещей, предметов, созданных человеком для удовлетворения его потребностей.

Таким образом, под культурой в самом широком смысле этого слова принято понимать все то, что создано человеком (его деятельностью, трудом), человечеством в ходе его истории, в отличие от природных процессов и явлений, т.е. главная отличительная черта человеческой культуры состоит в том, что она созидается человеческим трудом. А процесс труда всегда осуществляется при непосредственном участии и направляющем воздействии сознания человека, его мышления, знаний, чувств, воли. Значит, культура — это «опредмеченный» мир человеческой духовности.

Культура есть продукт человеческой деятельности, а деятельность есть способ бытия человека в мире. Результаты человеческого труда постоянно накапливаются, и потому система культуры исторически развивается и обогащается. Многими поколениями людей создан грандиозный, колоссальный мир человеческой культуры.

Все, что созидается и используется человеком в производстве (сельскохозяйственном и промышленном), на транспорте, сооружено строителями, все, что достигнуто человечеством в правовой, политической, государственной деятельности, в системах образования, медицинского, бытового и других видов обслуживания, в науке, искусстве, религии, философии — все это принадлежит миру человеческой культуры.

Поля и фермы, выращенные человеком леса и парки, промышленные (фабрики, заводы и т.п.) и гражданские (жилые дома, учреждения и др.) постройки, транспортные коммуникации (дороги, трубопроводы, мосты и т.д.), линии связи, политические, правовые, образовательные и другие учреждения, научные знания, художественные образы, религиозные доктрины и философские системы — все это вещи человеческой культуры. Сейчас на Земле не просто найти такое место, которое бы в той или иной мере не было освоено человеческим трудом, которое не затронули бы деятельные руки человека, на котором не было бы печати человеческого духа.

Мир культуры окружает каждого. Каждый человек как бы погружен в море вещей, предметов человеческой культуры. Более того, индивид становится человеком постольку, поскольку он усваивает (выработанные предыдущими поколениями людей) формы деятельности по производству и использованию предметов культуры. В семье, в школе, в высшем учебном заведении, на работе, в общении с другими людьми мы осваиваем систему предметных форм культуры, «распредмечиваем» их для себя. Только на этом пути человек изменяет сам себя, развивает свой внутренний духовный мир, свои знания, интересы, навыки, умения, мировоззрение, ценности, потребности и др. Чем выше степень освоения человеком достижений культуры, тем больший вклад он может внести в ее дальнейшее развитие.

Развитие физики, биологии, общественных наук дало нам множество факторов, которые невозможно охватить единым взглядом. Ученые, работающие в близких областях, перестают понимать друг друга. Можно ли с этой точки зрения говорить о физиках, экономистах, юристах, биологах и т.д. как о представителях единой культуры, вносящих вклад в общую цивилизацию?

Английский писатель Чарльз Сноу сформулировал альтернативу «двух культур» – научно — технической и художественно-гуманитарной. По его мнению, они настолько разделены в современном мире, что представители каждой из них не понимают друг друга (вспомним деление на «физиков» и «лириков» в 60-х и 70-х гг. XX в.). Между ними образовалась пропасть, которая все время углубляется и расширяется, так как духовное и физическое необъединимы.

Без высокого профессионализма, конкретных детальных знаний дальнейшие исследования могут исчерпать себя. Необходим комплексный, разноплановый анализ, опирающийся на данные различных наук, требующий синтеза знаний, появления единых точек зрения, ведущий не только к объединению различных дисциплин, развитию конкретных областей знаний, но и к новому, целостному видению мира. И оно не менее необходимо для человека, чем конкретные знания конкретных наук.

Объяснение в самой общей форме можно определить как подведение явления, факта или события под некоторый общий закон, теорию или концепцию. Действительно, чтобы объяснить, например, факт, необходимо логически вывести высказывание о факте из определенного общего высказывания или утверждения, в качестве которых чаще всего выступают законы и теории. Мы должны постараться найти такое высказывание и подвести под него конкретный факт, случай или событие.

Чтобы объяснить, почему яблоки падают на землю, Ньютону, по малоправдоподобной легенде, пришлось открыть закон всемирного тяготения. В экономике для объяснения равновесия на рынке обращаются к закону спроса и предложения и т.п.

Среди историков и других ученых-гуманитариев есть также немало исследователей, которые заявляют, что методы объяснения оказываются вообще бесполезными в гуманитарных науках, поскольку в них главное внимание должно быть обращено не столько на общность, сколько на индивидуальность, неповторимость и даже уникальность событий и явлений духовной и социальной жизни. Поэтому они считают главным или даже почти единственным способом их исследования метод понимания, связанный с их истолкованием.

Пониманием называют способ, посредством которого можно интерпретировать или истолковывать явления и события индивидуальной духовной жизни и гуманитарной деятельности.

В гуманитарной методологии различают два подхода к процессу понимания, которые условно можно назвать психологическим и теоретическим.

К психологическому относят понимание, основанное на переживании одним человеком духовного опыта другого, его чувств, на­строений, мотиваций и т.п. Теоретическое понимание основывается, прежде всего, на интерпретации, или истолковании определенных фактов, событий и процессов.

Суть интерпретации в гуманитарной деятельности состоит в раскрытии целей, мотиваций и смысла действий и поступков людей. В этом отношении такое понимание сближается с телеологическими объяснениями.

Так, например, тексты, которые были написаны на древних языках, плохо сохранились, они трудно поддаются переводу, а потому их нелегко понять.

В этом случае понимание сводят только к раскрытию и усвоению того смысла, который вложил в текст его автор. Считается, что если раскрыт этот смысл, то тем самым он был понят. Именно так рассматривают понимание не только в обыденном познании и обучении, но и при переводе текстов с чужого языка на родной.

Несколько иначе обстоит дело с интерпретацией исторических событий, но и они истолковываются обычно c позиции результатов, достигнутых в настоящее время.

Для исследования же явлений природы вводятся понятия, открываются законы и строятся научные теории, с помощью которых интерпретируют эти явления.

Следовательно, достигают определенного понимания существующей в природе регулярности, повторяемости и закономерности, но такое понимание по своему характеру ближе к естественно — научному объяснению.

Поэтому понимание — это более сложный, противоречивый и запутанный процесс, чем объяснение.

Различие между ними состоит в том, что если объяснение сводится к логическому выводу, то понимание — к интерпретации. К логическому выводу обращаются и при предвидении событий, явлений и иных новых фактов.

Предвидение, или предсказание, по логической структуре не отличается от объяснения. Объяснение относится к событиям и фактам настоящим, а часто и к прошлым, предвидение же направлено к будущим событиям. Оно играет решающую роль не только в развитии теоретического знания, но особенно в процессе практического применения этого знания, обеспечивая возможность прогнозирования явлений и событий.

Интеграция естественно — научной и гуманитарной культур

Гуманитарные и естественные науки, а также формирующиеся на их основе типы культур разделены, но вместе с тем они нуждаются друг в друге и они не столько противоположны, сколько взаимодополнительны. Такое неразрывное единство двух культур может быть обусловлено несколькими соображениями.

Во-первых, традиционная дифференциация научного знания, характерная для естественных, технических и гуманитарных наук, подготовила основание для междисциплинарной взаимосвязи сложившейся их системы.

Во-вторых, аппарат современного научного знания фактически приспособлен для реализации интегративных представлений, которые обусловлены внутренней логикой формирования науки, универсальностью структур и приемов научного мышления.

В-третьих, разрешение общечеловеческих (глобальных) проблем возникающих в рамках цивилизаций в конце XX в., требует активизации процессов, связанных именно с интегративными тенденциями в структуре науки.

Осознается значение проблемного подхода в науке, сбываются прогнозы В.И. Вернадского, который еще в 30-х гг. XX в. отмечал реальность стирания граней между отдельными науками, целесообразности для ученых специализироваться не по наукам, а проблемам.

Традиционный дисциплинарный подход, выявляя свою ограниченность, постепенно заменяется проблемным подходом, в рамках которого обобщение научных и практических представлений происходит в контексте разрешения определенных задач (или их системы) социальной практики.

Выход на уровень взаимообогащения принципов и методов отражения объективной реальности, присущих естественно-научному, гуманитарному и художественному познанию, есть процесс «гуманизации» науки и «онаучивания» искусства, выявления закономерностей, управляющих как природными, так и социокультурными процессами. Единство знания все более осознается как одна из реальностей XXI в. Сегодня всё более проявляется тенденция к единству физического знания, т.е. формулирование общих теорий, пытающихся объяснить с единой точки зрения многообразие данных физического эксперимента. И хотя физики еще далеки от завершения единой физической теории, они объединяют свои усилия в процессе реализации программы единой теории физического взаимодействия.

Аналогичные тенденции в определенной степени характерны для всей современной системы наук о природе, человеке и обществе. Формируются науки и междисциплинарные направления научных исследований (систематика, синергетика и др.), ориентированные на выявление и познание общих закономерностей, управляющих процессами самоорганизации в системах разной природы (физических, химических, биологических, социальных и др.).

Основу взаимного проникновения двух культур составляет представление о «единстве мира», которое и обусловливает, в конечном счете, единство научного и гуманитарного знания. Из единства естественно-научного и социокультурного бытия выводится единство знания о мире, основанное на единой системе методов. Тем самым обозначается идея общности теоретических и социокультурных оснований научного знания.

Синергетический подход к развитию социоприродных систем принципиальным образом меняет представление о формирующейся культуре, как совокупности духовных, материальных и природных ценностей, созданных и сохраненных в процессе социокультурного развития цивилизации.

В заключении отметим, что, несмотря на всю неоспоримость тенденций сближения естественно-научной и гуманитарной культур, речь не идёт о полном их слиянии. Вполне необходимым и достаточным будет разрешение конфликта между ними на основе принципа дополнительности.

Глава 2. ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ О НАУКЕ.

2.1. Понятие о науке и взаимосвязь науки, техники и материального производства.

Главное назначение научной деятельности — получение знаний о реальности. По содержанию же научное знание характеризуется стремлением к человека к истине, к раскрытию наиболее глубоких и общих оснований рассматриваемого круга явлений, в предельном случае всего мира в целом.

Наука играет огромную роль в развитии человеческого общества. Она пронизывает все сферы нашей деятельности как материальной, так и духовной и по праву является неотъемлемым звеном социально-политического развития страны. В литературе имеется ряд определений понятия «наука». Одни из них определяют науку как сумму знаний, достигнутых человеком, другие — как род человеческой деятельности, направленный на расширение познаний человеком законов окружающей природы и развития общества.

Однако наиболее общим определением можно считать следующее: наука — сфера человеческой деятельности, функции которой состоят в выработке, теоретическом обобщении, проверке истинности и изыскания возможностей применимости объективных знаний.

Следовательно, наука как одна из форм общественного сознания направлена на получение новых знаний и установление способов их практического применения. Реализация этих способов осуществляется непосредственно через технику. Этим подчеркивается огромное значение науки и техники в нашей жизни.

Так было не всегда. Зачатки науки и техники появились еще в древнем мире, но развивались они обособленно друг от друга. Древние греки, на­пример, создав одну из замечательных культур, старались познать природу, но тяжелую работу у них выполняли рабы, а не созданные на основе научного прогресса машины. Только в Новое время, по мнению В. Гейзенберга, отношение человека к природе превращалось из созерцательного в практическое, т.е. естествознание превратилось в технику, точнее, оно соединялось с техникой в единое целое.

Техника — это совокупность искусственных средств, используемых в деятельности людей. Техника является одной из форм реализации научных знаний. Поэтому развитие современной техники обусловлено развитием науки, которая теперь играет ведущую роль по отношению к технике. Значительные технические новшества достигаются в наше время не путем эмпирических поисков, а через приложение научно-теоретических знаний. В свою очередь, потребности развития техники стимулируют и направляют научные исследования.

О тесной связи между наукой и техникой свидетельствует даже термин «научно-техническая революция».

Современный этап научно-технического прогресса — эпоха НТР — это коренное преобразование производительных сил общества на основе превращения науки в ведущий фактор развития общественного производства и всей жизни общества. Наука превращается в непосредственную производительную силу, тесно переплетается с техникой и производством, и это изменяет весь облик общественного производства, условия, характер и содержание труда, структуру производительных сил, оказывает воздействие на все стороны жизни.

Научно-техническая революция повысила благосостояние народов, которые в первую очередь воспользовались её результатами (преимущественно развитые страны). В этих странах была существенно снижена детская смертность и одновременно возросла продолжительность жизни. Произошли кардинальные изменения в быту: обычными предметами обихода стали телевизоры, магнитофоны, видеотехника, персональные компьютеры. Жизнь стала более удобной и комфортной. О степени развития стран судят по тому, насколько в них используются достижения НТР.

Но вот какое противоречие имеет место. Применяя какое-либо достижение науки, и получая при этом определённый результат, часто вслед за ожидаемой пользой человек имеет нежелательные последствия. Это можно проследить в промышленности, сельском хозяйстве, энергетике. Природа разрушается, исчезают или становятся редкими и заносятся в «Красную книгу» отдельные виды животных и растений, загрязняются реки, моря, океаны, атмосфера, почва, литосфера. Природа может существовать без человека, а вот человек вне природы жить не может и поэтому, что плохо для природы, в итоге отрицательно сказывается на человеке.

Роль науки в жизни общества неуклонно возрастала на протяжении последних столетий. Соответственно, можно говорить и о возрастании мировоззренческого значения науки. Наука и НТР в целом продолжают и поныне оказывать огромное воздействие на формирование мировоззрения людей. Причем как сами научные достижения, например синергетика, так и их применение в традиционных направлениях научного поиска (информатика).

Научные достижения оказывают как положительное, так и отрицательное влияние, о чем свидетельствует современная экология. Мировоззренческое значение имеют и новые научно-методологические средства, как, например, системный подход. Есть все основания думать, что и в обозримом будущем мировоззренческое значение науки будет возрастать.

Существует воздействие и в обратном направлении. Не только НТР влияет на мировоззрение, но и мировоззренческие сдвиги оказывают большое влияние на направление научных исследований.

В настоящее время науку как систему в целом условно подразделяют на естественные и социально-философские науки. Первые изучают законы и явления окружающей природы и включают в себя физику, химию, биологию и др., вторые — закономерности общественной жизни (к ним относятся: история, политология, философия и др.). Среди естественных наук особое место занимают технические, направленные на разработку и совершенствование имеющихся средств, машин и устройств для осуществления производств, процессов и удовлетворения различных потребностей общества. Наука через технику тесным образом связана с производством, что превращает ее в непосредственную производительную силу общества. Процесс производства каждого нового продукта, новых технических средств начинается в кабинетах ученых и в лабораториях исследователей. Прежде чем вещь будет произведена реально, она должна быть так или иначе произведена идеально. На пути от «идеального» возникновения продукта к «реальному» расположены различные звенья цепи, имеют место разные виды деятельности. Каковы эти звенья?

«Дилогические» предпосылки исследования. Сюда относится художественно-образная основа интеллектуальной деятельности мышления, воображения, ассоциативные способности, интуиция, которые служат импульсом научного творчества. Данное звено представляет собой ту сферу, где искусство смыкается с наукой, где образная художественная деятельность переводится в рациональный план. В этой, к сожалению, наименее исследованной до сих пор сфере — генетический исток и тайна научных открытий.

Методология мировоззрения представляет собой область производства духовных средств производства в науке, т.е. методов и приемов мышления, методов и приемов научного познания. Эту сферу обслуживают преимущественно философия и научные дисциплины, возникшие на стыке философских и конкретных наук.

Затем следуют фундаментальные исследования, т.е. выработка таких гипотез, концепций, теорий в конкретных областях научной деятельности, которые могут в конечном итоге послужить основой для создания новых, а также для усовершенствования существующих изделий, материалов и технологических процессов. Производя фундаментальные исследования, ученый, зачастую, совершенно не представляет себе, когда и какое именно практическое значение получат их результаты.

Вопрос о практическом использовании результатов обретает некоторую определенность на стадии прикладных исследований. Последние направлены на выявление путей и способов применения познанных законов и явлений природы для целей производства.

Следующее звено — опытно-конструкторские разработки. Результаты, полученные в прикладных исследованиях, здесь подвергаются дальнейшей разработке с целью конструирования, испытания и усовершенствования технических устройств, новых технологических процессов и т.п. На этой стадии начинается внедрение научных достижений в производстве. Кончается ли на этом научно-исследовательский процесс?

Оказывается, нет. Даже после того, как новое изделие вступило в стадию массового производства (или новая технология уже внедрена и т.д.), оно нуждается в заботе исследовательской, так сказать «материнской» организации.

Последняя принимает участие в проведении дополнительных производственных исследований, которые делятся на три категории: 1) исследование новых производственных методов в действии; 2) исследование методов стандартизации и контроля качества продукции; 3) исследования, связанные с устранением «узких мест» в производстве с необходимостью сложного ремонта, отработки и совершенствования техники в процессе ее эксплуатации.

Но и тогда, когда научные достижения окончательно внедрены в производство, новый вид продукции, новая технология и т.д. нередко продолжают быть объектом дальнейшего совершенствования со стороны изобретателей.

Цель исследовательской деятельности, следовательно, должна включать также изобретательскую деятельность, которая ныне постепенно становится организованной, осуществляется все чаще на основании научного подхода к делу образованными кадрами. Наконец, замыкающим структурным звеном цепи, связывающей науку с производством, является собственно производственная деятельность.

Описанная цепь структурных звеньев не исчерпывает собой всей науки, она характеризует только ту часть науки, которая ориентирована на вещественный элемент производства — технику. Но наука не замыкается только на технике, она замыкается и на человеке, выступая в качестве ориентированной на личность.

Важным критерием научности является наличие цели научного познания, которая определяется как постижение истины ради самой истины, или теоретичность.

Если наука направлена только на решение практических задач, она перестает быть наукой в полном смысле этого слова. Так, существовавшие на Востоке научные знания, использовались лишь в качестве вспомогательных в религиозных магических церемониях и ритуа­лах.

Поэтому мы не можем говорить о наличии там науки как самостоятельного культурного феномена.

Отличительной чертой научного знания является его рациональный характер. Сегодня это положение кажется тривиальным, но ведь вера в возможности разума появилась далеко не сразу и не везде. Восточная цивилизация так и не приняла этого положения, отдавая приоритет интуиции и сверхчувственному восприятию.

Этот критерий тесно связан со свойством интерсубъективности научного знания, которое понимается как общезначимость, общеобязательность знания, его инвариантность, возможность получить один и тот же результат разными исследователями.

Определяющими признаками науки являются также наличие экспериментального метода исследования и математизация науки. Эти признаки появились в Новое время, придав науке современный облик, а также связав ее с практикой.

2.2. Зарождение науки, основные тенденции её развития

История зарождения науки насчитывает многие тысячи лет. Первые элементы наук появились в древнем мире в связи с потребностями общественной практики и носили сугубо практический характер.

Всего же (с точки зрения истории науки) человечество в своем познании Природы прошло три стадии и вступает в четвертую.

На первой из них сформировались общие представления об окружающем мире как о чем-то целом, едином. Появилась так называемая натурфилософия, которая была вместилищем идей и догадок. Так продолжалось до XV столетия.

С XV-XVI вв. началась аналитическая стадия, т.е. расчленение, выделение частностей, приведших к возникновению и развитию физики, химии и биологии, а также целого ряда других, более частных естественных наук.

Наконец, в настоящее время делаются попытки обосновать принципиальную целостность всего естествознания и ответить на вопрос, почему именно физика, химия, биология и психология стали основными и как бы самостоятельными разделами науки о Природе?

Происходит также и дифференциация науки, т.е. создание узких областей какой-либо науки, однако, общая тенденция идет именно к интеграции науки. Поэтому последнюю стадию (четвертую), начинающую осуществляться, называют интегрально-дифференциальной.

Рассмотрим подробнее эти эволюционные процессы науки. Собственно наука в современных её формах начала складываться в XVII-XVIII вв. и в силу основной закономерности своего развития превратилась в нашу эпоху в силу, оказывающую значительное влияние на все стороны жизни общества.

Ещё на заре своего развития человечество улучшало условия жизни за счет познания и некоторого преобразования окружающего мира. Столетиями и тысячелетиями накапливающийся опыт соответствующим образом обобщался и передавался последующим поколениям. Механизм наследования и накопления сведений постепенно совершенствовался за счёт установления определённых обычаев, традиций, а затем — и письменности. Так возникла исторически первая форма науки — наука античного мира, предмет изучения которой составила вся природа в целом.

В этот период возникли первые основы химии, которая использовалась для извлечения металлов из руд, крашения тканей, выделки кожи. Потребности отсчета времени, ориентирования на Земле, предсказания сезонных явлений привели к созданию основ астрономии. Несколько раньше возникли основы математики, включающей в себя в то время элементы арифметики и геометрии.

Первоначально созданная (античная) наука ещё не делилась на отдельные обособленные области и имела черты натурфилософии. Природа рассматривалась в целостности, с выдвижением на первый план общего и пренебрежением частностями. Натурфилософии соответствовал метод наивной диалектики и стихийного материализма, когда гениальные догадки переплетались с фантастическими вымыслами об окружающем мире.

В V-IV вв. до н.э. из натурфилософской системы античной науки в самостоятельные области познания выделяются математика, астрономия, зоология и ботаника, минералогия, география, начался процесс дифференциации науки и внедрения самостоятельных по своему предмету и методам отдельных дисциплин.

Со второй половины XV в. в эпоху возрождения начинается период значительного развития науки, начало которой характеризуется накоплением большого фактического материала о природе.

Переход от науки философии к первому периоду в развитии естествознания происходил достаточно долго — почти тысячу лет, что было связано с отсутствием в то время движущих сил развития науки, а также слабым развитием техники. Второй период в развитии естествознания занимает время от середины XII в. до конца XIX в. Именно в этот период были сделаны выдающиеся открытия в физике, химии, механике, математике, биологии, астрономии, геологии. Были открыты законы: всемирного тяготения (И. Ньютон – конец в.), сохранения массы в химических превращениях (М.В. Ломоносов, А. Лавуазье — вторая половина XVIII в.), периодический закон в химии (Д.И. Менделеев — вторая половина XIX в.). Подлинный переворот в естествознании произошел в результате трех великих открытий — создания Ч. Дарвином эволюционной теории, открытия клетки и закона сохранения и превращения энергии. Такой существенный скачок в развитии науки способствовали дальнейшему прогрессу и дифференциации.

В науке XVII в. господствовал метафизический метод мышления, который опирался на абсолютизацию материалов (результатов), исследование только частностей и рассмотрение отдельных явлений.

В конце XIX в. — начале XX в. революция в естествознании вступила в новую, специфическую стадию, физика переступила порог микромира, был открыт электрон (Д. Томсон, 1897 г.), заложены основы квантовой механики (М. Планк, 1900 г.), обнаружен дискретный характер радиоактивного излучения. В середине XX в. окончательную победу одержал метод научного познания, основанный на материалистической диалектике.

В современных условиях изменяется характер научного исследования,
подход к изучению явлений природы. На место прежней изоляции отдельных
дисциплин приходят их взаимодействие, проникновение одной в другую. К
настоящему времени уже насчитывается около 1300 самостоятельных
научных дисциплин и свыше 300 специальностей, процесс дифференциации науки продолжается. В то же время происходит процесс сближения и связи отдельных наук, который называется интеграцией.

Интеграционные процессы являются одной из характерных черт современного этапа развития науки. Одновременно идущие процессы её дифференциации и интеграции взаимно переплетаются, переходят один в другой. На основе взаимодействия этих процессов происходит становление новых научных дисциплин.

Одной из главных черт развития науки является её сближение с общественной практикой, производством.

На ранних стадиях техника и производство существенно опережали развитие науки. Они давали науке уже готовый материал для анализа обобщения, ставя перед ней задачи, диктуемые практикой.

Сближение науки и техники, их взаимный интерес и влияние одной на другую получило новый импульс в XVI-XVIII вв. в связи с развитием мануфактурного и машинного производства, а также мореплавания. Развитие отдельных дисциплин науки происходит не единым фронтом, а выдвижением в отдельные периоды времени далеко вперед ее отдельных дисциплин. В XVII-XVIII вв. одиночным лидером была механика, в XIX в. — физика, химия, биология, астрономия, в конце XIX в. лидерство вновь перешло к физике (атомной и субатомной), что продолжалось до середины XX в.

Настоящий период развития науки характеризуется групповым лидерст­вом. Кроме физики микромира и твердого тела получили значительное развитие кибернетика, космонавтика, биоорганическая химия, генетика, бионика, в совокупности и взаимосвязи, составляющие основу научно-технического прогресса настоящего времени.

Бурное развитие науки стимулировало зарождение науковедения, изучаю­щего закономерности функционирования и развития науки, структуры и динамику научной деятельности, экономику и организацию науки, нормы взаимодействия её с другими сферами материальной и духовной жизни общества.

Наука — производительная сила современного общества

Основной особенностью современного периода научно-технической рево­люции является конкретное коренное изменение соотношения между наукой и производством. В настоящее время формируется единая, тесно взаимодействующая система «наука — техника — производство», где ведущая роль принадлежит науке. Теперь обязательным условием научного и технического прогресса стало опережающее развитие науки, составляющее сущность научно-технической революция, основу её поступательного развития.

Необходимость в опережающей роли науки обусловлена вовлечением в сферу практической деятельности человека новых веществ с ранее неизвестными свойствами, использованием новых видов энергии, дальнейшем изучении непознанных явлений природы и т.д. Наука изучает законы и закономерности этих явлений, их свойства, разрабатывает рекомендации по их практическому применению. Именно наука играет сейчас ведущую роль в решении глобальных проблем будущего -энергетической, экологической, продовольственной.

Опережающее развитие науки создает прочную основу для прогресса тех­ники, производства на основе научных достижений. Производство все больше выступает как техническое приложение и воплощение достижений в науке.

Следовательно, наука в целом, а не отдельные дисциплины, все в большей степени превращается в непосредственную производительную силу общества.

Однако, превращаясь в производительную силу, наука не становится дополнительным элементом производительных сил. Она своими методами

совершенствует составные части производства: средства труда, предмет труда, сам труд.

Рассмотрим основные пути превращения науки в производительную силу.

Первый путь состоит в создании на основе достижений науки новых тех­нологических средств и технологических процессов, улучшающих процесс производства и повышающих производительность труда. Он являлся единственным вплоть до конца XIX в.

Второй путь превращения науки в производительную силу состоит в совершенствовании самого человека, как главной производительной силы общества. Он стал проявляться ещё в XIX в., но наибольшей значительности достиг в период научно-технической революции.

Теперь в производстве широко применяются станки с ПУ, автоматизиро­ванные линии, устройства электронно-вычислительной техники, для обслуживания которых требуется не только высокая производительность, но и определенная подготовка человека по математике, физике, химии, кибернетике.

Третий путь превращения науки в производительную силу, особенно про­явивший себя в последние 20 лет, состоит в совершенствовании на научной основе производительных процессов, начиная от организации труда на отдельном рабочем месте и кончая общей стратегией развития страны.

2.3. Организация научных исследований в Российской Федерации

Система научных учреждений РФ

Рассматривая такое многогранное явление, как наука, можно выделить три его функции: отрасль культуры, способ познавания мира, специальный институт (в это понятие входят не только высшие учебные заведения, но и научные общества, академии, лаборатории, журналы и т.п.).

В нашей стране создана разветвленная сеть учреждений, занимающихся фундаментальными исследованиями в различных отраслях народного хозяйства. К ним относятся:

1.Академия наук РФ (РАН);

2.отраслевые академии Министерств (Академия медицинских наук РФ, Академия педагогических наук РФ, Академия строительства и архитектуры РФ и др.);

3.отраслевые научно-исследовательские институты Министерств,
ведомств, вузы.

Деление науки на вузовскую, академическую и отраслевую во многом условно в силу тесного взаимодействия этих отрядов единой российской науки.

В вузах, которых по данным за 2002 г. в РФ более 500, научные исследования направлены на разработку фундаментальных проблем в той области, для которой данный вуз готовит специалистов. Важное место занимают также исследования по проблемам высшей школы, совершенствованию учебного процесса, повышению качества подготовки выпускников. При вузах с высоким уровнем научных исследований создаются научно-исследовательские институты, работают проблемные научно-исследовательские лаборатории (например, при МГУ, ЮУрГУ).

Научно—исследовательская работа в высшей школе

Её главная особенность — органическое сочетание учебно-воспитательного процесса и научно-исследовательской деятельности коллектива вуза. В этой работе принимают участие педагогический и научный составы вузов, а также студенты.

Научно-исследовательская работа (НИР) в вузах преследует три основных цели:

1) использование творческого потенциала вузов для решения важных хозяйственных проблем ускорения научно-технического прогресса. Сегодня в вузах страны работают более 300 тыс. преподавателей, в числе которых более 15 тыс. профессоров, докторов наук и свыше 150 тыс. доцентов, кандидатов наук, что составляет около половины научных работников страны;

2) повышение квалификации преподавательского состава;

3) повышение качества подготовки выпускаемых специалистов за счет со-вершенствования организации учебного процесса, активного участия их в научной деятельности.

В вузе научная работа возглавляется проректором по научной работе и регламентируется перспективным и годовым планами исследования.

Различают планы госбюджетных и хоздоговорных НИР. Госбюджетные исследования осуществляются за счет общегосударственных ассигнований на развитие науки; хоздоговорные — выполняются на основе прямых хозяйственных договоров между вузом и заказчиком, который и финансирует исследования.

Для решения актуальных научно-технических задач в передовых вузах создаются отраслевые научно-технические лаборатории, работающие на основе хозяйственных договоров с определенной отраслью народного хозяйства.

Одним из важных направлений вузовской науки являются исследования, направленные на совершенствование учебного процесса.

Участие в исследовательской работе — важнейший фактор повышения квалификации преподавательского состава: во-первых, готовятся кадры высшей квалификации — кандидаты и доктора наук; во-вторых, повышается эрудиция, расширяется кругозор преподавателя; в-третьих, преподаватель может успешно осуществлять творческую подготовку студентов, учить их, как пользоваться приобретенными знаниями.

Особенности организации научно—исследовательской работы студентов

Современная научно-техническая революция представляет собой совокупность коренных, качественных изменений технических средств, технологии, организации и управления производством на основе новых научных принципов. Эта революция подготовлена не только развитием науки и производительных сил, но и теми глубокими социальными изменениями, которые произошли в обществе в результате мирового революционного процесса. Важнейшая особенность НТР заключается в неизмеримо возросшей роли науки в развитии производительных сил, для приведения в действие которых требуется все большее количество квалифицированных работников [10].

В связи с этим возникает объективная необходимость приобретения научных знаний всеми участвующими в общественном производстве. Нельзя себе представить идеал будущего общества без соединения обучения с производительным трудом молодого поколения: ни обучение и образование без производительного труда, ни производительный труд без параллельного обучения и образования не могли бы быть поставлены на ту высоту, которую предполагают современный уровень техники и состояние научного знания.

Носителями научных знаний в общественном производстве являются, в первую очередь, ученые и инженерно-технические работники, которые оказывают непосредственное воздействие на все этапы производственных процессов. Чем больше в стране высокообразованных людей, тем с большим успехом решаются важнейшие научно-технические и производственные проблемы. Поэтому в условиях современной НТР высшее образование приобретает важнейшую роль, от него в значительной мере зависит научно-технический, экономический и военный потенциал государства.

Современный инженер в отличие от инженера начала ХХ в., который, можно сказать, учился своей профессии один раз на всю жизнь, должен непрерывно доучиваться. Поэтому, в какой бы области ни работал специалист, он должен быть динамичным, мобильным, способным непрерывно повышать свою квалификацию, умеющим творчески мыслить и самостоятельно решать принципиально новые задачи, адаптироваться к быстро изменяющимся условиям деятельности. Таким образом, решающее значение для выпускника высшего учебного заведения приобретает не только овладение суммой конкретных знаний и навыков, но как главная цель — умение их самостоятельно добывать, приобретать, систематизировать.

Творческая активность личности, отражая высокий уровень социальной зрелости человека, является результатом воспитания и самовоспитания личности, обучения и воздействия на неё общественных отношений. В свою очередь творчество в широком смысле слова можно определить как естественно-исторический процесс материалистического познания мира.

Естественно, творческая активность может быть присуща людям в любой сфере социальной жизни: везде, выполняя определенные обязанности, можно искать и находить более эффективные способы работы, повышать производительность труда. Но особо важное значение творческая активность имеет в сфере науки, искусства и общественного производства, и именно здесь она имеет ярко выраженный интеллектуальный характер и предполагает наличие и постоянное включение в свою деятельность знаний о новейших достижениях науки, техники, технологии и участие на этой основе в их развитии и совершенствовании.

Особенностью студенческой научной работы является то, что её главной задачей является не решение важнейших научных проблем, а приближение студентов к самостоятельной работе, углубление их знаний, развитие творческого подхода к решению поставленных задач. Чтобы повысить качество подготовки студентов, необходимо научить их не только усваивать имеющийся фактический материал, но и вырабатывать собственные решения.

Развитие творческой активности студента возможно только в процессе коллективной исследовательской деятельности, при выполнении творческой работы, постановки экспериментов, обсуждении результатов исследования и т.д.

Для успешного выполнения студенческой научно-исследовательской работы необходимо соблюдение следующих основных условий:

1.Активное участие студентов в научной работе на протяжении всего времени обучения.

2.Последовательное увеличение сложности решаемых задач с постепенной ориентацией студента в направлении профиля его специализации.

3.Обеспечение преемственности при выполнении научной работы каждым студентом.

4.Обеспечение преемственности в научной работе студентов старших и младших курсов,

5.Тесная связь научной работы студентов с научной и учебной работой кафедры.

6.Научная работа студентов является составной частью учебного плана вуза и организуется на основе «Положения о научной работе студентов».

Главную роль в организации научно-исследовательской работы студентов играет профилирующая кафедра. Она разрабатывает формы научно-исследо­вательской деятельности студентов, определяет основные направления, в которых формируется тематика. Эти направления должны отражать специфику будущей специальности и быть тесно связанными с научными направлениями кафедр. Научная работа студентов имеет две основные формы. Первая из них выполняется в научных кружках, студенческих конструкторских бюро, в хоздоговорных лабораториях и т.п. Эта работа не только развивает навыки самостоятельности, но и способствует развитию повышенных способностей, формированию будущих научных работников. Вторая форма — учебно-исследовательская работа студентов — обязательна для всех студентов, она предусмотрена учебными планами.

Привлечение студентов младших курсов к выполнению конструкторских и исследовательских работ совместно со старшекурсниками обеспечивает преемственность научных исследований, расширяет кругозор молодых исследователей. Очень полезной является помощь студентов младших курсов старшекурсникам, выполняющим курсовое или дипломное проектирование, благодаря которой они узнают характер своих будущих работ, накапливают опыт работы, получают ясное представление о специфике исследования от его начала до завершения. Одновременно совершенствуются научно-методические навыки студентов старших курсов, выступающих в качестве «микроруководителей». Начиная научно-исследовательскую работу на младших курсах, создаются благоприятные условия для перерастания отдельных тем в курсовые и дипломные проекты.

Руководство научной работой студентов — одна из обязанностей профес­сорско-преподавательского состава вуза. Качество руководства, его уровень определяют успех выполнения работы. Опыт показывает, что один преподаватель может успешно руководить работой четырех-пяти студентов.

Подведение итогов научно-исследовательской работы студентов является одной из форм её контроля. Эти итоги подводятся на научных семинарах ка­федры, научно-технических конференциях факультета, вуза. Лучшие работы публикуются в научной печати, докладываются на областных и республиканских конференциях, выдвигаются на конкурсы студенческих работ.

Система подготовки научных и научно—педагогических кадров в РФ

В связи с бурным развитием науки потребность в высококвалифици­рованных научных кадрах непрерывно возрастает.

Подготовка кадров высшей квалификации — одна из главных организаторских задач науки. Опыт показывает, что этот фактор в значительной мере определяет уровень развития науки и производства в стране, степень её технического прогресса.

Основной и хорошо зарекомендовавшей себя формой подготовки научных и научно-педагогических кадров в нашей стране является аспирантура. В неё отбираются наиболее способные и подготовленные специалисты, как правило, после определенного времени их производственной деятельности (не менее двух лет).

Наряду с традиционной формой подготовки научных и педагогических кадров через аспирантуру широко распространена подготовка этих кадров из числа соискателей ученой степени. Соискатели прикрепляются к научно-исследовательским институтам или вузам для сдачи кандидатских экзаменов, а также подготовки диссертации под руководством научного руководителя без отрыва от производства.

Подготовка докторов наук осуществляется из числа наиболее активно ведущих научную деятельность кандидатов наук, работающих в вузах, научно-исследовательских институтах и на производстве. Докторская диссертация представляет собой существенный шаг в науке, связанный с разработкой новых научных направлений и решением крупных научных проблем, имеющих важное хозяйственное значение. Одной из форм подготовки докторов наук является докторантура, которая заключается в освобождении кандидатов наук в возрасте до 40 лет от их основной производственной деятельности сроком на 3 года для завершения работы над диссертацией и внедрения её результатов в производство.

Защита кандидатских и докторских диссертаций осуществляется в специализированных диссертационных Советах в вузах и научно-исследовательских институтах. Для оценки качества диссертаций и их соответствия предъявляемым требованиям учёным советом назначаются официальные оппоненты из числа ведущих учёных в данной области и ведущее предприятие, которые представляют официальные заключения по диссертации. Контролирует все диссертационные работы Высшая аттестационная комиссия, в которую входят ведущие учёные страны. Учёные звания доцента и профессора работникам вузов и научно-исследовательских институтов в настоящее время присваиваются Министерством образования РФ.

Библиографический список

1. Бернал, Дж. Наука в истории общества / Дж. Бернал. — М.: Мир, 1958.

2. Вернадский, В.И. Труды по общей истории науки / В.И.Вернадский. -М.: Прогресс, 1988.

3. Данилов, В.С. Новая технократическая волна на Западе / В.С. Данилов. -М.: Мир, 1986.

4. Добров, Г.М. Наука о науке / Г.М. Добров. — Киев: Наук. думка, 1989.

5. Ильин, В.В. Природа науки / В.В. Ильин, А.Т. Калинкин. — М.: Прогресс, 1985.

6. Йорданов, И. Наука как логическая и общественная система / И. Йорданов. — Киев: Наук. думка, 1979.

7. Козлов, А.В. Основы научных исследований: Учебное пособие / А.В. Козлов, Б.А. Решетников, С.В. Сергеев. — Челябинск: Изд. ЧГТУ, 1997.

8. Кочергин, А.М. Методы и формы научного познания / А.М. Кочергин. — М.: Наука, 1990.

9. Кукк, В.А. К вопросу о принципах разграничения сфер общественной деятельности: Тем. сб. науч. тр. / В.А. Кукк.— Челябинск: ЧГТУ, 1996

10. Кун, Т. Структура научных революций / Т. Кун. — М.: Мир, 1977.

11. Лакатос, И. Методология научно-исследовательских программ // Вопросы философии / И. Лакатос. — 1995. — № 4.

12. Петров, Ю.А. Логика и методология научного познания / Ю.А. Петров, А.Л. Никифоров. — М.: Мысль, 1982.

13. Петров, Ю.A. Теория познания / Ю.A. Петров. — М.: Наука, 1988.

14. Печенкин, А.А. Закономерности развития науки / А.А. Печенкин// Вестник МГУ. Философия. — 1995. — № 3.

15. Сноу, Ч. Две культуры / Ч. Сноу. — М.: Мир, 1973.

16. Филатов, В.П. Образы науки в русской культуре / В.П. Филатов// Вопросы философии. -1990. — № 5.

17. Ясперс, К. Смысл и назначение истории / К. Ясперс. — М.: Мир, 1994.