Автор: admin

Сорбенты, используемые для хроматографии, делят на несколько групп, каждая из которых, в свою очередь, подразделяется на типы. Классификация сорбентов может основываться на ряде признаков. Общепринятым является разделение сорбентов на группы по химической природе матрицы (основы) сорбента, а по типам – по методу химической обработки матрицы, делающей ее пригодной для использования в определенном виде хроматографии.

Основными группами сорбентов являются: 1) поверхностно-пористые сорбенты, представляющие собой непроницаемое для растворителя твердое ядро из стекла, на поверхность которого занесен тонкий слой пористого абсорбента, обычно силикагеля; 2) пористые сорбенты на основе силикагеля; 3) пористые сорбенты на основе оксида алюминия; 4) пористые сорбенты на полимерной основе.

Сорбенты первой группы были исторически первыми, стимулировавшими быстрый рост ВЭЖХ. Они представляют собой стеклянные микрошарики размером 35–50 мкм, на поверхности которых различными способами закрепляется слой силикагеля или оксида алюминия толщиной в 1–2 мкм. Этот слой кет либо использоваться для разделения методом адсорбционной хроматографии, либо модифицироваться нанесением подвижной фазы. Нанесение фазы возможно динамическим методом из растворителя, методом испарения раствора фазы, как в ГХ; наноситься могут индивидуальные вещества или же полимеры; наконец, фазами могут служить химически привитые пленки как в виде монослоев (щеточные сорбенты), так и в виде полимерных пленок разной толщины.

Создание этих сорбентов, называвшихся также пелликулярными, позволило заполнять сухим способом достаточно длинные эффективные колонки и проводить разделения разного типа достаточно быстро. Обычно эффективность составляла для колонок длиной 1–2 м 2–4 тыс. т.т. при продолжительности анализа 20–80 мин. Недостатки физически нанесенных фаз стимулировали быстрое развитие методов химической прививки фаз, далее широко использовавшихся для других групп сорбентов.

Наряду с достоинствами поверхностно-пористых сорбентов (возможность упаковки в колонки сухим способом, легкость фракционирования, широкий ассортимент привитых и нанесенных фаз) обнаружились их серьезные недостатки. Главными следует считать малую емкость по пробе, связанную с малой поверхностью сорбента в колонке (основной объем сорбента занимает непористое ядро, не участвующее в разделении), большое гидравлическое сопротивление длинных колонок, их малую производительность и быструю перегрузку в препаративной работе, сложную технологию получения сорбентов и их высокую цену, недостаточную эффективность колонок и длительность анализа.

В настоящее время поверхностно-пористые сорбенты практически не используют для аналитической работы. Единственная область применения, которая для них сейчас осталась, – это использование в предколонках. Предколонки устанавливают перед аналитической колонкой для улавливания необратимо сорбируемых загрязнений из проб, особенно в медицине и биологии. Однако несмотря на легкость перезаполнения сухим способом таких предколонок, их малая емкость по примесям по сравнению с пористыми микрочастицами и, следовательно, необходимость частого перезаполнения с большой затратой времени и сорбента позволяют усомниться в целесообразности их использования и в этой области.

Дальнейшее быстрое развитие ВЭЖХ базировалось на новом поколении сорбентов: микрочастицах диаметром от 3 до 10 мкм, главным образом на основе силикагеля, частично – оксида алюминия, а в последнее время на основе пористых полимеров.

Силикагель, его структура и химия поверхности

Силикагель представляет собой почти чистый диоксид кремния SiO2, однако технические его сорта содержат примеси. Силикагель всегда содержит большие, или меньшие количества адсорбированной воды (на этом основано его широкое использование в качестве осушителя). Кроме того, технический силикагель содержит другие оксиды, прежде всего оксид алюминия, также железа, который придает техническому силикагелю желтоватый или даже коричневый цвет. Силикагель имеет разную поверхность, составляющую обычно 100–600 м2/ г, и значительный объем пор (0,5–1,2 мл/г) с преобладанием пор диаметром от 5 до 15 нм.

Силикагель получают разными способами, позволяющими варьировать его чистоту и другие свойства. Наиболее общим является метод получения силикагеля из так называемого жидкого стекла, представляющего собой натриевую соль поликремневой кислоты, путем его обработки кислотами с последующим высушиванием образующейся поликремневой кислоты, разлом получающегося кускового силикагеля и выделением жной фракции рассеиванием. Такой метод был исторически первым, использовавшимся для получения силикагеля, применяемого в колоночной (классической) и тонкослойной хроматографии. На базе такого же силикагеля были получены первые сорбенты специально для ВЭЖХ типа партисил (фирма «Ватман») и лихросорб (фирма «Мерк»). Получали их путем сепарирования на специально разработанных воздушных сепараторах силикагеля для ТСХ.

В дальнейшем были разработаны способы получения силикагелей специально для ВЭЖХ путем направленного формования в процессе синтеза силикагеля микросфер нужной фракции с преобладанием частиц размером 3–12 мкм (фирмы Дюпон», «Мерк», «Мэчери-Нэгель», «Фейз Сепарейшн», «Сепарейшенс Груп», «Шендон Саусерн» и др.) под торговыми марками соответственно зорбакс, лихросфер, нуклеосил, сферисорб, видак, хайперсил. Регулированием процессов формования микросферического силикагеля и его отверждения, сушки последующей химической обработки получается широкая гамма сорбентов для ВЭЖХ зернением 3, 5, 7 и 10 мкм с узким фракционным составом. Если процесс формования не позволяет получить сразу узкую фракцию микросфер, их подвергают воздушному сепарированию, так же как и размолотый кусковой силикагель.

В настоящее время разные фирмы производят более 200 сорбенгов для ВЭЖХ на основе силикагеля как с неправильной формой частиц, так и в виде микросфер. Ассортимент их непрерывно расширяется за счет появления новых привитых фаз к известным силикагелям для ВЭЖХ или же новых вариантов прививки тех же фаз, появления новых силикагелевых матриц с более широкими порами или более узко сепарированных, появления новых фирм-производителей.

Вопрос о том, являются ли частицы сферической формы предпочтительными по сравнению с частицами неправильной формы и обеспечивают ли они получение каких-либо особых преимуществ, обсуждался многими авторами, однако никаких убедительных доказательств большей эффективности, стабильности, проницаемости более дорогих микросферических сорбентов представлено не было. Тем не менее следует отметить, что большая часть вновь появляющихся сорбентов имеет форму микросфер.

Химия поверхности силикагеля для ВЭЖХ независимо от способа его получения примерно одна и та же. Поверхностный слой силикагеля, который в дальнейшем работает как адсорбент или же служит той матрицей, к которой прививают химически неподвижную фазу, можно представить себе следующим образом (рис. 4.1). На поверхности силикагеля, таким образом, можно обнаружить несколько видов групп, способных к взаимодействию с веществами в процессе последующего хроматографического анализа или в процессе прививки неподвижной фазы. Прежде всего, это может быть силанольная группа со свободным гидроксилом (тип I). Во-вторых, это может быть силанольная группа, свободный гидроксил которой образует с соседним атомом кислорода за счет его неподеленной пары электронов водородную связь (тип II), при этом образуется устойчивый шестичленный цикл. В-третьих, это может быть силоксановый мостик, который образуется за счет отщепления молекулы воды от двух силанольных групп (тип III). Последний тип связи может за счет обратимой реакции гидролиза превратиться в две силанольные группы (тип I).

Количество групп как силанольных, так и силоксановых на единицу массы силикагеля зависит от ряда факторов. Так, чем больше удельная поверхность силикагеля (она меняется в пределах от 1000 до 15 м2/г), тем больше групп обоих типов находится на сорбенте в колонке и, следовательно, сильнее удерживание взаимодействующих с ними веществ. Далее, в процессе получения силикагеля он подвергается сушке, от длительности и условий которой зависит соотношение силоксановых и силанольных групп. При сушке геля поликремневой кислоты – исходного продукта для силикагеля – сначала идет поликонденсация с выделением воды и образованием жесткого скелета силикагеля. При нагревании до 200 °С вся физически сорбированная вода удаляется, а поверхность остается полностью гидроксилированной, т.е. количество силанольных групп будет максимальным, а силоксановых – минимальным. Если продолжить нагревание, силанольные группы начнут отщеплять воду с образованием силоксановых групп; этот процесс заканчивается примерно при 1000 °С. Дальнейшее нагревание приводит к спеканию частиц силикагеля с уменьшением как объема пор, так и размера частиц, а затем и к плавлению с образованием кварца.

Силанольные группы, располагающиеся на поверхности силикагеля, обладают слабокислыми свойствами и способны поэтому сильнее удерживать вещества с основными свойствами. Силоксановые группы могут в процессе работы за счет гидролиза переходить в силанольные, что меняет свойства поверхности сорбента и удерживание веществ.

Оксид алюминия

Оксид алюминия, применяемый в качестве сорбента как в газовой, так и в жидкостной хроматографии, получают путем дегидратации при высушивании гидроксида алюминия (III). Зависимости от условий дегидратации получают ряд форм – модификаций кристаллической формы оксида алюминия, из которых для хроматографии используют гамма-оксид алюминия.

Применяемый для хроматографии оксид алюминия отвечает формула, в которой на две молекулы оксида приходится молекула воды. Его поверхность и структура похожи на силикагелeвые, однако не идентичны и обеспечивают в ряде случаев селективность, отличающуюся от селективности силикагеля. Поверхностные гидроксилы оксида алюминия более прочны и полностью удаляются даже при 1000 °С. Обратная гидратация поверхности при комнатной температуре протекает медленно. Ионы алюминия в отличие от ионов кремния способны взаимодействию с многими молекулами разделяемых веществ влоть до необратимой сорбции некоторых молекул) и дают ой вклад в удерживание.

Хотя оксид алюминия широко и давно используют в колонной и тонкослойной хроматографии, его применение в ВЭЖХ имеет ограниченный характер. Это связано с тем, что микрочастицы оксида алюминия выпускают не все фирмы-производители сорбентов, а привитые фазы на этой основе не выпускаются совсем. Тем не менее в некоторых случаях, когда требуется селективность, отличная от селективности силикагеля, оксид алюминия применяют. Его также используют и в тех случаях, когда нужно перейти к ВЭЖХ от методики ТСХ, размотанной на пластинках с оксидом алюминия.

Привитые сорбенты на основе силикагеля для нормально-фазной и обращенно-фазной хроматографии

Сорбенты с химически привитыми фазами на основе силикагеля появились позже сорбентов, на которые неподвижная фаза (в виде индивидуальных веществ или, чаще, полимеров различной структуры и полярности) наносилась физически, т.е. аналогично тому, как фазу наносили и продолжают наносить в газожидкостной хроматографии. Нанесенная фаза довольно быстро смывается растворителем (гораздо быстрее, чем она испаряется или изменяется в газожидкостной хроматографии), параметры удерживания постоянно меняются, препаративно собираемые фракции загрязняются фазой. Использование растворителя, насыщенного неподвижной фазой, позволило несколько повысить стабильность таких сорбентов и колонок, однако большинство недостатков при этом осталось.

Эти проблемы можно решить, если химически привить органическую неподвижную фазу к силикагелевой матрице. Силанольные группы, находящиеся в большом количестве на поверхности силикагеля (особенно полностью гидроксилированного), обладают слабокислыми свойствами и довольно легко вступают в многочисленные реакции. Первые из полученных таким путем привитофазных сорбентов, названных «щеточные» (привитые молекулы, как щетина в щетке, покрывали поверхность силикагеля), изготовляли этерификацией силанолов спиртами с образованием простой эфирной связи. Однако обратимость реакции, особенно в кислой и щелочной средах и в присутствии водных подвижных фаз, в большой мере ограничивала как срок работы таких сорбентов, так и области их применения.

Позднее были разработаны методы получения привитых фаз разного типа с использованием гораздо более прочных и устойчивых к гидролизу связей Si-О–Si и Sj-С. Практически все имеющиеся в продаже привитофазные сорбенты относятся к этому типу, их более 200. Привить химически фазу к силикагелю может любой высококвалифицированный химик-органик по имеющимся прописям. Однако приготовить сорбент, воспроизводимый от партии к партии, чрезвычайно трудно, это не всегда удается даже обладающим как патентами, так и «ноу-хау» лабораториям и производствам фирм-изготовителей. Еще более проблематичной является попытка воспроизвести в лаборатории какой-то фирменный сорбент по имеющимся литературным и патентным данным; множество нюансов в подготовке исходного силикагеля, растворителей и реагентов, проведении реакции, удалении непрореагировавших реагентов и побочных продуктов сводят шансы на удачу почти к нулю. Точно так же проблематичным является использование при воспроизведении описанных в литературе разделений «аналогов» сорбентов других форм, что в первую очередь относится к сложным разделениям и использованию обращенно-фазных сорбентов. Сказать «использовался обращенно-фазный сорбент, представляющий собой октадецилсилан, привитый к силикагелю», – значит не сказать почти ничего, если не указана фирма-производитель. Многочисленные описанные в литературе случаи инверсии порядка выхода пиков смесей на разных сорбентах «С18 на силикагеле» и других или даже полной адсорбции ряда веществ на другом сорбенте подтверждают этот факт.

Тем не менее привито-фазные сорбенты сейчас наиболее популярны, несмотря на их высокую стоимость и отмеченные недостатки. Более 60% разделений методом ВЭЖХ (по другим данным-более 70%) выполняют с использованием только обращенно-фазных привитых сорбентов, основным из которых является сорбент с привитой фазой C18.

Можно отметить следующие преимущества, обеспечивающие преобладающее использование привитых сорбентов на основе силикагеля: механическая устойчивость к высоким давлениям; отсутствие перехода привитой фазы в растворитель в процессе хроматографического разделения (если не протекают реакции, приводящие к химическому отщеплению привитой фазы); устойчивость к действию растворителей, температуры, воды, рН; быстрота установления равновесия при смене элюента, что обеспечивает оперативность работы и возможность работы в градиентном режиме с быстрым возвратом к исходному режиму; возможность варьировать в широких пределах селективность за счет изменения степени прививки, дополнительной химической обработки и замены растворителя.

Так как среди начинающих работать в области ВЭЖХ очень большой процент составляют специалисты по ГХ, имеет смысл сделать следующее замечание. Очень большой ассортимент неподвижных фаз (неоправданно большой, по мнению многих компетентных ученых) в ГХ и стремление иметь как можно более широкий выбор фаз и в ВЭЖХ–основная ошибка начинающих. Если в газовой хроматографии, по крайней мере в ее классическом варианте, подвижная фаза практически не оказывает влияния на селективность разделения, то в жидкостной хроматографии ее влияние огромно. Так как в разделении очень активно участвуют как привитая фаза, так и адсорбированные (абсорбированные) компоненты подвижной фазы, широкий ассортимент сорбентов для ВЭЖХ в большинстве случаев не нужен. Изменением состава подвижной фазы очень часто легко добиться той же селективности, что и за счет применения нового дорогостоящего привито-фазного сорбента. Приведенное выше утверждение не относится, конечно, к принципиально новым вариантам сорбентов для ВЭЖХ (например, особо широкопористым, предназначенным для работы с большими молекулами, такими, как белки). Для начинающего же работать в ВЭЖХ рекомендуется тщательно изучить 2–4 сорбента, находящие применение для его объектов исследования, и широкий ассортимент растворителей и добавок разного типа, их влияние на разделение данного класса веществ на выбранной группе сорбентов. Только после того, как приобретен опыт работы с привитыми фазами в комплексе с растворителями, но есть задачи, которые не удается решить с их помощью, следует пробовать новые привитые фазы. Справедливость данного замечания как раз и подтверждается тем, что 60–70% успешных разделений, описанных в литературе, проведено только на привитых фазах одного типа – обращенно-фазных, к рассмотрению которых мы сейчас и перейдем.

Наиболее популярными являются так называемые обращенные привитые фазы, применяемые в обращенно-фазной ВЭЖХ. Понятие «обращенный» пришло от классической ЖХ на силикагеле, где в «прямой» системе подвижная фаза неполярна. а неподвижная полярна (соответственно гексан и силикагель). По этому принципу «обращенная» система должна иметь полярную подвижную фазу и неполярную неподвижную (соответственно водный метанол и октадецилсилан на силикагеле, привитый химически). Названия обращенно-фазный сорбент и обращенно-фазная система не являются особенно удачными или понятными, однако так как это название общепринято, то мы будем его придерживаться.

Поверхность силикагеля, как известно, – довольно большая и развитая (обычно 100–600 м2/г), и в случае гидроксилированного силикагеля покрыта в основном силанольными группами, имеющими концентрацию около 5 на 1 нм2 поверхности. Расчетная максимальная плотность силанольных групп на поверхности несколько выше и составляет около 8 на 1 нм2. Полное гидроксилирование поверхности силикагеля достигается путем его обработки водой при кипении в течение нескольких часов.

Для получения обращенно-фазного сорбента гидроксилированный силикагель обычно обрабатывают хлорсиланами, которые вступают в реакцию довольно активно и образуют при этом устойчивые к гидролизу связи – Si-О–Si-С– Несмотдя на кажущуюся простоту процесса, оказалось, что имеются многочисленные сложности. Первоначально считали, что все силанольные группы вступят в реакцию с образованием мономолекулярного слоя привитой фазы. На практике оказалось, что не все силанольные группы, а только 1,5–2,2 на 1 нм2 вступят в реакцию с алкилхлорсиланами, а остальные не могут реагировать вследствие стерических препятствий и остаются на поверхности сорбента. Правда, привитые группы стерически затрудняют подход к ним молекул анализируемых веществ в процессе разделения.

Первоначально использовали для прививки промышленно доступные три- и дихлорсиланы (октадецилтрихлорсилан и др.), которые, будучи ди- и трифунк-циональными, способны вступать друг с другом в реакцию полимеризации до того, как вступят в реакцию с силанольными группами. Эта полимеризация приводит к тому, что на поверхности могут образоваться значительно более толстые, чем мономолекулярные, полимерные слои фазы (более или менее сильно привитые к поверхности силикагелевой матрицы). В этом случае содержание привитого углерода, определяемое сжиганием, окажется выше, чем теоретически должно привиться по схеме монослойного покрытия поверхности силикагеля. При этом, несмотря на сильное удерживание пробы из-за высокого содержания привитой фазы, эффективность разделения за счет затрудненной диффузии в толстых полимерных пленках может заметно упасть. В то же время большие участки поверхности силикагеля окажутся не покрытыми фазой, что приведет к сильному взаимодействию анализируемых веществ с неэкранированными силанольными группами.

Старые, давно разработанные обращенно-фазные сорбенты, как правило, получали обработкой силикагеля октадецил- или октилтрихлорсиланами. При этом покрытие поверхности было неполным, а привитые слои в той или иной степени (в зависимости от содержания воды в растворителе, степени безводности силикагеля, герметичности аппаратуры, технологии и т.д.) были полимеризованы.

Работа по улучшению качества привитого слоя велась разными учеными постоянно и в разных направлениях. С целью устранения полимеризации прививаемого агента было предложено использовать монохлорсиланы (например, диметилокта-децилхлорсилан, диметилоктилхлорсилан и др.), которые по природе своей монофункциональны и могут дать только мономерный привитой слой. Вода дезактивирует монохлорсиланы, вступая с ними в реакцию, однако в реакцию прививки они уже не вступают и после окончания реакции отмываются вместе непрореагировавшим исходным алкилдиметилхлорсиланом. С целью устранения влияния остаточных силанольных групп было предложено после проведения прививки вести так называемое «окончательное замещение», или «энд кэппинг». В этом случае после прививки основной фазы сорбент обрабатывают сильными реагентами с минимальным мольным объемом (на пример, триметилхлорсиланом), которые блокируют основную массу непрореагировавших силанольных групп. С целью получения сорбентов с более воспроизводимыми хроматографическими свойствами значительно больше внимания стало удеяться качеству растворителей и прививаемых силанов, подготовке (гидроксилированию) исходного силикагеля.

По мере разработки усовершенствованных методов прививки обращенных фаз практически все фирмы имели возможность использовать их для производства нового поколения сорбентов. Тем не менее не было прекращено производство старых сорбентов. В чем причина этого? Причин несколько, но основными являются две: наличие – налаженного производства сорбентов по старой технологии и нежелание его прекращать или перестраивать; разработанные методы анализа разных смесей и требования потребителей, не желающих менять свои методики анализа. Более консервативные фирмы, имеющие хороший сбыт старых обращенно-фазных сорбентов, продолжают их выпускать, а более прогрессивные наряду с выпуском старых организуют выпуск новых модификаций сорбентов, вводя для них отличительные знаки или цифры. Так, фирма «Ватман» имеет четыре варианта сорбента «октадецилсилан на силикагеле», при этом силикагелевая матрица одна и та же, фирма «Уотерс» – не менее трех, различающихся методом прививки и силикагелевыми матрицами (два сферической формы и один – неправильной), фирма «Фэйс Сепарейшн» – два варианта на одной силикагелевой матрице и т.д.

Ознакомившись с этими данными, начинающий и даже более опытный специалист по ВЭЖХ обычно задает вопрос: какой же обращенно-фазный сорбент следует считать наилучшим и приближающимся к идеальному? Ответить на такой вопрос конкретным названием сорбента, к сожалению, невозможно по многим причинам. Основной из них является то, что наилучшим, с точки зрения хроматографии, является тот сорбент, который обеспечивает для данной смеси наилучшее разделение в кратчайший срок. Зачастую сниженная химическая однородность поверхности старых сорбентов в результате комбинированного (распределительного и адсорбционного, иногда в сочетании с ионообменным) механизма удерживания обеспечивает такое разделение, а сорбент с химически более однородной поверхностью не обеспечивает.

Однако, если поставить вопрос в другой форме, а именно: какой сорбент теоретически является идеальным для обращенно-фазной хроматографии и каким требованиям должен отвечать соответствующий реальный сорбент – ответить можно более конкретно. Идеальным для обращенно-фазной хроматографии следует считать сорбент, обеспечивающий «чисто обращенно-фазное» взаимодействие растворенного вещества с его поверхностью, т.е. при полном отсутствии влияния адсорбции, взаимодействия с полярны. ми группами, ионообменных и эксклюзионных процессов. Исходя из этого, приближающийся к идеальному реальный сорбент должен иметь максимально полное покрытие поверхности мономолекулярным слоем привитой фазы, в нем должны отсутствовать доступные для взаимодействия с анализируемыми веществами силанольные и другие полярные группы или группы с ионообменными свойствами, он должен иметь минимальное количество таких групп, которые экранированы и недоступны для подобных взаимодействий (теоретически), и иметь поры, практически исключающие вклад в удерживание анализируемых веществ эксклюзионных процессов. Такой сорбент должен, по имеющимся представлениям, иметь поры размером 10–30 нм (для анализа веществ с молекулярной массой до 800–1000). Перед прививкой поверхность сорбента должна быть полностью гидроксилирована, однако сорбент не должен содержать адсорбированной воды. Прививку следует проводить с использованием монохлорсиланов, например октадецилдиметилхлорсилана, в условиях, обеспечивающих наиболее полное протекание реакции с силанольными группами. После окончания прививки проводят «энд кеппинг», т.е. обработку триметилхлорсиланом для окончательного устранения доступных силанольных групп на поверхности сорбента. Наконец, сорбент должен быть полностью отмыт после окончания реакции от всех остатков использовавшихся рактивов и побочных продуктов реакции.

Каждому хроматографисту приходится решать, какой же из доступных для него обращенно-фазных сорбентов является наиболее приближающимся к идеальному. При этом ему приводится пользоваться данными фирмы о размере пор (среднем) У их кривой распределения, об объеме пор, поверхности сорбента, прививаемом агенте, наличии или отсутствии дополнительной обработки («энд кэппинга»). Эти данные, как правило, неполные и не содержат многих важных сведений, касающихся технологии и в большой мере определяющих качество сорбента. кроме того, многие данные носят рекламный характер.

Силикагель, используемый как матрица для последующей прививки неподвижной фазы, играет важнейшую роль в определении конечных свойств получаемого сорбента. Он имеет пространственно-пористую структуру, образованную диоксидом кремния в процессе образования золя, геля и последующей его сушки с удалением физически сорбированной воды. В зависимости от условий формования силикагеля могут быть получены образцы со средними размерами пор от 3 до 10 нм. За счет последующей гидротермальной обработки силикагеля может быть достигнуто значительное увеличение размера пор (до 20–50 нм и более) при сохранении в основном объема пор. Методами формования микросферических сорбентов для ВЭЖХ из тетраэтоксисилана за счет варьирования условий формования и отверждения, выбора растворителей и т.п. удается добиться получения силикагеля с достаточно высокой пористостью (свободный объем пор 0,7–1,2 мл/л) и порами от 5 до 400 нм и более.

Какую же силикагелевую матрицу использовать для прививки неподвижной фазы? Следует учитывать ряд важных обстоятельств. Если использовать матрицу с порами 3–5 нм, размер таких пор соизмерим с длиной цепи октадецилсилана (около 1 нм). Если предположить плотную прививку к такому сорбенту октадецилсилановых групп, становится очевидным, что узкие поры уменьшатся в диаметре очень значительно (некоторые даже вообще закроются) и станут недоступными для попадания в них крупных анализируемых молекул. Это может внести существенный вклад в изменение удерживания и порядка выхода компонентов. Если первоначально для прививки использовали силикагели с размерами пор 5–6 нм, то в последующем перешли к порам около 10 нм, а сейчас считают более целесообразным даже 15–30 нм. Это связано со все возрастающим использованием привитых сорбентов для анализа р больших по молекулярной массе биополимеров, таких, как белки, полипептиды и др.

Кроме размера пор, большую роль играет объем пор силикагеля и его поверхность. Если рост поверхности дает увеличение количества силанольных групп (их плотность около 5 на 1 нм2) и количества привитой фазы при равной плотности прививки, то рост объема пор играет сложную роль. При увеличении объема пор не только увеличивается проницаемость силикагеля, но и уменьшается объем самого диоксида кремния и соответственно прочность силикагеля; он легче разрушается в процессе транспортировки, при набивке колонок, повышении давления при эксплуатации колонок. Правда, прочность определяется не только толщиной стенок ячеек силикагеля, но и их структурой.

Относительно распределения пор силикагеля по размеру можно сказать, что есть образцы как с более узким, так и с более широким распределением. Кажется желательным иметь более узкий диапазон распределения пор по размерам, так как в этом случае однородность пор приводит к большей однородности прививки, ситовых эффектов и др.

Для качественной прививки фазы к силикагелю важна подготовка его поверхности перед прививкой. Поверхность должна быть полностью гидроксилирована и не содержать сорбированной воды. Если гидроксилирование поверхности проведено не полностью (например, силикагель пересушен выше 180–200 °С) это приводит к тому, что образовавшиеся силоксановые группы не вступают в реакцию прививки, и количество привитой фазы уменьшается. С другой стороны, при последующем использовании такого сорбента его свойства в процессе эксплуатации в водных средах будут меняться, так как возможен гидролиз силоксановых групп с образованием новых активных силанольных групп.

Гидроксилирование проводят кипячением силикагеля в воде в присутствии кислот в течение нескольких часов и затем сушат при температуре до 150 °С. Сушка должна обеспечить удаление физически сорбированной воды, так как она приводит к бесполезному расходу прививаемого хлорсилана, загрязнению сорбента побочными продуктами реакции и изменению выбранного мольного соотношения хлорсилана и силанольных групп.

Следует ли предпочесть сферические частицы матрицы частицам неправильной формы? Однозначного ответа нет. Но большинство исследователей предпочитают частицы правильной сферической формы, которые должны давать более плотно и равномерно упакованный слой сорбента, снижать сопротивление потоку, меньше разрушаться в процессе набивки и работы колонок и т.п. Пока никто еще убедительно не продемонстрировал заметных преимуществ сферических частиц; однако следует отметить, что большинство вновь появляющихся сорбентов являются сферическими микрочастицами.

Остановимся теперь на выборе прививаемого агента. Если вначале были испробованы многие классы прививаемых агентов, то в настоящее время практически остался один тип – хлop- или алкоксипроизводные алкилсиланов, дающие в провесе прививки довольно стойкую к гидролизу или расщепленную связь Si-О–Si-С. Метод прививки с образованием еще более прочной связи Si-С, заключающийся в замене в силанольных группах силикагеля гидроксильной группы на галоген (хлорирование силикагеля) и последующем взаимодействии галогена, например с бензиллитием используется только в исследовательской работе и мало пригоден для промышленного роизводства из-за взрывоопасности и нетехнологичности.

Алкилхлорсиланы, наиболее дешевые и доступные из прививаемых агентов, могут быть трех типов: алкилтрихлорсиланы, диалкилдихлорсиланы и триалкилхлорсиланы (вместо алкила может быть и арил). Из этих трех наиболее дешевый и доступный продукт – алкилтрихлорсиланы, которые и использовались практически во всех ранних работах и в производстве первых привито-фаэных сорбентов, появившихся на рынке. Однако для получения мономерного привитого слоя с применением этИХ силанов, имеющих три реакционноспособные группы, требуется очень высокий технический уровень работы, который относительно легко достигается в лаборатории, но трудно достижим на производстве. Если трихлорсиланы вступают в кон-акт с любым содержащим следы воды веществом (недосушенным силикагелем, воздухом, растворителем и др.), они немедленно отнимают воду, вступая в реакции.

Образующиеся при этом димеры, тримеры и продукты с еще большей степенью полимеризации реагируют с силанольнымв группами силикагеля, давая вместо мономерного привитой полимерный слой фазы. Этот полимерный слой, естественно, является неравномерным и большим по толщине, чем мономерный. Диффузия анализируемых молекул в таких более толстых пленках замедлена, и как правило, эффективность колонок с такими сорбентами более низкая. Другим недостатком является то, что те атомы хлора в молекуле, которые не прореагироваЛИ с силанольными группами из-за пространственных затруднений, могут в дальнейшем гидролизоваться в процессе работы вводными растворителями с образованием полярных силанольных групп. Последние могут взаимодействовать с анализируемыми веществами, имеющими полярные группы, изменяя времена удерживания.

Однако полимерные слои, особенно имеющие небольшую толщину и получаемые при малой степени полимеризации трихлорсиланов до и в процессе прививки, имеют и некоторые преимущества перед мономерным привитым слоем. В частности, если толщина слоя небольшая, то скорость диффузии анализируемых молекул уменьшается незначительно; в то же время такая полимерная молекула соединена с силикагелевой матрицей не одной, как мономерная, а многими связями. Поэтому разрыв одной связи, например, в результате гидролиза, приводит к отрыву и переходу в подвижную фазу мономерной молекулы, тогда как полимерная удерживается на месте другими связями и продолжает участвовать в разделении до разрыва всех удерживающих ее связей. Это важно, если по условиям анализа требуется использовать растворитель с рН<3 или >8, что ускоряет протекание гидролиза и отщепления привитой фазы.

Как видно из приведенной схемы димеризации алкилтрихлорсилана, если исходная молекула имеет три реакционно-способных хлора, то димер – четыре, соответственно тример будет иметь их 5, тетрамер – 6 и т.д. В этом случае, как мы видим, с увеличением молекулярной массы полимера число потенциальных центров прививки молекулы к силикагелю растет. Однако и пространственные затруднения при взаимодействии такой молекулы с силикагелевой матрицей также возрастают по мере роста ее молекулярной массы, поэтому по мере достижения некоторой молекулярной массы количество реально образующихся связей прививаемой фазы и силикагелевой матрицы доходит до максимума, а в дальнейшем начинает снижаться.

По приведенным выше схемам прививают такие распространенные агенты, как октилтрихлорсилан, октадецилтрихлорсилан и др.

По несколько другой схеме полимеризация осуществляется, если прививаемый агент – диалкилдихлорсилан (или алкиларилдихлорсилан, или диарилдихлорсилан).

Образующиеся при этой реакции димеры, тримеры и полимеры также могут реагировать с силанольными группами силикагеля, давая вместо привитого мономерного привитой полимерный слой фазы. Однако этот полимер отличается от того, который образуется при реакции с силикагелевой матрицей алкилтрихлорсиланов. Первое отличие состоит в том, что он получается линейным по цепи – Si-О–Si-О–Si-О–, поскольку исходный диалкилдихлорсилан и его димер, тример, тетрамер и т.д. являются бифункциональными и содержат по два активных атома хлора. Во-вторых, если прививка такого полимера к силикагелевой матрице происходит, она идет только в одной или в двух точках, т.е. отрыв при гидролизе такой привитой молекулы протекает более легко (достаточно разорваться одной или двум связям, и молекула полимера отрывается от матрицы и переходит в подвижную фазу). По указанной схеме прививают диметилдихлорсилан, дифенилдихлорсилан и др.

Наконец, если прививаемый агент является триалкилмонохлороиланом, он тоже может реагировать с водой, присутствующей в реакционной среде. Однако его реакционная способность значительно ниже, чем у ди- и трихлорсиланов.

Так как димер не имеет реакционноспособных атомов хлора то он не вступает ни в реакцию дальнейшей полимеризации, ни в реакцию прививки к силикагелевой матрице. Это очень важно, ибо в этом случае при прививке получается гарантировано только мономерный привитой слой неподвижной фазы. Образовавшийся димер в дальнейшем удаляется при отмывке непрореагировавшего реагента и побочных продуктов реакции. Последний способ прививки, как видно из обсуждения, дает наиболее упорядоченный по структуре и составу привитый слой. Поэтому хотя стоимость таких исходных реагентов несколько выше, а реакционная способность их ниже, что забавляет вести прививку в более жестких условиях и брать избыток прививаемого реагента, популярность таких сорбентов растет, и большая часть вновь появляющихся сорбентов, как отмечено в рекламных данных, получена с использованием этого метода прививки. По такой схеме прививают октилдиметилхлорсилан, октадецилдиметилхлорсилан, триметилхлорсилан и др.

Какие же алкильные группы можно химически привить указанными способами к поверхности силикагеля? Наиболее применимы длинные алкильные цепи, обычно C8 и C18, но в последнее время растет популярность привитых более коротких алкилов С4 и С3, особенно на силикагелях с широкими порами для анализа биологически важных больших молекул. Чаще всего применяют привитой октадецилсилан. Он наиболее сильно удерживает анализируемые вещества и позволяет работать с элюентами, содержащими мало воды. Это целесообразно, так как анализируемые вещества, как правило, лучше растворяются в метаноле или ацетонитриле, чем в воде. Кроме того, аномально высокая вязкость смесей метанола и воды существенно снижается при большом содержании метанола, что позволяет работать при сравнительно низком давлении на колонке с боль-Вой эффективностью за счет повышения скорости диффузии при снижении вязкости.

Арильные (ароматические) привитые группы получают аналогичным способом, однако их используют реже. Они позволяют получить селективность, отличающуюся от селективности на привитых алкильных группах.

По мере роста длины цепи прививаемой молекулы ее реакционная способность уменьшается за счет пространственных затруднений при взаимодействии с силанольными группами силикагеля. Если из 5 силанольных групп, приходящихся на 1 нм2 поверхности силикагеля, почти все удается заместить при прививке алкила C1, то при алкиле C18 в лучшем случае удается заместить половину из них. Оставшиеся на поверхности не вступившие в реакцию силанольные группы экранируются уже привитыми молекулами и не могут вступить в реакцию с новыми молекулами октадецилхлорсилана. Однако для молекул с меньшей молекулярной массой, будь то молекулы растворителя или анализируемых веществ, пространственная затрудненность может оказаться недостаточно большой, чтобы воспрепятствовать их взаимодействию. Это может существенно изменить вид хроматограммы, которая покажет аномально большое удерживание (иногда с заметным уширением пика) для таких анализируемых молекул.

Для того чтобы более полно устранить силанольные группы на поверхности, которые остались после прививки октадецилхлорсилана, проводят окончательное закрытие («энд кэппинг») их путем обработки силилируюшими агентами, имеющими малый размер молекул, обычно триметилхлорсиланом. Такие малые молекулы легко вступают в реакцию с частично экранированными силанольными группами. Аналогичную реакцию окончательного блокирования силанольных групп на поверхности силикагеля часто используют в тех случаях, когда прививку фазы проводят полимеризующимися три-и дихлорсиланами. Устранение силанольных групп с поверхности и их замена на триметилсилильные гидрофобные группы повышает также устойчивость силикагельной матрицы к воздействию воды, особенно при рН менее 3 и более 8.

Условия проведения «энд кэппинга», в том числе предварительная подготовка и обработка поверхности с целью перевода оставшихся непрореагировавших атомов хлора в гидроксильные или другие реакционноспособные группы, выбор растворителей, катализаторов, условий реакции, как правило, составляют «ноу хау» фирмы. Часто проведение «энд кэппинга» практически не меняет таких характеристик сорбента, как содержание углерода, удельная поверхность и др., однако характер взаимодействия с поверхностью такого сорбента для молекул, имеющих полярные группы, особенно обладающие кислотными или основными свойствами, изменяется очень резко.

Наряду с алкильными и арильными группами таким же путем, используя замещенные моно-, ди- и трихлорсиланы, можно к силикагелевой матрице привить и другие группы, наиболее распространенными из которых (в порядке уменьшения частоты применения) являются следующие: – Si – (СН2) 3-СN-алкилнитрильная группа; – Si – (СН2) зNН2-алкиламинная группа (возможна вторичная или третичная аминогруппа), слабый анионообменник; – Si – (СН2) з–СН (ОН) – СН2ОН – алкилдиольная группа; – Si-СН2-С6Н4-SO3H-сильный катионообменник, содержащий сульфогруппу (или сульфогруппы); – Si – [Alk4N]+OH- – сильный анионообменник, содержащий четвертичную аммониевую группу.

Если алкилнитрильную и алкиламинную группы прививают, как правило, за один прием, то прививка других групп более сложна и включает ряд последовательных реакций (две или три). Такие сорбенты, естественно, более сложны в производве, и воспроизводимость их характеристик ниже, тогда как стоимость значительно выше.

Алкилнитрильную, алкиламинную и алкилдиольную привитые фазы можно использовать в разных вариантах хроматографии. Прежде всего они могут быть применены для работы с неполярными растворителями типа гексан – изопропанол, где они проявляют свойства, близкие к свойствам силикагеля без привитой фазы. Однако их селективность отличается от селективности силикагеля, что позволяет подобрать наилучший сорбент для каждого анализа. Кроме того, их преимуществом перед силикагелем является более быстрое уравновешивание с растворителем, и это позволяет использовать их при работе с изменением состава растворителя в процессе анализа, т.е. с градиентом растворителя. Они также менее чувствительны к влиянию воды.

Алкилнитрильную фазу используют и в обращенно-фазной хроматографии, селективность при этом получается иная, чем на силикагелях с алкильной группой. Такой же эффект наблюдается при применении алкиламинной группы. Кроме того, она проявляет слабые анионообменные свойства, что часто используют при анализе биологически активных веществ, например олигодигонуклеотидов с градиентами по рН и силе буферного раствора. Алкилдиольную группу, кроме нормально-фазной хрома-графии, применяют как фазу, позволяющую работать с белками в режиме эксклюзионной хроматографии, которая не сорбирует необратимо и не денатурирует их, сохраняя биологическую активность белков.

Сильные катионо- и анионообменники находят применение анализе биологических жидкостей для определения ряда лекарственных препаратов, биогенных аминов, их метаболитов и др. Разработан метод ион-парной хроматографии, в котором используют динамические слои катионо- или анионоактивных агентов, обладающие свойствами ионообменников и в то же время обращенно-фазных сорбентов. Эти слои наносят из растворителя, содержащего ион-парный реагент, (обычно алкил-сульфокислоты или тетраалкиламмониевые основания), пропуская его через сорбент для обращенно-фазной хроматографии. Ион-парная обращенно-фазная хроматография является методом анализа смеси ионизирующихся и неионизирующихся веществ.

Многие производители сорбентов не выпускают полного ассортимента сорбентов всех описанных выше типов, поскольку ограниченный спрос на такие сорбенты не окупает затрат на их разработку и производство. Есть фирмы, выпускающие не только все перечисленные сорбенты, но и дополнительно ряд других с привитыми нитрогруппами, карбокси- и карбоксиметильными группами, оптически активными фазами и т.д. Практически все фирмы выпускают основной ассортимент привитых фаз, который включает C8, C18, нитрильную и аминофазы, различающиеся также по зернению.

Несмотря на большую и все возрастающую популярность сорбентов с привитыми фазами, до сих пор вопрос о механизмах разделения на них остается не совсем ясным и часто поднимается в дискуссиях, где высказываются различные, нередко противоположные мнения о их роли в процессах разделения. Если на разделение и удерживание влияет несколько механизмов, то вклад каждого определяется несколькими факторами; основными являются свойства поверхности сорбентов, состав элюента и химическая природа каждого из анализируемых веществ.

Рассмотрим концепции о действии механизмов разделения, например в случае обращенно-фазных сорбентов, получивших наибольшее распространение.

Первоначальное представление о работе обращенно-фазных сорбентов было высказано, когда перешли от нанесенных на силикагель полимерных жидких фаз (жидкостно-жидкостная хроматография) к октадецилтряхлорсилану и его аналогам, химически привитым на поверхность силикагеля в пелликулярных материалах, дававшим привитую довольно толстую полимерную пленку фазы. Поэтому первый подход к привитой фазе был как к пленке жидкости на носителе, разделение на которой происходит за счет разных коэффициентов распределения анализируемых веществ между двумя жидкостями – растворителем и привитой фазой, т.е. за счет абсорбции. Такой подход получил признание, как позволивший получить и предсказать линейную зависимость удерживания неполярных гомологов, таких, как алкилбензолы. Этот же подход был распространен в дальнейшем и на привитые монослои алкилсиланов, хотя здесь он представляется более удаленным от действительности, поскольку жидкости как таковой на поверхности нет, а есть только отдельные привитые химически молекулы, «раствориться» в которых молекула анализируемого вещества не может. В этом случае может идти речь о взаимодействии молекул привитой фазы и анализируемого вещества за счет межмолекулярных сил.

Первоначальное представление о механизме разделения на ращенных фазах оказалось верным, однако для веществ более сложного строения с функциональными группами отклонения были частыми и большими. Развитием этой концепции было предположение о том, что на поверхности обращенно-фазного сорбента из растворителя, который содержит подобий привитому слою компонент (метанол или ацетонитрил), и менее ему подобный (вода), образуется удерживаемый силами адсорбции слой жидкой фазы, обогащенный менее полярными компонентами (метанолом). Этот слой имеет другой состав, чем подвижная фаза, и заметно отличается от привитой фазы по своей природе. Поэтому, участвуя в разделении анализируемых веществ, такой слой сильно взаимодействует с полярными группами веществ по другому механизму, чем привитой слой.

Для более полного представления о сложности механизмов разделения следует учесть, что силанольные группы, пространственно недоступные при прививке неподвижной фазы из-за большого объема триметилсилил-, диметилоктадецилсилил или диметилоктилсилильных групп, остаются на поверхности сорбента в большом количестве (около половины от имевшихся на поверхности исходного силикагеля). Они являются пространственно доступными для малообъемных небольших молекул, таких, как молекулы воды, метанола, ацетонитрила, которые способны взаимодействовать с ними, давая поляризованные слои растворителей также другого состава и свойств, чем использованный растворитель. Эти поляризованные молекулы также взаимодействуют с молекулами анализируемых веществ и дают свой вклад в удерживание. Наконец, силанольные группы имеют слабокислотную функцию и могут участвовать в разделении, действуя как ионообменники, взаимодействуя не только с анализируемыми веществами, но и извлекая ионы металлов переменной валентности, такие как железо, хром, никель и другие присутствовавшие в растворителе, пробе или образующиеся в результате коррозионных процессов в аппаратуре. Показано, чтo на поверхности сорбента, находящегося в аналитической бращенно-фазной колонке размером 4,6 Х 250 мм, может сорбироваться более десяти микрограммов железа. Ионы металлов переменной валентности также участвуют в разделении, взаимодействуя с некоторыми из анализируемых веществ. Вклад в разделение вносят и эксклюзионные процессы, по-разному действующие на молекулы малой и большой молекулярной массы.

Таким образом, оценить по параметрам удерживания вклад каждого из механизмов разделения и сформулировать гипотезу возможно применительно к молекулам родственного строения; для достаточно сложных молекул или смесей, очевидно, еще долго это не будет возможным даже при использовании мощного математического аппарата. Выбор оптимальных условий разделения с учетом возможных механизмов взаимодействия сорбента и анализируемых компонентов смесей еще долго будет оставаться основной проблемой при разработке аналитических методик в ВЭЖХ.

Литература

Fitzpatrick F.A., Wanalda M.A., Kaiser D.G./Anal. chem, 1977, v. 49, p. 1032.

Dunlap K.L., Sandridge R.L., Keller /./Anal. Chem, 1976, v. 48, p. 297.

Poole C. F, e. a./J. High Resol. Chromatogr. Commun., 1978, v. 1, p. 83.

Denkert M. e. a./J. Chromatogr, 1981, v. 218, p. 31–43.

Bartha A. e. a./J. Chromatogr, 1984, v. 303, p. 29–38.

Gloor R., Johnson E.L./J. Chromatogr. Sci, 1977, v. 15, p. 413–423.

Kraak J.C., Jonker K.M., Huber J.F.K./J. Chromatogr, 1977, v. 142, p. 671–680.

Wehli A. e. a./J. Chromatogr, 1979, v. 149, p. 199–210.

Даванков В.Л. / Журн. ВХО им. Менделеева, 1983, т. XXVIII, №1, с. 25–29.

Даванков В.А. // в кн. Прикладная хроматография / Под ред. К.И. Сако-дынского. М, Наука, 1984, с. 24–32.

Davankov V.A., Kurganov A.A., Bochkov A.S./fln Advances in Chroma-tography/ed. J.C. Giddings e. a. N. Y, M. Dekker, 1983, v. 22, p. 139 – 185.

Apffel J.A., Alfredson T.V., Major R.E./J. Chromatogr, 1981, v. 206, p. 43–57.

Препаративная ВЭЖХ

К настоящему времени не создан единый вариант метода препаративной ВЭЖХ, который обладал бы как большой скоростью и эффективностью разделения, так и высокой производительностью и экономичностью. Поэтому предложены варианты метода, значительно различающиеся по размерам и эффективности колонок, по производительности работы, требованиям к оборудованию и затратам на оборудование, сорбенты и растворители. При выборе оптимального варианта препаративной ВЭЖХ для каждой конкретной задачи. Исследователю приходится сталкиваться с рядом трудностей и проблем.

Первой и основной трудностью является высокая стоимость узко сепаративных сорбентов, особенно привитых, с размером частиц от 5 до 20 мкм. Если с этим можно мириться для аналитических колонок диаметром 2–5 мм, то стоимость резко растет при использовании колонок диаметром 10, 20 или 40 мм и может составить соответственно 200, 800 и 3200 рублей (без учета стоимости металлических колонок и работы по их заполнению). Кроме того, такие колонки достаточно непросто заполнять суспензионным способом.

Вторая трудность–создание хроматографов, насосы которых могли бы подавать растворитель при давлениях 5–20 МПа при расходе 5–100 мл/мин, а инжекторы позволяли бы водить без размывания пробы объемом 0,5–10 мл. Для таких насосов необходимы довольно мощные, дорогостоящие и тяжелые электродвигатели, сложные и дорогие уплотнения, клапаны и т.д.

Третья трудность–необходимость расходования больших объемов растворителей высокой чистоты, что приводит к большим затратам труда и времени на их регенерацию и очистку или к большим тратам на их приобретение. Расход растворителя достигает 10 л и более на 1 г препаративно выделенного очищенного продукта.

Наконец, существуют проблемы, связанные с ограниченной растворимостью образца в растворителе, повышенной вязкостью концентрированных растворов, взрыво- и пожароопасностью работы, необходимостью удаления больших объемов растворителей под вакуумом и т.д.

Конечно, все эти трудности возрастают по мере роста масштаба работы и количества вещества, которое нужно препаративно выделить или очистить. Отсюда первое правило: масштаб препаративного разделения должен быть мал настолько, насколько позволяют поставленные задачи.

Многие проблемы, связанные с выделением 1–10 мг чистых веществ для их идентификации современными высокочувствительными физико-химическими методами легко разрешаются на обычных аналитических колонках диаметром 4–5 мм путем многократного ввода проб и сбора фракций. Как правило, для таких работ не требуется никакого специального оборудования, кроме обычного аналитического хроматографа, а сбор фракций осуществляется вручную. Производительность работы можно увеличить без существенного изменения аппаратуры, заменив аналитическую колонку на препаративную диаметром 10–14 мм: как правило, насосы способны подавать до 5–10 мл/мин растворителя, а инжекторы–вводить 0,1–1 мл пробы. Правда, стоимость оборудования увеличивается на стоимость такой колонки, однако и производительность работы возрастет в 4–10 раз. Дальнейшего увеличения количества выделяемого вещества можно добиться уже только при значительном усложнении и удорожании оборудования.

Так, разделить большие количества на аналитическом хроматографе с колонкой диаметром 10–14 мм можно при увеличении продолжительности его работы, чего можно достигнуть путем автоматизации процесса ввода и сбора образца. Для этого хроматограф должен быть оснащен коллектором фракций, автоматическим устройством ввода пробы и компьютером, управляющим их работой. Для некоторых жидкостных насосов предусмотрена возможность установки специальных препаративных головок, иногда с рециклом разделенных фракций, позволяющих использовать эти насосы с колонками диаметром 20–25 мм (при производительности до 20–30 мл/мин) или 35–50 мм (до 100 мл/мин). Соответственно петлевой инжектор должен иметь достаточно широкие внутренние каналы и возможность установки петли размером до 10 мл. Конструкция и геометрия петли должны быть такими, чтобы обеспечивалось минимальное размывание образца при вводе пробы: длинные петли малого диаметра без резких изменений геометрии потока предпочтительней коротких и большого диаметра. Нередко удается заметно улучшить разделение, одновременно уменьшив размывание образца при вводе пробы путем ввода пробы без инжектора, установив вместо него тройник малого Ир объема и вводя пробу вспомогательным насосом высокого ржавления, работающим короткий отрезок времени. Менее удобным способом, дающим сходный результат, является ввод больших проб на колонку шприцем с использованием инжектора с прокалываемой резиновой мембраной, или краном малого объема, однако при этом ввод пробы (из-за ограниченного давления, которое можно создать шприцем даже хорошего качества: около 5 МПа для шприца емкостью 1 мл и около 1 МПа–для шприца емкостью 10 мл) осуществляют при остановке потока (выключении основного насоса).

При использовании колонок большого диаметра (10 мм и более) особое внимание должно быть уделено выбору сорбента. Как правило, дорогие узкодисперсные сорбенты с размером частиц 5 или 10 мкм для широких колонок использовать нецелесообразно из-за высокой стоимости и трудности суспензионной упаковки. Поэтому часто идут на компромиссное решение и используют препаративную фракцию того же сорбента с размером частиц 25–40 мкм или 40–70 мкм, которая выпускается рядом фирм специально для этих целей. Преимуществом такого сорбента является возможность упаковки сухим способом в колонки большого диаметра, более низкая стоимость (в 3–6 раз дешевле) при полном сохранении химической природы поверхности и пористости сорбента, используемого в аналитическом варианте. Кроме того, при работе с более крупным сорбентом требуется значительно меньшее давление, что упрощает работу и позволяет использовать более дешевое оборудование.

Выпускают также сорбенты для препаративной работы с размером частиц 15–25 мкм. Колонки, заполненные такими сорбентами суспензионным методом, имеют высокую эффективность. При использовании непривитого силикагеля, колонок очень большого диаметра (более 20 мм) и при необходимости очистки или выделения очень больших количеств вещества нередко практикуется применение дешевого и доступного сорбента. Часто используют силикагель для ТСХ (фракция 5–40 мкм), который нередко фракционируют седиментацией для сужения фракционного состава (отделяют пылевидные частицы, заметно повышающие гидравлическое сопротивление колонки, и наиболее крупные). Нередко применяют наиболее мелкую фракцию (40–70 мкм), имеющуюся в продаже для колоночной хроматографии. Однако переход на сорбент с другим размером и распределением пор и с несколько другими химическими свойствами поверхности может привести к заметному изменению разделения, удерживания, а иногда даже и порядка выхода разделяемых компонентов. Такие же изменения наблюдаются и при переходе от привитого сорбента одной фирмы к препаративному сорбенту другой фирмы.

Количество образца, которое можно ввести на колонку для препаративного разделения, зависит от многих факторов, и для каждого случая должно определяться экспериментально, предпочтительно с использованием аналитической колонки и растворов образца разной концентрации. В самом общем виде можно сказать, что масса образца, которую можно ввести, составляет от 0,1 до 1 мг на 1 г сорбента при отсутствии заметной перегрузки колонки пробой (снижение эффективности колонки менее чем в 2 раза). Как правило, препаративные разделения проводят при максимально возможной перегрузке колонки пробой, поэтому чем больше α для разделяемых компонентов, тем больше можно перегрузить колонку пробой и тем соответственно больше получить разделенного вещества за препаративный цикл. При разделении простых смесей, когда работают с большой перегрузкой, эффективность препаративных колонок с мелкими узкодисперсными сорбентами по основным пикам быстро падает, но по пикам примесей остается высокой, что позволяет отделять их более четко. При работе с большой перегрузкой эффективность по основным пикам для малоэффективных колонок и колонок средней и высокой эффективности близка. Однако по мере усложнения задачи (более сложные смеси, меньше α) допустимая перегрузка уменьшается и малоэффективные колонки становятся непригодными. они перестают обеспечивать разделение и получение чистых компонентов даже при отсутствии перегрузки.

Растворители, используемые для препаративной работы. должны быть, как правило, перегнанными, профильтрованными и не содержать примесей, так как в процессе выделения образца из фракции упариванием его концентрация (и концентрация примесей, остающихся в нем от недостаточно чистого растворителя) увеличивается в 200–1000 раз. Смена растворителя в препаративной ВЭЖХ с колонками большого диаметра и уравновешивание колонки с новым растворителем обычно достаточно длительны, сопровождаются большим расходом растворителей, поэтому работу надо планировать так, чтобы делать это по возможности редко. Раствор образца определенной концентрации должен быть приготовлен на основании экспериментов, выполненных на колонке с таким же сорбентом, но меньшего размера: вводят пробы растворов разной концентрации и объема и выбирают соотношение, позволяющее нагрузить колонку наибольшим количеством образца при достаточном для сбора препаративных фракций в чистом виде разделении. Раствор образца должен быть тщательно профильтрован и не содержать взвесей твердых частиц, в том числе и выпадающих в процессе его хранения до конца препаративной работы. Целесообразно для предохранения колонки от возможного загрязнения такими частицами ввести в систему фильтр малого объема между инжектором и препаративной колонкой. Нужно стараться проводить всю препаративную работу в максимально сжатые сроки, предохраняя раствор образца и собранные фракции от длительного контакта с воздухом, светом и повышенной температурой. Чем ниже температура и меньше срок хранения раствора, чем быстрее отгоняется растворитель от собранных фракций, тем чище получаются собранные вещества и легче вся дальнейшая работа с ними.

Особое место в препаративной ВЭЖХ занимает эксклюзионная хроматография макромолекул. Этот метод используют в предварительном варианте для выделения целевых веществ или их групп из смесей, содержащих компоненты с заметно

различающейся молекулярной массой. Исключительную важность этот метод имеет для очистки лабильных биополимеров. Так, на препаративных колонках с TSK-гелями SWG за один ввод можно очистить 100–200 мг ферментов. Разработана технология приготовления высокоэффективных препаративных колонок для эксклюзионной хроматографии синтетических полимеров. Это позволило решить одну из наиболее трудных проблем исследования полимеров – быстрое получение узких фракций, необходимых для исследовательских целей и для калибровки аналитических систем. Особенно важным является то обстоятельство, что этим методом можно фракционировать практически любые полимеры, в то время как классические методы фракционирования не только несоизмеримо более трудоемки, но и малопригодны для разделения многих объектов, в частности, образцов с молекулярной массой до 10 000 – 30000.

Следует отметить, что при разделении синтетических полимеров нельзя сильно перегружать колонку. За счет вязкостного эффекта наблюдается сильное смещение удерживаемых объемов, что резко ухудшает качество получаемых фракций. Тем не менее производительность процесса достаточно высока. Так, при препаративном разделении на колонке размером 250х21,5 мм с зорбаксом-сил эффективностью около 10000 т.т. при единовременном вводе 200 мг образца сополимера этилена с винилацетатом (объем дозы 8 мл, концентрация 2,5%) разделение заканчивалось за 5 мин при скорости подвижной фазы (тетрагидрофуран) 16 мл/мин. Такая скорость разделения позволила за рабочий день фракционировать 8 г сополимера даже без применения автоматического дозатора с ручным отбором фракций каждые 20 с. Характеристики полученных фракций представлены в табл. 3.1.

Эти результаты показывают, что в выбранных условиях удалось получить весьма узкие фракции сополимера с молекулярной массой более 3000. Две последние фракции асимметричны и имеют заметно большую полидисперсность за счет присутствия продуктов с более высокой молекулярной массой, сильнее адсорбирующихся на силикагеле.

Чтобы полностью избежать проявления адсорбционных эффектов, разделение нужно проводить на колонках с полужесткими гелями.

Таблица 1. Характеристики узких фракций сополимера этилена с винилацетатом

Микроколоночная ВЭЖХ

Среди специалистов до настоящего времени идут споры о том, какую хроматографию следует считать микроколоночной. какую обычной аналитической, но в меньшем масштабе [57, 58]. Если жидкостная хроматография с использованием поверхностно-пористых (пелликулярных) сорбентов осуществляется на колонках диаметром около 2 мм и даже 1 мм и длиной до нескольких метров, можно ли считать ее микроколоночной ВЭЖХ или нет? Можно ли отнести к области современной микроколоночной хроматографией ранние работы с использованием заполненных микрочастицами размером 5 и 10 мкм тефлоновых колонок, эффективность которых 500 – 1500 т.т.?

Представляется целесообразным считать, что современная микроколоночная ВЭЖХ возникла около 8 лет назад и признаками ее появления в окончательно сформированном виде следует считать, во-первых, разработку технологии заполнения высокоэффективных колонок диаметром 2 и 1 мм, объемом от 50 до 800 мкл и имеющих приведенную ВЭТТ от 2 до 5, т.е. такую же, как у современных аналитических колонок, с микрочастицами размером 3, 5, 7 и 10 мкм (до 20 мкм), во-вторых, создание, разработку и серийный выпуск как специально разработанных узлов, так и хроматографов для микроколоночной ВЭЖХ. Достигнутая степень миниатюризации ВЭЖХ с колонками диаметром 1 мм уже позволила широко ввести этот метод в практику и оценить получаемые преимущества резкое снижение расхода растворителя и сорбента (в 15–25 раз), повышение чувствительности метода и снижение определяемого минимума вещества в пробе (в 15–25 раз). Это существенно ускорило внедрение жидкостной хроматографии в биологию, биотехнологию, медицину.

Проводимые работы по развитию микроколоночной ВЭЖХ, направленные на дальнейшую миниатюризацию колонок, очевидно, являются перспективными и нужными, однако их освоение и внедрение в практику в большой мере сдерживается техническими трудностями. Описаны капиллярные колонки для ВЭЖХ с внутренним диаметром около 5 и 10 мкм, в том числе и с привитыми фазами, позволившие получить эффективность до нескольких миллионов т.т.; описаны колонки с привитыми сорбентами, имеющие внутренний диаметр около 30–50 мкм, также позволившие получить эффективность около миллиона т.т. Однако ввод проб в такие колонки, особенно количественный, стабильная подача растворителей с расходом 0,01–1 мкл/мин при давлениях 10–40 МПа, наконец, создание детекторов с объемом кюветы в 1–20 нл, дающих высокую чувствительность, – все это только часть серьезных проблем, решить которые предстоит в дальнейшем. Сейчас можно предсказать, что в ближайшие 5–10 лет микроколоночные хроматографы с колонками диаметром 0,2–2 мм найдут самое широкое применение в аналитической практике, хотя и не станут наиболее массовыми.

Каковы же основные отличия аппаратуры для микроколоночной ВЭЖХ от обычной? Насос должен стабильно подавать растворитель при высоких давлениях (5–40 МПа) и небольших расходах (0,1–100 мкл/мин). Как правило, обычные насосы для ВЭЖХ либо не работают при таких параметрах, либо не обеспечивают стабильной подачи. Инжектор должен обеспечивать воспроизводимый ввод проб размером 0,1–1 мкл при высоких давлениях (до 40 МПа), что также не удается осуществить, используя старые петлевые инжекторы с петлями 10 мкл и более. Для соединения колонки с инжектором и детектором приходится идти либо на прямое соединение без использования капилляров, либо использовать капилляры с внутренним диаметром 50–150 мкм очень небольшой длины (2–5 см). Наконец, детектор должен иметь кювету очень малого объема (0,03–1 мкл), но обеспечивающую высокую чувствительность детектирования (для УФ детекторов длина оптического пути должна быть от 1 до 10 мм). Для градиентной микроколоночной ВЭЖХ дополнительно возникают трудности, связанные с микроподачей элюента в начале и конце градиента (от 1% обычного расхода для микроколонки) и созданием эффективного микросмесителя вместимостью от 1 до 20 мкл. Весьма проблематичным становится формирование градиента одним насосом и системой клапанов на стороне низкого давления, так как устройство такого типа с вместимостью 10–40 мкл (включая объемы клапанной системы, подводящих капилляров и поршневой камеры или камер насоса) очень трудно представить.

Какие основные проблемы в настоящее время существуют в микроколоночной хроматографии? Во-первых, это трудность приготовления высокоэффективных колонок с внутренним диаметром 0,5–2 мм с широким диапазоном сорбентов всех типов. Во-вторых, существует ограниченный круг детекторов с микрокюветами вместимостью 0,03–2 мкл, пригодных для работы с микроколонками, которые серийно производят в достаточно широком масштабе и по доступным ценам. Такими детекторами являются некоторые УФ-фотометры, спектрофотометры, флюоресцентные детекторы, электрохимические детекторы. Очень интересным и информативным является сочетание микроколоночной ВЭЖХ с хроматомасс-спектрометром, позволяющее существенно упростить проблему интерфейса для ряда применений, однако высокая стоимость такого детектора ограничивает его широкое применение. Разработка детекторов с лазерными источниками позволяет создать микрокюветы для рефрактометров и Других детекторов, однако стоимость таких детекторов достаточно высока. В-третьих, существуют психологические трудности и инерция производства, поддерживающие развитие традиционной ВЭЖХ и сдерживающие развитие микроколоночной.

Отечественный серийный микроколоночный хроматограф «Милихром» нашел широкое применение как в исследовательской работе, так и для контроля на производстве. Он имеет шприцевой насос вместимостью 2500 мкл, выполненный из упрочненного стекла, жидкость контактирует только с высокоинертными материалами: фторопластом, стеклом и танталом, что позволяет использовать высокоагрессивные растворители с и добавки. Насос рассчитан на давление 10 Мпа (До 1987 г. – 5 Мпа.) и диапазон подачи растворителя от 1 до 600 мкл/мин. Детектором служит сканирующий спектрофотометр с диапазоном длин волн 190 – 360 нм и временем сканирования от 0,15 с, что позволяет осуществлять сканирование в выбранном диапазоне длин волн в без остановки потока. Диапазон оптических плотностей детектора от 12,8 до 0,05 единиц адсорбции на всю шкалу в пересчете на длину оптического пути 10 мм. Микрокювета детектора имеет вместимость 1,5 мкл при длине оптического пути 1,5 мм. Оригинально выполнен узел ввода пробы: набор пробы от 0,1 мкл и более осуществляется засасыванием пробы в иглу путем регулируемого хода шагового двигателя, управляющего насосом. Игла с пробой далее уплотняется путем обжимания фторопластового конуса вплотную к верхнему фильтру колонки, и при пуске насоса проба без размывания подается через иглу в колонку; тем же путем подается растворитель, промывающий иглу и элюирующий пробу. Таким образом, ввод пробы осуществляется без использования микрошприца, при этом удается исключить ошибки, связанные с плохой промывкой шприца от предыдущей пробы и характерные для начинающего и малоопытного оператора.

В хроматографе предусмотрено использование колонок двух типов: стеклянных с внутренним диаметром 1–1,5 мм, рассчитанных на работу при давлении до 1,5 МПа и создание полностью инертной хроматографической системы, и из нержавеющей стали длиной 60 и 120 мм с внутренним диаметром 2 мм. Все соединительные линии в хроматографе выполнены из толстостенных фторопластовых капилляров, на конце имеющих развальцовку, по которой и производится уплотнение; при низком давлении используются капилляры из полиэтилена. Шприцевой насос «Милихром» имеет привод от шагового двигателя, что позволяет не только обеспечить высокую воспроизводимость времени удерживания и количества вводимой пробы, но и формировать при необходимости в камере насоса градиент растворителя заданной формы и осуществлять градиентное элюирование сложных по составу смесей веществ. Предусмотрена также работа «Милихрома» с микроколлектоPOM фракций, обеспечивающим сбор микрофракций для последующей идентификации другими физико-химическими методами.

Серийно выпускают хроматографы, предназначенные для микроколоночной ВЭЖХ, различные зарубежные фирмы. Следует отметить микроколоночный хроматограф «Фэмилик 300 С» фирмы «Джаско», имеющий трехплунжерный насос, микроинжектор вместимостью 1 и 3 мкл, спектрофотометр «Увидек 100 V» с кюветой вместимостью 1 мкл при 5 мм длины оптического пути и флюориметрический детектор с кюветой вместимостью 2 мкл. Эта фирма имеет большой опыт в производстве микроколоночных хроматографов, так как она выпустила в продажу первый микроколоночный хроматограф «Фэмилик 100» в 1976 г. Интересен микроколоночный хроматограф фирмы «Иско», имеющий шприцевой насос вместимостью 50 мл и давлением 70 МПа с подачей растворителя от 0,02 до 600 мкл/мин, микроинжектор вместимостью 0,1 мкл и спектрофотометрический детектор с кюветами разной вместимости и длины оптического пути от 0,5 мкл и 10 мм до 0,03 мкл и 1 мм. Градиентную микроколоночную систему с двумя шприцевыми насосами выпустила фирма «Броунли Лабс»; систему с двумя и тремя растворителями предлагает фирма «Хьюлетт-Пакард». Набор гибких микроколоночных хроматографов разработан фирмой «Жилсон» – от простейшего изократического с подачей растворителя от 0,5 мкл/мин при 42 МПа, с микроинжектором на 1 мкл и УФ-детектором на 254 и 280 нм с микрокюветой 1,3 мкл при 5 мм до градиентного хроматографа, имеющего в качестве детектора спектрофотометр с такой же микрокюветой или флюориметрический детектор с микрокюветой. Широкий набор спектрофотометров с микрокюветами вместимостью 0,5 мкл при 1 мм длины оптического пути выпускает фирма «Кратос»; она же выпускает флюориметрические детекторы с микрокюветами. Изократические хроматографы для микроколоночной ВЭЖХ выпускают фирмы «Шимадзу», «Кнауэр», «ЛК.Б», «Байо-Рэд», «Вариан», «Лаборатори Дэйта Контрол» и др.

Большой интерес представляет сочетание микроколоночной ВЭЖХ с масс-спектрометрией. Известно, что присутствие больших количеств растворителя в элюенте, выходящем из хроматографической колонки обычного размера (4,6 мм Х 250 мм), обусловливает создание достаточно сложного и дорогого интерфейса. Этот интерфейс предназначен для удаления растворителя и транспортировки проб в ионизационную камеру масс-спектрометра. Если сечение хроматографической колонки уменьшается, как в микроколоночной ВЭЖХ, в 25–100 раз, т.е. если используют колонки диаметром от 0,5 до 1 мм, мощности насосов масс-спектрометра хватает для удаления растворителя и поддержания высокого вакуума в ионизационной камере, и необходимость в интерфейсе отпадает. Следует отметить, однако, что еще не решен ряд проблем при прямой стыковке микроколонки и масс-спектрометра, таких, как удаление солей из элюента при использовании буферных систем растворителей, резкое снижение температуры на конце микроколонки из-за интенсивного съема тепла при испарении растворителя и др.

Большой интерес представляют и другие сочетания микроколоночной ВЭЖХ с физико-химическими методами анализа. Например, показано, что с использованием дисков из бромида калия можно записать и запомнить хроматографическую информацию, поступающую с микроколонки, и при необходимости получить ИК-спектр и другую информацию об интересующем пике или участке хроматограммы.

ВЭЖХ с градиентом состава растворителя

При разработке метода разделения сложных смесей веществ, особенно биологического и природного происхождения, Исследователю часто приходится сталкиваться с тем, что в их состав не только входит большое количество соединений, но и сильно различаются их свойства. Подобрать в этом случае сорбент и растворитель, которые обеспечивали бы разделение вcex или большинства интересующих исследователя компонентов, обычно не удается. Однако еще тогда, когда колонки в хроматографии были малоэффективными, было найдено и средство для решения таких задач – использование растворителя, элюирующая сила которого постепенно увеличивалась. Это приводило к тому, что как слабо, так и сильно удерживаемые вещества выходили из колонки за приемлемо короткое время, при этом зоны сильно удерживаемых соединений сужались и давали более узкие и симметричные пики. Когда эффективность колонок была повышена, популярность градиентного элюирования несколько уменьшилась, однако для многих объектов до настоящего времени это единственно приемлемый вариант – ВЭЖХ с градиентом растворителя, или градиентная ВЭЖХ (ГВЭЖХ).

С какими же проблемами сталкивается исследователь, переходя от изократической ВЭЖХ к градиентной? Проблем здесь несколько, и рассмотрение их целесообразно разделить на связанные с конструкцией прибора, с выбором колонки и с выбором растворителя для ГВЭЖХ.

Прибор для градиентной ВЭЖХ, как видно из самого определения, должен иметь устройство для изменения состава растворителя по заданной исследователем программе. Возможны два варианта такого устройства: создание градиента при низком давлении растворителей с подачей смеси в насос и соэдание градиента при высоком давлении, когда каждый из растворителей (сильный и слабый) подается своим насосом с переменной скоростью, так чтобы элюирующая сила смеси увеличивалась. В приборе для ГВЭЖХ, помимо обычных узлов, появляются дополнительно программатор (устройство формирования градиента), управляемые им система клапанов или второй насос (для градиента низкого и высокого давления соответственно), смеситель. Этим обусловлен первый недостаток ГВЭЖХ – приборы для нее примерно вдвое дороже, чем для изократической ВЭЖХ.

Нередко в состав системы для ГВЭЖХ приходится добавлять дорогое устройство для эффективной дегазации растворителей продуванием гелия, действием вакуума на растворитель, подаваемый через специальные полупроницаемые трубки и т.д. Это связано с тем, что при смешении плохо дегазированных растворителей всегда выделяются пузырьки, так как растворимость газа в смеси растворителей обычно отличается от суммы растворимостей в чистых растворителях. Это особенно опасно при градиенте низкого давления, так как пузырек газа, попавший в клапанную систему и в насос, полностью нарушает их работу. Наконец, в градиентной системе существует довольно заметный объем от места формирования градиента растворителя до места его поступления в колонку: обычно этот объем составляет от 1 до 3 мл или больше, поэтому состав растворителя, поступающего в колонку, отличается от того, который формируется в это же время. При работе на колонках малого диаметра (1–2 мм) и при небольших расходах растворителя (10–200 мкл/мин) это приводит к еще большим отличиям. Затруднительно гомогенное смешение сильного и слабого растворителей, поступающих в смеситель: недостаточно эффективное смешение и неоднородность потока вызывают заметное увеличение шумов, что мешает использовать чувствительные шкалы детектора. Наконец, при градиентном элюировании практически исключается использование рефрактометрического детектора, так как изменение показателя преломления при изменении состава растворителя приводит к нарушению его работы.

Выбор сорбента и колонки для ГВЭЖХ также имеет свои особенности. Прежде всего, колонка должна быстро приходить в равновесие с растворителем постоянно изменяющегося состава как в процессе градиентного элюирования, так и при возвращении к исходному составу растворителя при подготовке колонки к новому анализу. Если для старых колонок в жидкостной хроматографии, работавших однократно, градиент формировался и использовался один раз, после чего сорбент в колонке заменялся свежим, и это позволяло применять силикагель и оксид алюминия, то для ГВЭЖХ эти сорбенты не подходят, так как уравновешивание их со слабым растворителем после градиента слишком длительно. Однако современные обращенно-фазные и другие привитые сорбенты достаточно быстро приходят в равновесие с исходным растворителем после окончания градиентного элюирования, что позволяет успешно использовать их для этих целей. Время, необходимое для уравновешивания колонки, для каждого сорбента устанавливается экспериментально по достижению постоянства времени удерживания веществ, входящих в анализируемую смесь. Это время различно как для разных сорбентов, так и для разных по составу растворителей, и может колебаться от десятков до нескольких сотен минут.

Наконец, очень важно правильно выбрать растворитель и добавки для него при ГВЭЖХ. Если при изократической ВЭЖХ небольшие примеси, присутствующие в растворителе, приходят в равновесие с сорбентом и обычно не дают ложных пиков или

увеличения шумов, то в ГВЭЖХ требования к чистоте растворителей значительно более жесткие. Например, в случае обращенно-фазной ГВЭЖХ использование воды, недостаточно очищенной от органических загрязнителей, присутствующих в природной воде или привнесенных в процессе ионообменной очистки или перегонки, приводит к появлению набора интенсивных пиков, элюируемых из колонки метанольно-водным или ацетонитрильно-водным градиентом. Перегонка воды часто приводит (если аппаратура выбрана неудачно) не к уменьшению, а к увеличению количества и содержания органических загрязнителей, добавляющихся при контакте воды с недостаточно чистой аппаратурой, полимерными пробками и шлангами, смазками на органической основе и т.д. Кроме того, многие органические вещества, малолетучие сами по себе, способны легко перегоняться с водяным паром и, следовательно, загрязнять конденсат. Наиболее надежным методом очистки воды для ГВЭЖХ следует признать двукратную дистилляцию в стеклянной или кварцевой аппаратуре на шлифах, при этом на первой стадии проводится окисление примесей перманганатом калия, а на второй – обработка щелочью для удаления кислых веществ. Если после этого необходима дополнительная очистка, ее проводят пропусканием воды через колонку большого диаметра с крупным (30–100 мкм) обращенно-фазным сорбентом, используемым для препаративной работы и относительно дешевым. Хранить такую высокочистую воду желательно в темном месте в бутыли, тщательно закрытой пробкой. Вода не должна контактировать с полимерами, выделяющими в нее продукты деструкции, стабилизаторы, пластификаторы и другие загрязнители. Желательно не хранить высокочистую воду длительный срок, так как ее чистота сохраняется относительно недолго.

Другие растворители для ГВЭЖХ должны быть квалификации «для УФ-спектроскопии» или «для жидкостной хроматографии». Производство ацетонитрила и метанола, а также воды таких квалификаций освоено нашей промышленностью. При хранении, а также использовании таких растворителей всегда следует помнить о потенциальных загрязнителях и по мере возможности избегать их.

Примеси, находящиеся в метаноле или ацетонитриле, точно так же могут накапливаться на колонке и проявляться в виде пиков при градиенте. Это легко понять, если представить себе, что начальный состав растворителя органический компонент – вода 50: 50. Невымываемая таким растворителем примесь, например нафталин, может быть добавлена как в воду, так и в метанол и будет накапливаться в начале колонки одинаково независимо от компонента системы растворителей, ее содержащего (метанола или воды). Если спустя какое-то время начать градиентное элюирование, нафталин при более сильном растворителе начнет двигаться и выйдет в виде узкого пика.

Наиболее жесткие требования предъявляют к растворителю если градиент осуществляется с детектированием при длинах волн ниже 220 или 210 нм, так как в этом случае поглощают и проявляются в виде пиков многие примеси, УФ-прозрачные при 254 или 280 нм.

Единственным путем установления пригодности растворителей для ГВЭЖХ служит проверка в реальных хроматографических условиях с градиентом требуемого состава, но без введения пробы вещества (холостой градиент). Как правило, проверку проводят сначала на более грубых шкалах детектора и при длинах волн 254 или 280 нм, а при получении положительного результата переходят на более чувствительные шкалы и длины волн 220 нм и ниже. Если работа по ГВЭЖХ прервана на относительно большой срок (более недели) или один из растворителей (или оба) заменены на новые (даже той же квалификации и партии), всегда следует до начала работы с образцами создать холостой градиент для проверки работоспособности системы в целом.

Следует отметить, что многие добавки к растворителям, такие, как соли, кислоты, ион-парные и другие реагенты, способны заметно изменить свойства растворителей. Так, накопление полифосфатов в солях фосфорной кислоты, используемых для приготовления буферных растворов, приводит к существенному дрейфу при градиенте из-за сильного УФ-поглощения полифосфатов. В некоторых случаях удается уменьшить дрейф в градиентном режиме, если уравнять УФ-поглощение слабого и сильного

элюирующих растворов добавкой УФ-поглотителя, такого, как ацетон, к менее УФ-поглощающему раствору. Градиент тем легче осуществить, чем он меньше по диапазону, поэтому целесообразно менять растворитель по составу только в тех пределах, которые необходимы для разделения. Это позволяет повысить чувствительность, уменьшить дрейф нулевой линии и количество ложных пиков, а также ускорить как элюирование, так и возврат системы к исходным условиям для нового анализа.

Если при градиентном элюировании используют другой тип детектора, например флюориметрический, высокие требования к чистоте растворителей остаются, но меняется их направленность – не должно быть флюоресцирующих примесей. О пригодности растворителей для работы судят также, осуществляя холостой градиент.

В заключение отметим, что к градиентному элюированию следует прибегать только в тех случаях, когда его применение является единственным путем решения данной проблемы. Если проверка в градиентном режиме показала, что возможно использовать изократический вариант для интересующих. веществ, следует немедленно перейти к нему. Это всегда выгодно, даже в тех случаях, когда анализ разбивается на два изократичеоких, выполняемых на двух приборах с более сильным и более слабым растворителями. Более воспроизводимые результаты и возможность использовать более чувствительные шкалы, менее жесткие требования к качеству растворителя – это только некоторые из получаемых преимуществ.

Следует также отметить, что при работе в обращенно-фазном режиме с системой метанол – вода, вязкость которой не аддитивна, а меняется от 1 до 1,5 и затем до 0,6 Мпа•с при переходе от 100% воды к 100% метанола, колонка находится в неблагоприятных условиях, так как при постоянном расходе давление на колонку сначала возрастает в 1,5 раза, а затем падает в 2 раза к концу градиентного элюирования. Картина повторяется в процессе регенерации колонки, при возврате к слабому растворителю. Это сокращает срок службы колонки и затрудняет работу с колонками, содержащими мелкий сорбент (менее 5 мкм).

Литература

Barth H.G./J. Chromatogr. Sci, 1980, v. 18, No. 9, p. 409–429.

Беленький Б.Г., Мальцев В.Г. // В кн.: Прикладная хроматография. М., Наука, 1984, с. 54–64.

Энтелис С.Г., Евреинов В.В., Кузаев А.И. Реакционноспособные оли-гомеры. М, Химия, 1985.

Janca J., Kleparnik K./J. Liquid Chromatogr., 1982, v. 5, No. 2, p. 193 – 216.

Chamberlin T.A., Tulnstra H.E./Anal Chem., 1983, v. 55, No. 3, p. 428 – 432.

Shulz W.W./J. Liquid Chromatogr., 1980, v. 3, No. 7, p. 941–952.

Neff B.L., Overton J.R./J. Liquid Chromatogr., 1984, v. 7, No. 8, p. 1537–1544.

Mori S., Suzuki M./J. Liquid Chromatogr., 1984, v. 7, No. 9, p. 1841–1850.

Нефедов П.П. Канд. дис. Л., ИВС АН СССР, 1973. 150 с.

Виленчик Л. 3., Курбенин О.И., Беленький Б. Л / Высокомол. соед., 1984, т. А26, №10, с. 2223–2226.

Grubisic Z., Rempp R., Benoit Я./J. Polym. Sci., 1967, v. B5, No. 9, p. 753.

Рафиков С.Р., Будтов В.П., Монаков Ю.Б. Введение в физико-химию растворов полимеров. М., Наука, 1978. 328 с.

Samay G /Ada chim. Acad. sci. Hung., 1979, v. 102, No. 2, p. 157–164.

Dawkins J.F./Steric Exclusion Liquid Chromatography of Polymers. Chromatogr. Sci., 1984, v. 25, p. 53–116.

Kubin M./J. Liquid Chromatogr., 1984, v. 7, No. 1, p. 41–68.

Содержание

Глава 1. Газовая хроматография

Глава 2. Обращенная газовая хроматография

Глава 3. Применение обращенной газовой хроматографии

Глава 4. Современное оборудование

Литература

ГЛАВА 1. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Газовая хроматография это, прежде всего универсальный метод качественного и количественного анализа сложных смесей и способ получения отдельных компонентов в чистом виде. Газовая хроматография (ГХ) находит также широкое применение для изучения адсорбционных явлений, термодинамики растворов, фазовых переходов, в кинетике, катализе и в других областях науки.

В газохроматографическом процессе проявляются малейшие различия в физико-химических свойствах компонентов системы благодаря многократному повторению процессов распределения вещества (сорбата) между неподвижной фазой (жидкость или твердое тело, общий термин — сорбент) и подвижной фазой (газ-носитель). Положение и форма хроматографических пиков дают информацию, необходимую для полной аналитической характеристики веществ, и допускают термодинамическую трактовку. В отличие от аналитической хроматографии, в которой главной задачей является разделение хроматографических пиков с помощью оптимального выбора сорбента и условий эксперимента, при использовании метода ГХ в физической химии применяют сорбаты различного химического строения и объектом исследования является взаимодействие в системе сорбат-сорбент. Из величин сорбции получают сведения о физико-химических характеристиках твердых и жидких веществ, включая адсорбенты, катализаторы, полимеры, жидкие кристаллы и, в том числе, лекарственные препараты. В этом случае метод газовой хроматографии получил специальное название – «обращенной газовой хроматографии». В газо-жидкостной хроматографии сорбентом, как правило, является жидкость, предварительно нанесенная на инертный твердый носитель или на стенки капилляра. В современной газовой хроматографии наиболее широкое применение находят капиллярные колонки с химически привитыми жидкими фазами. При этом сорбат взаимодействует с жидкостью (неподвижной жидкой фазой), растворяясь в последней. В газо-адсорбционной хроматографии неподвижной фазой является твердое тело (получило название адсорбент). В этом случае исследуемый сорбат принято называть адсорбатом.

В хроматографе газ протекает через хроматографическую колонку с конечной скоростью и, строго говоря, в ней не успевает установиться термодинамическое равновесие. Однако при благоприятных условиях (выбор оптимальной скорости подвижной фазы, температуры, размера пор материала, размера и формы зерен сорбента, их упаковки и других условий) реальные процессы в хроматографической колонке приближаются к равновесным. Такие процессы описываются уравнениями теории равновесной хроматографии, и наблюдается хорошее совпадение результатов газохроматографического исследования и данных, полученных калориметрическими или статическими методами [3, 4].

Исключительное значение метод ГХ имеет при исследовании чрезвычайно малых количеств сорбата (нанограммы и даже пикограммы), когда другие классические статические методы практически непригодны.

ГЛАВА 2. ОБРАЩЕННАЯ ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Исследование теоретических основ процесса сорбции летучих веществ неподвижной фазой для установления корреляций между условиями процесса и параметрами получаемых пиков позволило оценить физико-химические величины, характеризующие распределение вещества между двумя фазами и силами взаимодействия компонентов пробы и жидкой фазы колонки, по данным хроматографических опытов. Предсказанное Д. Е. Мартиным в 1955 г. неаналитическое применение газовой хроматографии в настоящее время стало мощным средством развития теории сорбции, термодинамики и других областей физической химии благодаря сравнительной простоте используемой аппаратуры, универсальности метода и высокой точности получаемых результатов. Газовая хроматография широко используется и в химии высокомолекулярных соединений, в частности в тех областях, где формы ее применения являются традиционными (определение примесей в мономерах и растворителях для полимеризации, изучение летучих продуктов деструкции и др.). Случаи применения метода газовой хроматографии в химии полимеров обобщены в книге В. Г. Березкина, В. Р. Алишоева и И. Б. Немировской «Газовая хроматография в химии полимеров».

В последние годы для исследования полимеров находит применение неаналитический вариант газовой хроматографии, так называемый метод обращенной газовой хроматографии, где объектом исследования является неподвижная фаза. Термин «обращенная газовая хроматография» предложен в 1966 г. Девисом с сотрудниками и Березкиным. Поскольку в обращенной газовой хроматографии используются непосредственное взаимодействие стандартных хроматогра-фируемых летучих соединений с исследуемой полимерной фазой и установление определенных связей между характеристиками этих летучих соединений со свойствами полимерной фазы, то этот метод может рассматриваться как прямой метод исследования высокомолекулярных соединений.

Метод обращенной газовой хроматографии для исследования полимеров получил развитие благодаря работам Гиллета с сотрудниками, показавшими возможность его применения для определения температур стеклования или плавления, степени кристалличности, параметров термодинамического взаимодействия Флори — Хаггинса для систем полимер — растворитель, а также для исследования кинетики кристаллизации полимеров из расплава.

Основы метода обращенной газовой хроматографии

1. Основные положения теории газовой хроматографии как метода физико-химических измерений.

В основе физико-химических измерений с помощью газовой хроматографии лежит связь между значениями определяемых величин с параметрами хроматографических зон. Так, время удерживания максимума зоны компонента является функцией его коэффициента активности или адсорбции, что позволяет определить коэффициенты активности и другие термодинамические характеристики жидких и твердых тел, используемых в качестве неподвижных фаз. Исходя из температурной зависимости удерживаемых объемов, можно найти важнейшие характеристики смешения — энтальпию и энтропию.

Основным параметром, определяемым в газовой хроматографии, является время удерживания (или удерживаемый объем) сорбата неподвижной фазой.

Время удерживания сорбата в хроматографической колонке есть функция коэффициента распределения вещества между жидкой и газовой фазами, функция коэффициентов адсорбции на поверхности газ — жидкость, газ — твердое тело и жидкость — твердое тело, величины объема колонки, занятой газом и неподвижной фазой, скорости газа-носителя, среднего давления в колонке и величиной перепада давления на входе и выходе из колонки. Под действием потока газа-носителя молекулы сорбата перемещаются вдоль колонки. Скорость этого перемещения обратно пропорциональна константе распределения их между газовой и неподвижной фазами. Количественно процесс элюирования из колонки может быть описан при кинетическом рассмотрении элементарных процессов движения молекул в колонке. Линейная скорость максимума зоны компонента в данной точке колонки. В последние годы в физической химии полимеров широкое распространение получил метод обращенной газовой хроматографии, основанный на неаналитическом применении газоадсорбционной и газожидкостной хроматографии. Термин «обращенная газовая хроматография» был предложен в 1966 г. одновременно Дэвисом с сотрудниками и В. Г. Березкиным. Название этого метода обусловлено тем, что с его помощью в отличие от классической газовой хроматографии решается «обратная» задача, т. е. исследуются свойства неподвижной фазы. Для исследования свойств неподвижных фаз полимеров этот метод начал широко применяться после выхода в свет в 1969 г’, работы Смидсрода и Гиллета [9], которые показали, что, используя его, можно непосредственно оценивать параметры термодинамического взаимодействия полимер — растворитель, такие, как коэффициенты активности, парциальные избыточные свободные энергии, энтальпии и энтропии смешения. В дальнейшем благодаря работам Гиллета с сотрудниками, показавшими, что этим методом можно вычислять температуры стеклования и плакления, степень кристалличности полимеров, исследовать кинетику кристаллизации и главным образом определять параметры термодинамического взаимодействия полимер — растворитель, методом обращенной газовой хроматографии было исследовано большое число полимеров и их растворов в низкомолекулярных растворителях. Особенно интенсивно этот метод стали использовать в последние годы для изучения термодинамических свойств смесей полимеров. Установлено, что он может успешно применяться для оценки поверхностных свойств полимеров, определения параметров растворимости, степени кристалличности смесей полимеров и сополимеров, влияния наполнителей на термодинамические свойства бинарных полимерных систем

Предложены модели для описания газохроматографических процессов при различных физических состояниях неподвижной полимерной фазы, позволившие существенно увеличить точность эксперимента и интерпретацию получаемых экспериментальных данных, например при оценке температур стеклования, степени кристалличности, параметров термодинамического взаимодействия в системах полимер — растворитель, полимер — полимер и др. Поскольку значительная часть этих сведений приведена в основном в оригинальных публикациях, а в последние годы метод обращенной газовой хроматографии из-за простоты и доступности находит все большее применение при исследовании полимер.

ГЛАВА 3. ПРИМЕНЕНИЕ ОБРАЩЕННОЙ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

О методиках исследования взаимодействия волокнообразующих пеков с органическими растворителями методом обращенной газовой хроматографии

Метод обращенной газовой хроматографии (ОГХ) используется для определения температур фазовых переходов, степени кристалличности полимеров и термодинамических параметров взаимодействия «полимер-растворитель», а также для исследования кинетики кристаллизации из расплава [1,2]. Знание аналогичных характеристик для волокнообразующих пеков, коксов и промежуточных карбонизующихся масс, образующихся в процессах пеко — и коксообразования, представляет научный и практический интерес [3].

Эффективность применения ЭДОСа для модификации водно — дисперсионных материалов Общим направлением технического прогресса в настоящее время является переход на энергосберегающие технологии и ужесточение требований к защите окружающей среды. Одним из эффективных путей решения указанных проблем в строительстве является расширение применения вододисперсионных клеящих и лакокрасочных полимерных материалов. [1, 2]. Они отличаются экологической полноценностью, экономичностью и высокой пожаростойкостью. При использовании вододисперсионных клеев и красок снижаются капитальные затраты на вентиляцию, значительно облегчается очистка сточных вод, не происходит загрязнения окружающей среды парами органических растворителей, улучшаются санитарно-гигиенические условия применения.

В то же время вододисперсионные материалы отличает невысокая устойчивость в процессе хранения и эксплуатации из-за возможности образования коагулюма [З]. Этого недостатка не лишены как поливинилацетатные водные дисперсии (ПВАД), так и латексы на основе синтетических каучуков.

Существующий ассортимент промышленных пластификаторов ПВАД ограничен дорогостоящими и высокотоксичными эфирами фталевой кислоты, которые водонерастворимы и трудно совмещаются с водными дисперсиями, а в составе латексных композиций полярные пластификаторы вообще практически не используются. Это делает перспективным применение в рецептурах вододисперсионных материалов пластификатора ЭДОС, отличающегося поверхностной активностью и водорастворимостью [5].

Этот пластификатор представляет собой смесь производных 1,3 диоксана, основным компонентом которого является симметричный формаль 4 метил -4 гидроксиэтил -1,3 диоксана [б].

Установлено [5], что с ростом содержания гидроксильных групп в ЭДОСе, растворимость его в воде и водных растворах неиногенных ПАВ уменьшается, а в водных растворах анионактивных эмульгаторов — увеличивается. Традиционный пластификатор ПВАД — дибутилфталат (ДБФ) характеризуется низкой растворимостью во всех исследованных водных средах. В то же время, коллоидная растворимость ЭДОСа (солюбилизация) закономерно растет с увеличением концентрации в нем гидроксилсо держащих компонентов [7]. Хорошая водорастворимость ЭДОСа позволяет исследовать его свойства по стандартным для ПАВ методикам [5]. Поверхностную активность ПАВ, согласно литературным данным [8], оценивают по изотерме поверхностного натяжения (ПН), т.е. зависимости ПН раствора от его концентрации. Кроме того, изотермы поверхностного натяжения дают информацию о способности ПАВ к мицеллобразованию и энергии адсорбции.

Изучение пластификатора ЭДОС с этих позиций показало [9], что его поверхностное натяжение экстремально зависит от содержания гидроксильных групп. Независимо от компонентного состава ЭДОС характеризуется критической концентрацией мицеллобразования, т. е. ведет себя как мицеллобразующий ПАВ [7]. Изотерма поверхностного натяжения ЭДОСа имеет один перегиб, характерный для неионогенных ПАВ с полярными группами [8]. По величине предельной адсорбции ЭДОС приближается к известным эмульгаторам анионактивного и неионогенного типа [5, 7].

Таким образом, для ЭДОСа, как и для ПАВ, характерны следующие свойства:

способность понижать поверхностное или межфазное натяжение, вследствие адсорбции и ориентации молекул на границе раздела;

низкая концентрация молекулярно растворенного вещества;

наличие критической концентрации мицеллобразования, выше которой в его растворах происходит выделение новой фазы и образуются агрегаты молекул-мицеллы;

способность мицелл растворять водонерастворимые вещества, которая известна под названием солюбилизации или коллоидного растворения;

достаточно высокая предельная адсорбция;

дифильность молекул, состоящих из гидрофильной и гидрофобной частей;

способность адсорбироваться на поверхности латексных частиц, увеличивая их агрегативную устойчивость.

Достаточно высокая поверхностная активность ЭДОСа на границах раздела фаз приводит к тому, что размеры частиц пластифицированных им дисперсий и латексов закономерно возрастают с ростом содержания пластификатора. Это повышает устойчивость к внешним механическим воздействиям в процессе получения, транспортировании и применения во до дисперсионных клеев и красок.

На это указывает, в частности, уменьшение количества коагулюма, образующегося в течении 5 минут обработки ПВА дисперсии в приборе Марона, при увеличении содержания ЭДОСа.

В тоже время, при росте концентрации ДБФ выше 10 масс. % содержание коагулюма растет, т. е. устойчивость ПВАД с этим пластификатором ниже, чем с ЭДОСом.

При пластификации ЭДОСом имеет место существенное снижение величины поверхностного натяжения ПВАД, а также бутадиен-винилиденхлоридного (ДВХБ-70), бутадиен — стирольного и др. латексов. При применении ДБФ такого эффекта не наблюдается (рис. 2)

ЭДОС аналогично ДБФ снижает температуру стеклования ПВАД, однако его пластифицирующий эффект ниже, в то время как клеящая способность дисперсии с этим пластификатором значительно выше (рис 3).Это связано с наличием у ЭДОСа гидроксилсодержащих компонентов — диоксановых спиртов. С ростом их содержания адгезионные свойства пластифицированной ПВАД улучшаются, а температура стеклования ее растет [9].

Описанные закономерности обусловлены влиянием состава многокомпонентного пластификатора ЭДОС на его полярность. Так, методом обращенной газовой хроматографии (ОГХ) установлено [9], что ЭДОС является более полярным пластификатором, чем ДБФ, на что указывают более высокие значения практически всех его условных хроматографических факторов полярности [10]. Наличие в молекулах ЭДОСа кислородсодержащих гидроксильных и эфирных групп обуславливает его склонность к образованию водородных и донорно-акцепторных связей [9]. Полярность этого пластификатора закономерно растет с увеличением содержания гидроксильных групп.Это особенно заметно проявляется для водородных связей. С этим, очевидно, и связано увеличение клеющей способности ПВАД с ростом концентрации в составе ЭДОСа гидроксилсодержащих компонентов.

Таким образом, ЭДОС является полифункциональным модификатором клеящих и лакокрасочных материалов, выполняющим одновременно функции неионогенного мицеллообразующего ПАВ, структурного пластификатора и адгезионно-активной добавки. ЭДОС обладает следующими преимуществами для вододисперсионных материалов:

коллоидной растворимостью в воде, что обуславливает снижение времени пластификации и уменьшение трудо- и энергозатрат при производстве;

поверхностной активностью, что уменьшает поверхностное натяжение на границах раздела фаз полимер-вода и повышает устойчивость водных дисперсий и латексов в процессе хранения и экспплуатации;

адгезионно — активными свойствами и склонностью к образованию водородных и донорно-акцепторных связей, что увеличивает клеящую способность дисперсий и латексов;

пониженной стоимостью и токсичностью, что улучшает санитарно-гигиенические и экономические показатели вододисперсионных отделочных материалов;

способностью облегчать коалесценцию латексных частиц при пленкообразовании, что увеличивает эластичность клеев и покрытий;

многокомпонентностью состава, что позволяет регулировать в широких пределах его пластифицирующие свойства;

использованием в качестве сырья крупнотоннажных отходов химических производств, что способствует охране окружающей среды.

Изостерические хроматографические характеристики удерживания н-алканов и спиртов на хитозанах различной молекулярной массы

Хитозаны как сорбенты являются носителями химически и геометрически неоднородного сорбционного поля. По своей химической природе — это полисахарид, несущий у второго атома углерода глюкопиранозного кольца аминогруппу. Хитозан растворяется в водных растворах кислот за счет образования солей аминогруппами с молекулами кислот. Кроме того в струкуре хитозана присутствуют полуацетальные концевые гидроксилы, гидроксилы пиранозного кольца, остаточные ацетильные группы. Химическая неоднородность этого материала увеличивается за счет остаточных количеств минеральных кислот, белков и значительного количества структурной и сортированной воды [1].

Обращенная газовая хроматография — вариант газовой хроматографии, адаптированный к изучению таких объектов.

В качестве сорбатов используют низкомолеку лярные вещества с различной электронной конфигурацией молекул, дающих дифференцированный хроматографический отклик на сорбционные фрагменты различной природы. Из-за неднородности сорбционного поля с изменением концентрации сорбата в полимере изменяется количественный и качественный состав активных центров, участвующих в процессе сорбции, и результирующая характеристика удерживания определяется их статистической комбинацией. В работе использовали вариант ращенной газовой хроматографии, позволяющий получать величины хроматографических характеристик удерживания сорбатов, отнесенные к определенной их концентрации в сорбенте. [2]. Как сорбаты использовали гомологи нормальных алканов и нормальных предельных одноатомных спиртов.

Изучены хитозаны, выделенные из панцирей криля (Х-550), производство «Севрыба», г. Мурманск, и панцирей крабов (Х-60), производство ВНИИТИБП, г. Щелково. Число в шифре — ММ , Кда полимера. Влажность образцов составляла 9,3 и 10,0% мае, соответственно, и степень дезацетилирования была 0,87. Для хроматографических исследований хитозан наносили из 2,3 и 0,8% мас растворов в 1-2% мас уксусной кислоте на зерна инертного носителя Inerton Super при непрерывном перемешивании и удалении растворителя. Далее образцы досушивали на воздухе и кондиционировали в колонке хроматографа в токе газа­носителя гелия при температуре 323К втечение 8 час. Исследовали кондиционированные образцы (Х-550 и Х-60) и термообработанные в колонке прибора при 393К в токе гелия втечение 8 час ( Х-550-120 и Х-60-120, соответственно ).

ГЛАВА 4. СОВРЕМЕННОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

Автоматизированный газовый хроматограф TRACE GC ULTRA вобрал в себя почти сорокалетний опыт разработки и производства такого рода аналитических приборов. Простота в использовании и высочайшее качество за разумную цену вот что делает TRACE GC ULTRA прекрасным выбором для Вашей лаборатории.

Основные особенности хроматографа TRACE GC ULTRA:

• ультрастабильный, малоинерционный термостат с рекордными характеристиками; • нагрев от 50°С до 450°С — за 420 секунд;

• охлаждение от 450°С до 50° — за 250 секунд; • дополнительный термостат для кранов и клапанов позволяет создавать самые сложные схемы, например, при анализе нефтезаводских газов; • автоматическое определение характеристик колонки, что дает возможность поддерживать аналитические условия неизменно оптимальными, даже при старении колонки; • поиск утечек по каналу газа-носителя — нажатием одной кнопки; • уникальная конструкция блоков инжектора и детектора делает их легкозаменяемыми;

• программное обеспечение ChromQuest реализует концепции “Открытой лаборатории” и позволяет объединять в единый комплекс приборы разных типов и разных производителей.

Типичные области применения газовой хроматографии применительно к контролю качества нефтепродуктов:

• Имитированная дистилляция нефтей и нефтяных фракций по методам ASTM D5307 и D 2887

• Определение бензола и толуола в моторном топливе по ASTM D 3606 • Определение бензола в бензине по методу EN 12177 • Определение оксигенатов в бензинах по ASTM D 4815 и EN 13132 • Определение ароматических соединений в топливе по ASTM D 5580 • Анализ МТБЭ по ASTM D 5441

• Анализ оксигенатов в бензинах по ASTM D 5599 • Полный компонентный состав бензинов (PIONA анализ)

• Анализ компонентного состава природных, нефтезаводских и дымовых газов и многие другие.

TRACE GC — газовый хроматограф высочайшего качества может стать достойнейшим приобретением для Вашей лаборатории. Этот замечательный по дизайну и модульной конструкции прибор специально создан для того, чтобы с ним было просто обращаться и при этом обеспечивать высочайший уровень автоматизации и производительности при относительно невысокой стоимости. Газовый хроматограф TRACE обеспечивает великолепные характеристики при нагреве и охлаждении термостата, а также высочайшую стабильность температур. Патентованный «on-column» (с вводом пробыы непосредственно в колонку) позволяет без проблем работать с термолабильными соединениями избегая их деструкции и дискриминации компонентов образца. Он также обеспечивает работу высоко-объемного испарителя (LVI) Ultra-TRACE, основанного на методике ввода больших объемов пробы, снижая порог обнаружения на два порядка по величине, сокращая время анализа и упрощая подготовку пробы. Широкий выбор модульных устройств и автоматические устройства пробоподготовки и ввода образца значительно повышают производительность анализа и снижают его стоимость. Широкий выбор быстросменяемых ионизационных детекторов позволяет практически моментально приспосабливать этот газовый хроматограф к широчайшему кругу его возможных применений, избавляя пользователя от необходимости иметь в лаборатории множество приборов для различных применений.

Портативный газовый хроматограф Agilent 3000 Micro GC

Габариты и вес

1-канальный или 2-канальный Agilent 3000 Micro GC (NGA) весит 5,2 кг и имеет габариты 15 см (высота) х 25 см (ширина) х 36 (см)глубина.

Требования к окружающей среде

Диапазон рабочих температур от 0 до 50 оС

Относительная влажность: до 95% (без конденсации влаги)

 Высотность: до 4 600 м над уровнем моря

 Эксплуатация: в помещении или вне помещения (после заключения в специальный защитный корпус)

Отбор образцов

Отбираемые образцы представляют собой смеси газов;

 Максимальное давление образца: 2,1 атм;

Рекомендуемое давление образца: 0,35 — 0,7 атм.

Устройства для введения образца

Электромеханические микроустройства, сделанные из инертных материалов.

Тип вводящего образцы устройства:

Нагреваемое; вводящее неизменный объем 1,6 мкл

Возможна установка узла ввода проб изменяемого объема (от 1 до 10 мкл)

Всасывание образца обеспечивается встроенным вакуумным насосом

Подводка образца через переходник, размещенный на стенке прибора (переходник под трубку с диаметром 1/16 дюйма [1,6 мм], изготовленный из нержавеющей стали и оснащенный фильтром с размером пор 5 мкм

Разделяющие образец колонки

OV-1 (от 4 до 8 м Ч 0,15 мм Ч от 1,2 до 2,0 мкм)

PLOT U (от 4 до 8 м Ч0,32 мм)

MOLSIEV 5A PLOT (10 м Ч 0,32 мм)

PLOT Q (8 м Ч0,32 мм)

StabilWax DB (10 м Ч 0,25 мм Ч 0,5 мкм)

OV-1701 (8 м Ч 0,1 мм Ч 0,5 мкм)

Детектор

Катарометр (TCD)

Внутренний объем 240 нл

В катарометре используется измерительная мостиковая схема

Минимальный уровень обнаружения

Зависит от вещества, матрицы образца и помех. Обычно от 10 до 20 мг/л. Этот диапазон не соответствует тем веществам, которые способны вступать в химическую реакцию (например, соединениям серы).

Линейный динамический диапазон 106 ± 10%

Погрешность измерений

Обычно, относительное стандартное отклонение < 1% при постоянных температуре и давлении (для C1- C6 при содержании на уровне единиц %)

Нагрев колонок

Работа при неизменной температуре от 40 до 180 °C

Газ-носитель

Газ-носитель (подводится через соединитель типа Swagelok® под трубку с диаметром 1/8 дюйма (3,2 мм)

Входное давление: не менее 5,6± 0,14 атм (по показанию манометра)

Электропитание

К блоку питания подводится переменное напряжение 220 В (50 Гц);

Потребляемая мощность 70 Вт

С выхода блока питания снимается постоянное напряжение 12 В; 3,68 А (70 Вт)

Разъемы для связи

Для подключения к сети LAN (для управления работой прибора и сбором данных)

Переходное устройство для подготовки образца

Нагреваемый регулятор (входной). Снижает давление подводимого образца, регулирует его температуру, удаляет капельки жидкости и посторонние частицы. Дает возможность анализировать потоки образцов, в которых концентрация веществ с числом атомов углерода свыше С5 оказывается не более 0,5 мольных %

Оснащен быстро стыкующими разъемами .

Оснащен пористым фильтром из нержавеющей стали с размером пор 7 мкм.

Условия эксплуатации

Температура подводимого потока образца: до 120°C

Выдерживает давление подводимого потока образца: от 14 до 5500 кПа (0,14 . 56,24 атм по показанию манометра).

Компанией ИНТЕРЛАБ разработано готовое решение для анализа компонентного состава природного газа на базе трехканальной модификации газового хроматографа серии Agilent 3000 MicroGC в соответствии с действующим российским стандартом ГОСТ 23781 — «Газы горючие природные. Хроматографический метод определения компонентного состава».

Стандартная конфигурация включает в себя три хроматографических канала:

Колонка PLOT U для определения углеводородов С1-С3 и углекислого газа

Колонка OV-1 для определения углеводородов С4-С6+ с возможностью детального хроматографического анализа до С10

Колонка Molsieve 5A с предколонкой PLOT U для раздельного определения кислорода, азота и гелия.

Общее время анализа не превышает 200 секунд.

Литература

Верхоланцев В. В. Водные краски на основе синтетических полимеров. Л., Химия, 1968, 150 с.

Богомолова В. П. Новые лакокрасочные материалы на водной основе. М, Химия, 1983.

Калаус Э.Э., Рыжов ВА. Новые вододисперсионные лакокрасочные материалы. Л, Химия, 1981,27 с.

Кузьмичев В.И., Абрамян Р.К., Чагин М.П. Водорастворимые пленкообразователи и лакокрасочные материалы на их основе. М., 1986, 33 с.

Готлиб Е.М., Коптун Э.Е., Аверко-Антонович И.Ю. Применение пластификатора ЭДОС для водных дисперсий полимеров. Каучук и Резина, 1999, № 5, с. 5-8

Готлиб Е.М., Верижников Л.П., Гринберг Л.П. и др. Способ получения пластификатора для ПВХ-композиций. Патент РФ № 2138497, 2000 г.

Готлиб Д.М., Соколова А.Г., Аверко-Антонович И.Ю. Коллоидно-химические свойства пластификатора для воднодисперсионных материалов. Сборник трудов «Экология и ресурсосбережение в материаловедении», Новосибирск ООО, с. 74-77

Шевердяев О.П., Белов Л.С., Шкитов А.М. Поверхностно-активные вещества. М., ВЗПИ, 1992, 172 с.

Готлиб Д.М. Модифицированные ЭДОСом вододисперсионные лакокрасочные и клеющие материалы на основе поливинилацетата. Автореферат диссертации к. т. н., Пенза, 2001, 23 с.

Готлиб ЕМ, Бабенко ЕВ., Муратова Г Я., Соколова ЮА. Применение обращенной газовой хроматографии для оптимизации рецептур эпоксидных материалов, Москва, 1998, 33 с.

Котельникова ТА., Агеев Е. Л., Смирнов М.А., Вихорева Г.А. Изостерические Хроматографические характеристики удерживания н-алканов и спиртов на хитозанах различной молекулярной массы