Этот файл взят из коллекции Medinfo http://www.doktor.ru/medinfo http://medinfo.home.ml.org
E-mail: medinfo@mail.admiral.ru or medreferats@usa.net or pazufu@altern.org
FidoNet 2:5030/434 Andrey Novicov
Пишем рефераты на заказ - e-mail: medinfo@mail.admiral.ru
В Medinfo для вас самая большая русская коллекция медицинских рефератов, историй болезни, литературы, обучающих программ, тестов.
Заходите на http://www.doktor.ru - Русский медицинский сервер для всех!
ВВЕДЕНИЕ
Если век Х1Х по-праву вошел в историю мировой цивилиза- ции, как Век Физики, то стремительно завершающемуся веку ХХ, в котором нам посчастливилось жить, по всей вероятности, уго- товано место Века Биологии, а может быть и Века Генетики.
Действительно, за неполных 100 лет после вторичного открытия законов Г. Менделя генетика прошла триумфальный путь от на- турфилософского понимания законов наследствености и изменчи- вости, через экспериментальное накопление фактов формальной генетики к молекулярно-биологическому пониманию сущности ге- на, его структуры и функции. От теоретических построений о гене как абстрактной единице наследственности к пониманию его материальной природы как фрагмента молекулы ДНК, кодирующей аминокислотную структуру белка, до клонирования индивидуаль- ных генов, создания подробных генетических карт человека и животных, идентификации генов, мутации которых сопряжены с тяжелыми наследственными недугами, разработки методов биотех- нологии и генной инженерии, позволяющих направленно получать организмы с заданными наследственными признаками, а также проводить направленную коррекцию мутантных генов человека, то есть генотерапию наследственных заболеваний. Молекулярная ге- нетика значительно углубила наши представления о сущности жизни, эволюции живой природы, структурно-функциональных ме- ханизмах регуляции индивидуального развития. Благодаря её успехам начато решение глобальных проблем человечества, свя- занных с охраной его генофонда.
Естественно, что возможность манипуляции с индивидуаль- ными генами человека и животных еще недостаточна для понима- ния функции всего генома, его организации вцелом, взаимо- действия его частей в обеспечении всего многообразия механиз- мов онтогенеза, то есть развития одной клетки до целого орга- низма. Если добавить к этому, что в геноме любого вида за- писана не только программа индивидуального развития, но зако- дирована и вся эволюция вида, то есть его филогенез, стано- вится понятным насколько логичной и методически своевременной явилась Международная научная программа "Геном человека". На- ряду с аналогичными программами для других видов (лаборатор- ные мыши, нематоды) программа Геном человека, начатая около
10 лет назад, уже к 2 000 году позволит полностью расшифро- вать первичную структуру ДНК, то есть идентифицировать все гены человека, их регуляторные элементы. Захватыающая Одиссея о наследственности, которой и является эта программа, безмер- но расширит наши представления о структуре и функции генома, его эволюции, откроет горизонты столь увлекательного, а, воз- можно, и не менее опасного направленного воздействия человека на геном растений, животных и, что особенно рискованно, на свой собственный геном. Важно осознать, что это не завтрешний день фундаментальной науки, не отдаленные абстракции, но день сегоднешний. Он уже наступил и стал реальным независимо от нас, и, если не быть к нему готовым концептуально и методи- чески, то пройдет помимо нас.
Предлгаемая вашему вниманию книга, действительно, представляет собой введение в молекулярную генетику наследственных болезней и рассчитана на достаточно широкую аудиторию медиков и биологов. Для большинства из уже состояв- шихся специалистов в этих областях - это реальная возможность для самообразования, которой, увы, с годами мы так часто пре- небрегаем, запутавшись в повседневных заботах. Для студентов биофаков и особенно для студентов-медиков - эта книга вполне может рассматриваться в качестве учебного пособия по молеку- лярным основам медицинской генетики. Однако, и для первых и для вторых, по глубокому убеждению авторов, много лет отдав- ших внедрению достижений молекулярной биологии в медицинскуюя практику, книга может служить в качестве справочного руко- водства по молекулярной генетике человека. Действительно, ни одна клиническая дисциплина (за исключением, может быть, службы организации здравоохранения) не мыслима сегодня без знаний и определенных навыков по молекулярной генетике. Ни один биолог, занятый вопросами наследственности, изменчи- вости, онтогенеза или эволюции независимо от конкретного био- логического объекта, не может игнорировать человека, как од- ного из пока немногих биологических видов с полностью расшифрованной структурой генома. Быстро набирающая силы мо- лекулярная медицина, преподование азов которой все еще явно недостаточно для будущих врачей, на самом деле представляет собой принципиально новый качественный уровень в понимании вопросов этиологии, патогенеза, а, следовательно, и лечения многих болезней, как наследственной моногенной, так и муль- тифакториальной природы.
По нашему мнению, не только современный врач и специа- лист-биолог, но и каждый образованный человек сегодня должен знать о триумфе Международного Научного Сообщества в выполне- нии программы Геном человека, в результате которой успешно расшифровываются все гены человека, каждый из которых, будучи выделенным из организма и проклонированным может выступать в качестве лечебного препарата для генотерапии. О том, что уже сегодня идентифицировано на генетических картах более 5 000 структурных генов и свыше 60 000 пока неизвестных смысловых и анонимных ДНК последовательностей. О том, что всего за 5 лет после первых успешных попыток введения чужеродных маркерных генов в клетки человека in vivo, число уже одобренных для клинических испытаний программ по генной терапии наследствен- ных заболеваний достигло более 100! Эти итоги представляются особенно впечетляющими если учесть, что согласно данным Все- мирной Организации Здравоохранения около 2,4% всех новорож- денных на земном шаре страдает теми или иными наследственными нарушениями; около 40% ранней младенческой смертности и инва- лидности с детства обусловлены наследственной патологи- ей. Нельзя не упомянуть о реальных достижениях молекулярной генетики в расшифровке наследственных факторов таких бичей человечества как ишемия сердца, атеросклероз, диабет, онколо- гические и инфекционные заболевания. Адекватно воспринимать происходящую на наших глазах революцию в биологии и в медици- не, уметь воспользоваться её заманчивыми плодами и избежать опасных для человечества соблазнов - вот что необходимо се- годня и врачам, и биологам, и представителям других смежных специальностей, и просто образованному человеку.
Именно эта цель, эта сверхзадача, поставлена перед дан- ной монографией, восполняющей, по мнению авторов, наметив- шийся в отечественной научной литературе пробел в области мо- лекулярных аспектов медицинской генетики и генетики человека.
Отдельные обзоры, монографии (Шишкин, Калинин, 1993), пере- водная литература по молекулярной биологии и даже обстоятель- ные сводки, подводящие ежегодные итоги работ по программе
"Геном человека" достаточно фрагментарны и касаются лишь от- дельных аспектов проблем генодиагностики и генотера- пии. Рассчитаны преимущественно на специалистов по молекуляр- ной биологии. Задача данной монографии не только осветить современное положение дел в молекулярной диагностике и лече- нии наследственных болезней методами генной терапии, но, главным образом, подготовить читателей, прежде всего врачей и биологов, к пониманию и восприятию этой методически и концеп- туально достаточно сложной обасти генетики.
Для достижения поставленной цели нам представлялось ло- гичным начать изложение материала с описания структуры и сов- ременных методов анализа ДНК, с общих представлений о её кло- нировании, секвенировании, геномных библитеках (Глава I).
Глава II полностью посвящена структуре генома человека, новой трактовке понятия "ген", генным семействам, вариабильным структурам генома. Генетические карты, принципы их построе- ния, функциональное и позиционное картирование, молекулярные маркеры, современные достижения в разработке физических и хромосомных карт человека и в картировании генов, ответствен- ных за наследственные заболевания рассмотрены в Главе III.
Глава IV целиком посвящена описанию молекулярных методов де- текции как уже известных мутационных изменений в структурных генах, так и методов сканирования предполагаемых мутаций оп- ределенных генов. Описание прямых методов идентификации му- таций дополнены косвенными методами, основанными на молеку- лярном маркировании мутантных генов. Все эти методы, как прямые, так и косвенные, составляют основу молекулярной ди- агностики моногенных наследственных болезней, широко исполь- зуются в генетике человека при построении генетических карт, исследовании проблем филогенеза, в популяционной гентике и в геномной дактилоскопии, то есть для идентификации личности.
Подробному анализу внутренних (эндогенных) факторов мутаге- неза, а также принципам популяционного анализа мутаций посвящена Главе Y. Основные подходы, используемые при изуче- нии экспрессии генов в модельных бесклеточных системах, на уровне отдельных клеток и целых организмов приведены в Главе
VI. Принципы молекулярной диагностики наследственных болез- ней и, в частности, пренатальной диагностики, а также осо- бенности выявления гетерозиготного носительства в семьях выского риска, изложены в Главе VII. Небольшая по размеру, но важная также и для понимания принципов генной терапии
Глава VIII касается искусственного создания генетических мо- делей наследственных заболеваний, в частности на базе трансгенных живоных. Описаны используемые при этом методы направленного переноса чужеродных генов в эукариотические системы. В Главе IX изложены основы генотерапии наследствен- ных заболеваний, рассмотрены методы доставки чужеродной ДНК в клетки человека in vitro и in vivo, преимущества и не- достатки существующих векторных систем (физических, хими- ческих и биологических), их конструирование, преспективы создания "идеальных" векторных систем. Кратко рассмотрены итоги уже проведенных испытаний по генотерапии тех заболева- ний, для которых Программы клинических испытаний уже одобре- ны или находятся на стадии эксперимента. В заключительной главе (Глава X) мы посчитали целесообразным подвести некото- рые итоги и более подробно рассмотреть молекулярную диаг- ностику трех групп наследственных заболеваний: (1) достаточ- но полно изученную группу лизосомных болезней накопления;
(2) болезни экспансии (преимущественно нейродегенеративные заболевания), вызываемые совершенно новым ранее неизвестным типом так называемых "динамических" мутаций и (3) наиболее частые, социально значимые наследственные заболевания, по пренатальной диагностике которых молекулярными методами уже накоплен достаточно большой опыт в нашей лаборатории и в других медико-генетических центрах России.
Итак, предлагаемая монография рассчитана на достаточно широкий круг читателей, но, прежде всего, на медиков и биоло- гов, а также специалистов смежных профессий. Нам хотелось бы думать, что книга будет особенно полезной для студентов меди- цинских институтов и академий, врачей курсов повышения квали- фикации, сотрудников медико-генетических консультаций и цент- ров, а также для студетнов-биологов, многие из которых, как показывает наш опыт, пополняют ряды специализированных диаг- ностических лабораторий, медико-генетических центров и инсти- тутов.
ГЛАВА III
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ, ПОЗИЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ.
Раздел 3.1 Классификация генетических карт, оценка сцепления.
Генетические карты определяют хромосомную принадлеж- ность и взаимное расположение различных компонентов генома относительно друг друга. Возможность построения таких карт обусловлена двумя фундаментальными характеристиками генома: линейным характером локализации генов в хромосомах (это оп- ределяется линейностью молекулы ДНК) и относительной ста- бильностью расположения облигатных элементов генома в преде- лах вида. При построении генетических карт используют разные подходы. В первую очередь, к ним относятся анализ генети- ческого сцепления на основе определения частот мейотической рекомбинации в информативных семьях и изучение особенностей наследования признаков, сцепленных с маркерными хромосомными перестройками. Во-вторых, исследование экспрессии генов или поиск специфических последовательностей ДНК в клеточных гиб- ридах, содержащих лишь часть генома человека - одну или несколько хромосом или их фрагменты. В ряде случаев с этой целью используют механический сортинг целых хромосом и даже их относительно небольших участковв. Эти приемы позволяют привязать картируемый ген к определенной хромосоме и даже к определенному фрагменту хромосомы. С помощью комплекса весь- ма тонких методов хромосомного анализа, прежде всего, мето- дов гибридизации in situ (см. Главу I) удается картировать отдельные гены на хромосомах человека часто с точностью до одного бэнда. И, наконец, методами молекулярного анализа осуществляют физическое картирование последовательностей
ДНК, локализованных в специфических участках хромосом. Затем проводят идентификацию в этих последовательностях транскри- бируемых областей, то есть генов, с последующей изоляцией и клонированием соответствующих им полноразмерных молекул кДНК. Каждый из рассмотренных этапов анализа структуры гено- ма завершается построением карт генов, различающихся по еди- ницам измерения расстояний между отдельными элементами этих карт, масштабам, по насыщенности или степени детализации на различных участках генома. Соответственно различают карты сцепления, генетические карты, цитогенетические карты инди- видуальных хромосом и физические или молекулярные карты оп- ределенных участков ДНК. Для полной молекулярной идентифика- ции отдельных элементов генома, то есть определения их гра- ниц, структуры и нуклеотидной последовательности, необходимо совмещение всех типов карт в местах локализации этих элемен- тов.
Первым шагом на пути построения генетических карт явля- ется формирование групп сцепления генов, контролирующих различные наследственные признаки, и исследование их взаим- ного расположения в этих группах. На следующем этапе опре- деляют соответствие между генетическими группами сцепления и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами или их фрагментами. Цитогенетическую идентификацию хромосом прово- дят с использованием методов дифференциальной окраски
(см.раздел 3.2). По мере появления все большего числа лока- лизованных признаков эффективность построения генетических карт значительно возрастает, так как увеличивается число маркированных участков хромосом и, таким образом, появля- ется возможность комбинированного использования различных экспериментальных подходов для более подробного исследова- ния этих участков.
Принципиальная схема картирования неизвестных генов, представленная на Рис.3.1, включает следующие этапы. 1. Вы- яснение группы сцепления; 2. Поиск ближайших фланкирующих маркеров; 3. Определение физической области (ДНК-последова- тельности), включающей искомый ген; 4. Клонирование набора фрагментов ДНК, перекрывающих исследуемую область; 5. Выде- ление из этого набора клонов, содержащих транскрибируемые
ДНК-последовательности, предположительно соответствующие гену или его фрагменту; 6. Анализ специфических мРНК и кло- нирование кДНК-последовательности; 7. Секвенирование и идентификация самого гена (Wicking, Williamson, 1991).
Рассмотрим подробнее эту схему.
Построение карт сцепления основано на изучении про- цессов расхождения и рекомбинации гомологичных хромосом в мейозе. Генетические признаки, локализованные в разных хро- мосомах, не сцеплены друг с другом, то есть передаются от родителей детям независимо, и частота их рекомбинации (Q) составляет 0.5. Это обусловлено случайным характером расхождения гомологичных хромосом в мейозе во время редук- ционного деления. Гены, локализованные в одной хромосоме, рекомбинируют за счет кроссинговера, то есть за счет обмена участками гомологичных хромосом в процессе их спаривания в мейозе (Рис.3.2). При этом порядок генов не нарушается, но в потомстве могут появиться новые комбинации родительских аллелей. Вероятность кроссинговера между двумя генами за- висит от расстояния между ними. Чем ближе гены расположены друг к другу, то есть чем больше они сцеплены, тем эта ве- роятность меньше.
Оценку сцепления между генами проводят на основании статистического анализа сегрегации признаков в семьях с разветвленными родословными. Чаще всего при этом используют метод максимального правдоподобия (Kao, 1983), то есть подсчитывают десятичный логарифм шансов - lod (log of the odds), где шансы (odds) выражаются как отношение вероят- ности наблюдаемой родословной при условии, что два гена сцеплены (0 < Q < 0.5), к той же вероятности при отсутствии сцепления (Q = 0.5). Если значение lod > +3, гены локализо- ваны в одной хромосоме, причем максимально правдоподобная оценка соответствует максимальному значению lod. При значе- ниях lod < -2 гены не сцеплены, то есть локализованы в раз- ных хромосомах или на разных концах одной хромосомы. Ста- тистическую обработку родословных обычно проводят с помощью компьютерных программ, наиболее известные из которых прог- раммы LIPED, CRIMAP и LINKAGE (Ott, 1985; Ott, 1991;
Terwilliger, Ott, 1994). На генетических картах сцепления расстояние между генами определяется в сантиморганах (сМ).
1 сМ соответствует 1% рекомбинации. Общая длина генома че- ловека в этих единицах составляет около 3300 сМ. Сопостав- ляя эту величину с размером гаплоидного набора молекул ДНК, можно заключить, что 1 сМ приблизительно эквивалентен 1 миллиону пар нуклеотидов. Такие расчеты, однако, весьма приблизительны, так как частоты рекомбинации, а значит и реальная длина одного сМ, могут сильно варьировать в раз- личных частях генома. Существуют, так называемые, горячие точки рекомбинации, также как и районы генома, где рекомби- нация подавлена (центромерные и теломерные участки хро- мосом, блоки конститутивного гетерохроматина и др.). Из- вестно также, что частота рекомбинации у мужчин меньше, чем у женщин, так что общая длина мужского генома, измеренная в единицах рекомбинации, составляет лишь 3000 сМ. Таким обра- зом, генетическое расстояние может дать лишь весьма ориен- тировочную информацию о физическом (реальном) расстоянии, выражаемом в парах нуклеотидов.
Раздел 3.2 Соматическая гибридизация, цитогенетический анализ, картирование анонимных последова- тельностей ДНК.
До начала 70-ых годов построение генетических карт че- ловека продвигалось очень медленными темпами. Небольшой раз- мер семей, длительный период одного поколения, ограниченное число информативных родословных и отсутствие методов эффек- тивного цитогенетического анализа всех пар хромосом затруд- няло целенаправленное картирование генов человека. Достаточ- но сказать, что 1-й ген человека - ген цветной слепоты был картирован на Х-хромосоме в 1911г., а 1-й аутосомный ген- только в 1968г. К 1973г. на хромосомах человека было карти- ровано всего 64 гена, а к 1994 на генетических картах чело- века было локализовано уже свыше 60 000 маркерных ДНК последовательностей, в том числе около 5 000 структурных генов - Рис.3.3. Столь стремительный прогресс в картирова- нии генов человека связан с появлением новых технологий в цитогенетике, в клеточных культурах и особенно в молекуляр- ной генетике.
Техника соматической гибридизации, то есть возможность экспериментального конструирования способных к размножению межвидовых клеточных гибридов, явилась одним из наиболее мощных инструментов для нахождения связей между группами сцепления и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами и даже их отдельными сегментами. Гибридные клоны получают пу- тем искусственного слияния культивируемых соматических кле- ток разных видов, в частности, клеток человека и различных грызунов - китайского хомячка, мыши, крысы (Шея,1985).
Культивирование таких соматических гибридов, как оказалось, сопровождается утратой хромосом человека. Так были получены панели гибридных клеточных клонов, содержащих всего одну или несколько хромосом человека и полный набор хромосом другого вида. Обнаружение человеческих белков, специфи- ческих мРНК или последовательностей ДНК в таких клонах поз- воляет однозначно определить хромосомную принадлежность соответствующих генов. Таким способом удалось локализовать более 250 аутосомных генов человека (Kao, 1983).
Дальнейший прогресс в области генетического картирова- ния в значительной степени ассоциируется с деятельностью многих научно-исследовательских центров и лабораторий по созданию банков клеточных культур, представляющих наиболее интересные и обширные родословные. Так, в Центре по Изучению
Полиморфизма Человека (CEPH) (Париж, Франция) была создана уникальная коллекция перевиваемых клеточных культур от всех членов семей, многоступенчатые родословные которых насчиты- вают многие десятки и даже сотни индивидуумов (CEPH-семьи)
(Todd,1992; Weissenbach et al,1992). Перевиваемые линии кле- ток получали из первичных культур, трансфорированных вирусом
Эпштейн-Барра, после чего такие лимфобластозные клетки ста- новятся "бессмертными", то есть могут неограниченно долго поддерживаться в условиях культивирования. CEPH-семьи представляют собой идеальные системы для генетического ана- лиза наследственных признаков. В результате исследования этих клеточных линий определены генотипы членов CEPH-семей одновременно по тысячам полиморфных локусов и построены соответствующие генетические карты. Кроме того, совместными усилиями многих лабораторий мира были созданы Банки Клеточ- ных Культур, в которых поддерживаются коллекции лимфоб- ластозных линий клеток, полученных от членов наиболее инфор- мативных семей, в которых наблюдается сегрегация по различ- ным наследственным признакам, в том числе по моногенным за- болеваниям. Материал этих линий в виде клеточных клонов или образцов ДНК используется, в частности, для анализа сцепле- ния сегрегирующих генов с известными генетическими маркерами или с вновь описанными полиморфными локусами. Таким образом, во многих случаях при картировании генов человека удается преодолеть ограничения, связанные с недостатком обширных ин- формативных родословных.
Наконец, в начале 70-х годов появилась реальная возмож- ность точной идентификации не только всех хромосом в карио- типе человека, но и их отдельных сегментов. Это связанно с появлением методов дифференциального окрашивания препаратов метафазных хромосом, которые, по сути, произвели революцию в цитогенетике и хромосомологии. Для получения дифференциаль- ной окраски хромосомные препараты окрашивают некоторыми флю- орохромами, либо, после соответствующей протеолитической об- работки или нагревания, - красителем Гимза. При этом на хро- мосомах выявляется характерная поперечная исчерченность, так называемые бэнды, расположение которых специфично для каждой хромосомы. На метафазных хромосомах малой степени спирализа- ции идентифицируется около 750 таких полос, на прометафазных хромосомах 2 500 - 3 000. Следовательно, величина небольших бэндов на прометафазных хромосомах примерно соответствует 1 сМ на цитогенетических картах или 1 миллиону пар оснований на физических картах. Такие ориентировочные рассчеты, как уже упоминалось, оказываются полезными при сопоставлении масштабов различных генетических карт.
Согласно официально утвержденной номенклатуре
(ISCN,1971) каждая хромосома человека после дифференциальной окраски может быть разделена на сегменты, нумерация которых начинается от центромерного района вверх (короткое плечо - р), либо вниз (длинное плечо - q) (Рис.3.4). Полосы в каждом сегменте также пронумерованы в аналогичном порядке. Крупные полосы зачастую подразделяются на несколько частей, соот- ветствующих более мелким бэндам, выявляемым только при ок- раске малоспирализованных прометафазных хромосом. Запись по- ложения гена на цитогенетической карте включает номер хро- мосомы, плечо, а также номер сегмента, бэнда и его субъеди- ницы. Например, запись 7q21.1 означает, что ген локализован в субъединице 1, 1-го бэнда 2-го сегмента длинного плеча хромосомы 7.
Такая подробная запись особенно удобна при использова- нии для цитогенетического картирования метода гибридизации in situ (см.Главу I), позволяющего локализовать ген с точ- ностью до одного бэнда и даже его субъединицы. Основу данно- го метода, как уже указывалось составляет гибридизация ге- номной ДНК целых хромосом на разных стадиях их спирализации с предварительно меченными специфическими ДНК-зондами.
Источником последних могут служить геномные последователь- ности ДНК, сцепленные с картируемым геном, либо кДНК-овые последовательности. В настоящее время из тканеспецифических библиотек генов выделено около 20 000 анонимных последова- тельностей кДНК, представляющих более 10 000 различных генов человека (Sikela, Auffray, 1993). Эти кДНК составляют при- мерно 10-15% всех кодирующих последовательностей генома. Ме- тодом гибридизации in situ уже идентифицировано более 2000 генов, для многих из которых пока не найдено сцепление с по- лиморфными маркерами (Poduslo et al., 1991). Такие кодирую- щие последовательности присутствуют на карте генов человека, но их пока нет на картах сцепления.
Раздел 3.3 Генетические индексные маркеры.
Как мы уже отмечали раньше, успешная локализация неиз- вестного наследственного признака (гена) в значительной сте- пени определяется присутствием на карте фланкирующих марке- ров, находящихся на относительно небольшом расстоянии по обе стороны от гена. В качестве генетических маркеров специфи- ческих участков хромосом могут быть использованы любые лока- лизованные в этих участках элементы генома с высоким уровнем легко идентифицируемой популяционной изменчивости или поли- морфизма. Отбор сцепленных с картируемым признаком генети- ческих маркеров производят по результатам совместного анали- за их сегрегации в информативных семьях.
Значительные успехи в геномном картировании были связа- ны с использованием в качестве генетических маркеров широко распространенной во многих популяциях изменчивости по изо- ферментному спектру различных белков. Оказалось, что многие ферменты у разных индивидуумов, в разных тканях и на разных стадиях онтогенеза могут находиться в различных изоформах.
Такие варианты одного и того же белка обычно не отличаются по специфической активности, но имеют измененную электрофо- ретическую подвижность. Популяционный анализ изоферментов обнаружил существование полиморфизма для очень многих белко- вых систем, контролируемых разными генами, локализованными во многих хромосомах. Таким образом, для этих хромосом были найдены генетические маркеры, с помощью которых были иденти- фицированы соответствующие группы сцепления.
Совершенствование молекулярных методов анализа специфи- ческих последовательностей ДНК привело к обнаружению большо- го числа высокоизменчивых участков генома - полиморфных сай- тов рестрикции, гипервариабельных мини- и микросателлитных последовательностей (см.Главу II) Эта изменчивость также бы- ла использована для маркировки участков хромосом с целью установления более точного взаиморасположения локусов. Вско- ре после обнаружения полиморфных сайтов рестрикции были опубликованы теоретические рассчеты, согласно которым от 10 до 20 таких локусов, расположенных равномерно на каждой хро- мосоме на расстоянии около 20 сМ друг от друга, достаточно для определения хромосомной принадлежности генов, от- ветственных за любой тип наследственной изменчивости
(Botstein et al,1980). По этим оценкам около 200 таких ин- дексных маркеров позволят построить карты сцепления для всех известных генов на основании анализа сегрегации соответству- ющих признаков в семьях с большим числом мутантов. Для опре- деления порядка расположения генов на хромосомах и оценки генетических расстояний между ними достаточно около 400 рав- номерно распределенных полиморфных маркеров.
Идентификация в геноме человека большого числа поли- морфных сайтов рестрикции и разработка простых методов ана- лиза индивидуальной изменчивости по этим локусам существенно повысили возможности локализации неизвестных признаков на геномных картах. Уже к 1989г. были картированы более 2000 клонированных последовательностей ДНК, обнаруживающих поли- морфизм по длине рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в различ- ных популяциях (Kidd et al., 1989). Более 1000 из них типи- ровано в CEPH-коллекциях родословных. В значительной степени это анонимные последовательности, связь которых со специфи- ческими генами не установлена. Их наименования чаще всего соответствуют названию отобранного из библиотеки генов кло- на. В дальнейшем была разработана стандартная генетическая номенклатура для обозначения используемых в качестве марке- ров сегментов ДНК с неизвестной функцией. Первая буква D, что значит ДНК, затем номер хромосомы, далее S для уникаль- ных и Z для повторяющихся последовательностей и в конце но- мер, идентифицирующий данный зонд в определенном районе ДНК.
Применение полиморфных сайтов рестрикции в качестве ге- нетических маркеров имеет два ограничения: сравнительно низ- кая информативность (частота гетерозигот не может превышает
50%- см. Главы II, Y) и неравномерное распределение
ПДРФ-сайтов по хромосомам. Этих недостатков практически ли- шены гипервариабельные STR-сайты (ди-, три- и тетрануклеа- тидные повторы). Использование микро- и минисателлитных ДНК последовательностей в качестве индексных генетических марке- ров открыло новую эру в построении карт сцепления генома че- ловека. В настоящее время работа по идентификации высокопо- лиморфных маркеров, перекрывающих весь геном и равномерно распределенных по хромосомам практически завершенаа
(Weissenbach et al.,1992; Reed et al.,1994). Эта система построена на базе динуклеотидных (C-A)n повторов.
(C-A)n*(G-T)n представляют собой наиболее частый класс простых повторов, обнаруженных в геноме человека (за исклю- чением An* Tn мультимеров). Такие повторы присутствуют при- мерно в 1% колоний из геномных библиотек, сконструированных на базе фрагментов длиной 300 - 500 п.о., которые образуются после переваривания геномной ДНК эндонуклеазой Alu1. Более
90% из них оказываются полиморфными по числу копий в класте- ре, причем в 70% локусов присутствует более трех аллелей. В
1992г. группе французских ученых под руководством Жана
Вайссенбаха удалось разработать систему идентификации с по- мощью ПЦР индивидуальной изменчивости в местах локализации
(C-A)n повторов и на этой основе создать геномную карту из
814 высокополиморфных индексных маркеров со средним расстоя- нием между ними около 5 сМ, получившую название
Genethon-коллекции микросателлитных маркеров (Weissenbach et al., 1992). Для этого были просеквенированы более 12 000 фрагментов ДНК, выделенных из геномной Alu1-библиотеки путем ее скрининга poly(dC-dA)*poly (dG-dT) ДНК-зондом. Праймеры для амплификации подбирали из последовательностей ДНК, окру- жающих повторы, используя для этого компьютерные программы.
Для дальнейшего анализа было отобрано около 3 000
(C-A)n-сайтов и проведена специфическая амплификация этих участков у четырех неродственных CEPH-индивидуумов. На сле- дующем этапе была определена хромосомная принадлежность по- лутара тысяч наиболее информативных маркеров путем их иден- тификации в панели из 18 соматических гибридных клонов, со- держащих разные наборы хромосом человека. Детальная карта сцепления индексных маркеров построена по результатам их ге- нотипирования в коллекции 8 самых больших CEPH-родословных.
Предложенная система маркеров перекрывает все хромосомы, а суммарное расстояние между ними соответствует примерно 90% всего генома человека.
К 1994г. число индексных STR-маркеров было увеличено до
2 066, а средний интервал между соседними локусами уменьшен до 2,9 сМ (Gyapay et al.,1994). В последнее время перспекти- вы широкомасштабного картирования всего генома человека ста- ли еще более значительны. Группой английских авторов под ру- ководством Дж.Тодда была разработана система автоматического скринирования 254 динуклеотидных маркеров, перекрывающих весь геном человека со средним расстоянием между соседними маркерами около 13 сМ. 80% этих повторов было отобрано из
Genethon-коллекции маркеров, остальные - из других источни- ков (Genome Data Base, Baltimore). Амплификацию всех 254 по- лиморфных сайтов проводили в 39 мультиплексных ПЦР (МПЦР), причем используемые для этих целей олигопраймеры были мечены четырьмя типами флюорохромов, так что аллели даже одинаково- го молекулярного веса можно было различить на электрофорег- рамме по цвету. В каждой из 39 МПЦР скринировали 7 - 9
STR-сайтов какой-то определенной хромосомы. Такие МПЦР-набо- ры были разработаны для всех 22 аутосом и для Х-хромосомы.
Регистрация аллелей всех STR проводилась автоматическим сканнером с использованием компьютерной программы Genotyper.
Только с помощью одного автоматического сканнера удается проанализировать по этой схеме более 2.5 тысяч генотипов в день! (Reed et al.,1994). Такая система уже сегодня открыва- ет самые широкие возможности не только для генетического картирования и создания подробных карт сцепления практически любых моногенных заболеваний, но, что особенно существенно, она делает реальной разработку стратегии картирования генов, мутации которых предрасполагают к мультифакториальным забо- леваниям, таким как диабет, гипертония, инфаркт миокарда, психозы и многое другое.
Раздел 3.4 Хромосом-специфические библиотеки генов, пульсирующий гель-электрофорез.
Используя столь обширную систему молекулярных маркеров и проводя анализ сцепления на коллекциях клеточных культур или на материале информативных родословных можно довольно быстро привязать любой признак, особенно моногенный, не только к определенной хромосоме, но даже к одному бэнду, оп- ределить ближайшие фланкирующие маркеры и перейти не- посредственно к позиционному клонированию с целью выделения и идентификации самого гена. В этой связи важное значение в картировании генов принадлежит молекулярно-цитогенетическим подходам, являющимся принципиально важным звеном для успеш- ного совмещения карт сцепления и физических карт целых хро- мосом и их фрагментов.
Точность цитогенетического картирования определяется степенью спирализации хромосом, характером использованной метки и разрешающей способностью микроскопического оборудо- вания. При картировании на стандартных метафазных хромосомах и использовании радиоактивно меченых зондов точность карти- рования ограничивается одним крупным бэндом или даже сегмен- том хромосомы и составляет около 5-10 миллионов п.о. При использовании биотиновой метки на прометафазных хромосомах точность картирования возрастает в среднем в 5-10 раз (до 1 миллиона п.о.), а при работе со специально приготовленными и растянутыми интерфазными хромосомами может доходить до 50 тысяч п.о.(Boehringer Mannheim Mannual,1992). Тем ни менее, даже при такой разрешающей способности цитогенетическое кар- тирование дает лишь весьма ориентировочные результаты и обы- чно рассматривается как 1-й этап физического картирования.
Значительно более точные результаты достигаются на 2-м этапе - этапе физического (рестрикционного) картирования.
Среднее расстояние между стандартными сайтами узнавания на рестрикционных картах колеблется в пределах от 10 до 20 кб.
Из-за расхождений почти на два порядка масштабов цитогенети- ческого и молекулярного картирования прямое сопоставление этих типов физических карт практически невозможно.
Одним из способов преодоления этих трудностей является конструирование хромосом-специфических библиотек генов. Как уже упоминалось (см.Глава I,1.5) для приготовления таких библиотек используют наборы клеточных линий соматических ги- бридов с отдельными хромосомами человека либо хромосомы, ме- ханически отобранные путем проточной цитометрии. Для некото- рых видов молекулярного клонирования удобнее оказались биб- лиотеки генов, построенные из субхромосомальных фрагментов.
Получение таких фрагментов достигается путем целенаправлен- ного конструирования соматических гибридов, содержащих лишь часть какой-либо хромосомы человека. Субхромосомные клоны могут быть получены и с помощью микроманипуляций, при кото- рых механически, под контролем микроманипулятора может быть вырезан практически любой видимый фрагмент каждой хромосомы.
Разработаны также молекулярные методы выделения из генома и идентификации крупных фрагментов ДНК, приближающихся по раз- мерам к единичным хромосомным бэндам. Это стало возможным после обнаружения редкощепящих рестриктаз, разрезающих ДНК на фрагменты длиной от сотен тысяч до миллиона пар нуклеоти- дов (Estivill, Williamson, 1987).
Другим важным шагом на пути клонирования и анализа больших субхромосомальных фрагментов ДНК явилась разработка методов их разделения путем гель-электрофореза в пульсирую- щем поле (Barlow, Lehrach, 1987; Smith, Cantor, 1986; Smith et al., 1987). В соответствии со стандартными методами электрофореза под действием однонаправленного постоянного поля в агарозном или в полиакриламидном гелях удается разде- лять фрагменты ДНК размером не более 3 - 5 десятков килобаз.
Продвижение больших фрагментов ДНК в геле при пульсирующем изменении направления электрического поля происходит, по
-видимому, за счет конформационных изменений, обусловленных скручиванием и раскручиванием молекул ДНК в момент переклю- чения направления поля. При этом более короткие молекулы легче адаптируются к изменению условий и потому движутся в геле быстрее. Существуют различные варианты пульсирующего гель-электрофореза, главным образом, связанные с геометри- ческим расположением направлений полей - ортогональный, гексогональный, инверсионный. При использовании любого из этих вариантов могут быть разделены молекулы ДНК размером от
50 кб до более, чем 9 миллионов п.о. Эффективность разделе- ния фрагментов ДНК зависит не только от их размеров, но и от условий проведения электрофореза (напряжение, температура буфера, концентрация агарозы, время одного импульса). В ка- честве маркеров для определения величины больших молекул ДНК используют целые хромосомы дрожжей известной молекулярной массы. В дальнейшем отбор крупных фрагментов ДНК, несущих специфические последовательности, также может быть осущест- влен путем блот-гибридизации с ДНК-зондами. Разделенные и идентифицированные фрагменты ДНК могут быть элюированы из геля и использованы для рестрикционного картирования, пост- роения библиотек генов и для молекулярного клонирования с целью идентификации и изоляции генных последовательностей. В последнее время для изоляции крупных субхромосомальных сег- ментов ДНК широко используется метод клонирования в искусственных дрожжевых минихромосомах - YAC, и построения библиотек генов на основе YAC-векторов.
Раздел 3.5 Позиционное клонирование, прогулка и прыжки по хромосоме, идентификация и изоляция генов.
Мы уже упоминали, что средние размеры гена составляют около 10-30 кб, варьируя в широких пределах (см.Глава II.2.
4). Единицы рекомбинации, размеры цитогенетических бэндов и субхромосомных фрагментов ДНК измеряются миллионами пар нуклеотидов, также как и размеры фрагментов ДНК, выделяемых с помощью обработки геномной ДНК редкощепящими эндонуклеаза- ми, пульсирующего электрофореза и клонирования в дрожжевых минихромосомах. Переход от этих крупных фрагментов к после- довательностям ДНК, сопоставимым с размерами гена, осущест- вляют с помощью молекулярного клонирования, то есть получе- ния набора фаговых или космидных клонов, содержащих относи- тельно небольшие последовательности, насыщаяющие или пол- ностью перекрывающие крупный сегмент ДНК, предположительно содержащий идентифицируемый ген (Рис.3.5). Затем проводят упорядочивание клонов в соответствии с взаимным расположени- ем инсертированных в них фрагментов ДНК, осуществляя однов- ременно молекулярный анализ этих фрагментов с целью иденти- фикации регуляторных или кодирующих областей генов. Позднее мы подробнее остановимся на тех критериях, с помощью которых можно различить транскрибируемые и нетранскрибируемые участ- ки генома. Для молекулярного клонирования используют различ- ные подходы (Iannuzzi, Collins, 1990). Прежде всего, это насыщающее клонирование, то есть изоляция из хромосом-специ- фических библиотек нескольких сотен клонов с целью картиро- вания различными методами инсертированных в них фрагментов
ДНК и идентификации клонов с последовательностями, локализо- ванными в заданном районе. Значительно чаще используется тактика скринирования фаговых, космидных и YAC библиотек, сконструированных из субхромосомальных сегментов ДНК, пред- варительно отобранных на основании сцепления с различными
ДНК-маркерами. При этом методы выделения субхромосомальных сегментов ДНК могут быть самыми различными. Дальнейший поиск в библиотеках генов клонов, содержащих транскрибируемые последовательности ДНК, осуществляют достаточно трудоемкими методами, получившими название "прогулки" и "прыжков" по хромосоме.
"Прогулка" по хромосоме или скользящее зондирование
(Рис.3.6). заключается в последовательном отборе клонов, со- держащих частично перекрывающиеся фрагменты ДНК из опреде- ленного района генома (Rommens et al.,1989). На первом этапе проводят скрининг библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцеп- ленной с геном. После нахождения положительных клонов последние сами служат зондами для изоляции других клонов, содержащих перекрывающиеся последовательности ДНК. Таким об- разом, каждый раз отобранный фрагмент используется в качест- ве скринирующего ДНК-зонда для последующего поиска. В ре- зультате получют набор клонированных фрагментов ДНК, пол- ностью перекрывающих область поиска гена. Группа подобных клонов носит название "контигов". С помощью физического кар- тирования инсертированной ДНК в разных клонах удается точно установить степень перекрывания между соседними фрагментами и соответственно упорядочить положение клонов в "контигах".
При скринировании космидных библиотек с выявлением каждого нового клона к участку ДНК, полностью перекрытому отобранны- ми зондами, в среднем добавляется около 20 кб. Таким спосо- бом, однако, редко удается пройти более 200 - 300 кб в одном направлении из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно клонируемых последовательностей ДНК.
Для преодоления этих ограничений и ускорения процесса поиска генных последовательностей американским исследовате- лем Фрэнком Коллинзом, ныне президентом Программы Геном Че- ловека, был разработан метод "прыжков" по хромосоме. Этот метод позволяет изолировать фрагменты ДНК, отстоящие в гено- ме друг от друга на сотни тысяч нуклеотидов (длина прыжка), не изолируя при этом все промежуточные последовательности
ДНК (Collins, Weissman, 1984). Как видно на представленной схеме (Рис.3.7), прыжки начинаются со стартового зонда, то есть с последовательности, гибридизующейся со сцепленным с геном ДНК-маркером. Предварительно геномная ДНК переварива- ется редкощепящей рестриктазой, в результате чего образуются большие фрагменты ДНК, соответствующие по длине одному прыж- ку. Затем, эти фрагменты переводятся в кольцевую форму за счет искусственного присоединения к их концам небольшого маркерного гена. При этом концы рестрикционных фрагментов сближаются. Кольцевые молекулы ДНК разрезают среднещепящими рестриктазами и из пула относительно небольших фрагментов
ДНК отбирают те, которые содержат маркерный ген, а, следова- тельно, и окружающие его концевые участки исходных крупных фрагментов. Отобранные последовательности клонируют в фаго- вых или космидных векторах, получая библиотеку генов конце- вых участков. Затем в этой библиотеке проводят скрининг кло- нов, содержащих стартовый зонд. Только в этих клонах компле- ментарные зонду последовательности соединены маркерным геном с последовательностями ДНК, отстоящими от стартового участка поиска на длину прыжка. При необходимости промежуточные сег- менты ДНК также могут быть клонированы с использованием ме- тода скользящего зондирования.
Остановимся теперь на тех критериях, по которым можно отличить сегменты ДНК, являющиеся частями генов, от любых других последовательностей (Рис.3.7.) (Lindsay, Bird, 1987;
Rommens et al., 1989; Wicking, Williamson, 1991; Collins,
1992). Условно эти критерии могут быть разделены на три группы. В первой группе исследуют структурные особенности генных последовательностей. Вторая группа критериев основана на поиске функциональных участков генов. В третьем случае анализируют характер нуклеотидных последовательностей тести- руемых фрагментов ДНК. Диагностику структурных участков ге- нов осуществляют путем гибридизации с ДНК-зондами или прямым скринированием кДНК-овых библиотек. Функциональная диаг- ностика генов включает улавливание экзонов (exon trapping), промоторных участков, поли-A сигнальных последовательностей, а также перенос генов в иные конструкции и идентификацию в них соответствующих транскриптов. И, наконец, поиск генов может быть осуществлен путем прямого секвенирования крупных фрагментов ДНК с последующим компьютерным анализом нуклео- тидной последовательности и сопоставлением её с присутствую- щими в базах данных идентифицированными генами других видов живых существ.
Как уже отмечено ранее, кодирующие области генов, представленные в геноме уникальными последовательностями, достаточно консервативны в процессе эволюции. Существует высокий процент гомологии в структуре ДНК между одинаковыми генами у разных видов млекопитающих. На этом факте основан, так называемый зоо-блот - скрининг клонированных последова- тельностей, не содержащих повторов, но дающих перекрестную гибридизацию с геномной ДНК, выделенной из разных видов жи- вотных - приматов, сельскохозяйственных животных, грызунов, птиц, рептилий. Клоны, содержащие консервативные последова- тельности, подвергают дальнейшему анализу на присутствие в инсертированных фрагментах ДНК CpG островков, часто маркиру- ющих 5'-фланкирующие области генов позвоночных, особенно ге- нов домашнего хозяйства ( см.Главу II,2.4), и исследуют на- личие открытых рамок считывания -ORF (open reading frames).
Дальнейший поиск генов в более узком интервале может быть осуществлен с помощью компьютерного анализа соответствующей нуклеотидной последовательности ДНК. Кроме того, все клони- рованные ДНК из этого интервала могут быть сразу использова- ны для анализа РНК-транскриптов (Iannuzzi, Collins, 1990).
Важным доказательством принадлежности клонированной ДНК гену является идентификация гомологичных РНК транскриптов в тканях, где можно предполагать экспрессию этого гена. С этой целью проводят гибридизацию уже отобранных по первым двум критериям клонов ДНК с тотальной мРНК, выделенной из этих тканей, а также скринируют соответствующие кДНК-овые библио- теки. Для генов наследственных заболеваний с неизвестным первичным биохимическим дефектом библиотеки конструируют из пораженных органов и тканей. При обнаружении последователь- ностей кДНК, гибридизующихся с геномными зондами, их, в свою очередь, используют для зондирования библиотеки и выявления всех клонов с перекрывающимися последовательностями кДНК. К сожалению, для генов с низким уровнем экспрессии гибридиза- ция может не дать положительных результатов.
Выделенные клоны, удовлетворяющие перечисленным крите- риям, с большой вероятностью содержат последовательности ДНК, являющиеся частями гена. Однако, всегда существует опасность выбора какого-то другого гена (или псевдогена), локализован- ного в той же области ДНК. Поэтому требуются дополнительные доказательства идентичности выбранной последовательности ДНК специфическому гену. Такие доказательства могут быть получе- ны, например, при определении нуклеотидной последователь- ности кДНК и сопоставлении ее с аминокислотной последова- тельностью кодируемого этим геном белка. Веским доказа- тельством в пользу правильности проведенной идентификации гена может быть обнаружение мутантных вариантов аллелей в изолированных последовательностях ДНК у больных, страдающих соответствующим наследственным заболеванием. Так, например, при идентификации гена муковисцидоза, у 70% больных в клони- руемой кДНК последовательности была обнаружена однотипная мутация - делеция трех нуклеотидов - delF508. Наконец, реша- ющим аргументом правильности идентификации нужного гена яв- ляется успешно осуществленная с его помощью генокоррекция первичного биохимического дефекта, выполненная на соот- ветствующих культурах мутантных клеток, или получение стой- кого терапевтического эффекта у трансгенных животных - био- логических моделей данного наследственного заболевания.
Определение размера молекул мРНК, гибридизующихся с ге- номными клонами, дает оценку суммарной величины гена. Эта оценка имеет важное значение для реконструирования полнораз- мерной кДНК. Её клонирование, по-сути, означает идентификаию гена, так как позволяет определить его границы в геномной
ДНК, охарактеризовать его экзонно-интронную структуру и ре- гуляторные элементы. Зная первичную нуклеотидную последова- тельность кДНК, можно с уверенностью прогнозировать амино- кислотную последовательность соответствующего белка и таким образом определить первичное биохимическое звено в патогене- зе соответствующего наследственного заболевания.
Описанный способ изучения молекулярных и биохимических основ наследственных заболеваний получил название обратной генетики, а сам процесс в отличие от традиционного пути от белка к гену, так называемого функционального клонирования, был назван позиционным клонированием, тем более, что термин обратной генетики уже использовался ранее для обозначения метода анализа функции гена путем направленного введения в него мутаций (Collins, 1992).
Возможность использования функционального клонирования зависит от доступности информации о белковом продукте и/или о функции соответствующего гена. Для подавляющего боль- шинства моногенных болезней определение первичного биохими- ческого дефекта представляет собой очень трудную задачу из-за недостаточного понимания функционирования огромного числа клеточных ферментов, сложностей их взаимодействия, низких концентраций, отсутствия эффективных методов выделе- ния и очистки а, зачастую, даже из-за отсутствия сведений о клетках - мишенях, в которых следует искать первичный биохи- мический дефект. Поэтому на фоне стремительного роста данных о структуре генома чеовека и, прежде всего, о насыщенности генами и анонимными ДНК маркерами отдельных хромосом и их сегментов, реальные соотошения функционального и позиционно- го клонирования в идентификации генов, ответственных за наследственные заболевания, быстро меняются в сторону бе- зусловного доминирования последнего.
Успех позиционного клонирования определяется возмож- ностями картирования гена, при этом функция гена исследуется уже после его идентификации и клонирования. На рис. 3.8 представлена общая схема позиционного клонирования, за- имствованная из работы Коллинза (Collins, 1992). Обычно, для нахождения положения неизвестного гена на карте сцепления используют 100 - 200 полиморфных маркеров. После обнаружения хромосомной принадлежности картируемого гена более точная локализациия может быть установлена с помощью при- цельного отбора дополнительных индексных маркеров из опреде- ленного цитогенетического сегмента. Картирование гена, оп- ределяющего наследственное заболевание, может быть значитель- но ускорено при наличии у какого-то больного цитогенетически видимой структурной перестройки в области локализации этого гена, чаще всего делеции или транслокации. Хотя такие паци- енты, как правило, встречаются редко, но описание даже одно- го такого случая может исключить необходимость картирования гена путем последовательного анализа его сцепления с генети- ческими маркерами целого генома и позволит перейти не- посредственно к молекулярному клонированию. Именно таким об- разом были идентифицированы гены хронического грануломатоза, миопатии Дюшенна, ретинобластомы, X-сцепленной глухоты, ней- рофиброматоза I, аниридии и некоторых других наследственных болезней.
С другой стороны, в ряде случаев удается исключить дли- тельный процесс молекулярного клонирования, используя метод
"кандидатного гена". Разработка методов, облегчающих нахож- дение транскрибируемых областей генома, улавливание экзонов и регуляторных участков генов, секвенирование и картирование методами гибридизации in situ большого количества анонимных кДНК последовательностей, изолированных из тканеспецифи- ческих библиотек, все это в комплексе приводит к значитель- ному увеличению степени насыщенности различных сегментов хромосом известными генными последовательностями, среди ко- торых и осуществляют поиск гена-кандидата. Большая роль в этих исследованиях принадлежит также мутантным генетическим линиям животных, моделирующим различные наследственные забо- левания человека (см Глава VIII). Значительное сходство нук- леотидных последовательностей кодирующих участков гомологич- ных генов млекопитающих и человека, наличие большого числа консервативных групп сцепления с наборами идентичных генов позволяют успешно вести параллельные исследования геномов человека и других животных, значительно ускоряющие эффектив- ность поиска и молекулярного анализа индивидуальных генов человека (Dietrich et al., 1994; Copeland et al, 1993).
Молекулярная идентификация генов открывает широкие возможности для анализа тканеспецифической регуляции их экспрессии в процессе развития организма на всех уровнях от транскрипции до трансляции. Следуюшим этапом молекулярного анализа является генотипирование мутаций и исследование тех нарушений в структуре, локализации или в ферментативной ак- тивности соответствующих белков, которые возникают в резуль- тате изменений нуклеотидных последовательностей ДНК. Эти проблемы более подробно освещены в следующих разделах книги.
Отметим только, что в настоящее время подобные исследования стали возожны для многих сотен наследственных заболеваний человека, для которых идентифицированы геномные последова- тельности ДНК, соответствующие генам, и проклонированы пол- норазмерные кДНК-последовательности.
Раздел 3.6 Каталог генов и генных болезней МакКьюсика.
Международная программа "Геном человека".
Огромный вклад в систематизацию и обобщение информации о генетических картах хромосом человека, локализации и функ- циях отдельных генов, и о структуре генома в целом, вносят исследования, проводимые на протяжении последних 30 лет в
Университете Джона Хопкинса в Балтиморе под руководством профессора Виктора МакКьюсика. Результатом этих исследований является систематическое, с 2-х-годичным интервалом между последними пятью публикациями, издание энциклопедий, содер- жащих сводные данные о всех картированных генах человека и связанных с ними наследственных болезнях под названием:
"Менделевсое наследование у человека: каталог человеческих генов и генетических болезней" ("Mendelian inheritance in man. Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes". Эти издания содержат современные хромоcомные карты генов человека и для каждого локуса обоб- щенные в виде отдельных статей сведения о характере наследо- вания, функциях и размерах генов; методах их картирования и идентификации; кодируемых продуктах; мутантных аллелях, по- лиморфизмах и внутригенных повторах; фенотипических проявле- ниях мутаций, их связи с наследственными заболеваниями, а также о природе основного дефекта, включая патогенез и пато- физиологию заболевания. Все статьи снабжены исчерпывающими литературными ссылками. Cводные таблицы по картированным ло- кусам с различным типом наследования и по генам наследствен- ных заболеваний составлены либо в соответствии с их хро- мосомной локализацией, либо в алфавитном порядке по названи- ям генов или по наименованиям соответствующих генных болез- ней. Отдельно представлены данные по клонированным генам, для которых известен первичный молекулярный дефект. При этом количество различных идентифицированных мутантных вариантов для разных генов колеблется от одного до нескольких сотен.
Издания содержат также список доступных мутантных клеточных линий.
Каждому локализованному менделирующему локусу в этой энциклопедии присвоен шестизначный номер (MIM), первая цифра которого определяет характер наследования: 1 - для аутосом- но-доминантных генов, 2 - для аутосомно-рецессивных, 3 и 4- для генов, локализованных в X- и в Y-хромосомах, соот- ветственно, 5 - для митохондриальных генов. Четыре цифры, следующие после точки непосредственно за шестизначным номе- ром, предназначены для кодирования различных мутантных вари- антов данного локуса. Издания выпускаются как в печатной форме, так и в компьютерном варианте (OMIM) на дискетах или на компакт-дисках. В последнем случае они снабжены програм- мами, позволяющими осуществлять поиск по любой позиции и проводить постоянное обновление энциклопедии текущей инфор- мацией. Программы OMIM совместимы с другими базами генети- ческих данных, в первую очередь, с GDB (Genome Data Base), содержащей полную информацию (включая последовательности
ДНК) обо всех картированных генах, ДНК-маркерах и ДНК-зондах человека, а также и с GenBank - полной базой данных всех из- вестных нуклеотидных gоследовательностей ДНК.
В последнем 11-ом издании энциклопедии МакКьюсика со- держатся сведения о 6678 картированных менделирующих локусах человека (McKusick, 1994). Из них 4458 генов с аутосомно-до- минантным характером наследования, 1730 - с аутосомно-ре- цессивным, 412 генов локализовано в X-хромосоме, 19 - в
Y-хромосоме и 59 - в митохондриальной ДНК. Для более чем
2800 картированных генов определена их функция. С моногенны- ми заболеваниями связано 770 картированных локусов, а общее число нозологических форм, для которых гены картированы, включает 933 заболевания. При этом более 420 генов наследственных болезней уже клонированы и для каждого из этих генов описано от одного до нескольких сотен мутантных вариантов аллелей, характеризующихся различным фенотипи- ческим проявлением.
Различные хромосомы и их участки картированы с разной степенью детализации. На самой крупной по размерам хромосоме
1 картировано вдвое меньше генов, чем на Х-хромосоме ( 200 и
400 соответственно). Плотность уже картированных генов в разных хромосомах очень неравномерна. Так, хромосома 19 со- держит 178 генов, тогда как хромосома 13 только 40, при этом первая больше второй. Хромосомы 17 и 18 примерно равны по величине, но на первой уже картировано 180 генов, а на вто- рой- только 26. На хромосоме 2 картировано примерно такое же количество генов (около 175), как и на втрое меньше её по размерам хромосоме 17. Существеные различия в числе картиро- ванных генов отмечаются и внутри различных участков хро- мосом. К примеру, 19 из 43 генов хромосомы 21 локализованы в сегменте 21q22.3, составляющем лишь 20% длинного плеча. Об- ласть 9q34 занимает 10% хромосомы 9, но содержит 27% генов -
38 из 141 (Antonarakis, 1994). Число подобных примеров не- равномерного распределения картированных генов по хромосо- мамс может быть значительно увеличено.
Более 10 лет тому назад был полностью просеквенирован митохондриальный геном (Anderson et al., 1981), состоящий из
16 569 нуклеотидов и содержащий 37 генов, 22 из которых это гены транспортных РНК, 2 гена рибосомальной РНК и 13 белко- вых генов, кодирующих субьединицы комплексов окислительного фосфорилирования (OXPHOS). Следует отметить, что 56 субьеди- ниц этого комплекса кодируется ядерными генами (McKusick:
1994). Митохондриальная ДНК очень плотно насыщена кодирующи- ми участками, так как митохондриальные гены не содержат инт- ронов и имеют очень ограниченные размеры некодирующих флан- кирующих ДНК. В настоящее время описано достаточно много бо- лезней, связанных с мутациями в митохондриальном геноме, и все они развиваются вследствие нарушений в системе окисли- тельного фосфорилирования.
Мы уже упоминали о том, что в настоящее время проклони- ровано около 20 000 анонимных последовательностей кДНК, вы- деленных из тканеспецифических библиотек генов и представля- ющих около 10-15% всех генов человека. Хотя этих последова- тельностей пока нет на картах генов, секвенирование, со- поставление с компьютерными базами данных и гибридизация in situ позволят уже в самое ближайшее время провести их иден- тификацию и локализацию (McKusick, Amberger, 1993).
Следует отметить, что каждый картированный ген и поли- морфный локус сами по себе автоматически становятся точками отсчета в геноме, то есть молекулярными маркерами. Наряду с этим, продолжается интенсивное насыщение генома новыми моле- кулярными маркерами типа STS ( sequence tagged sites) и мик- росателлитными повторами типа STR (short tandem repeats)
(cм. Главу II). К сентябрю 1994г Genome Database (GDB) вклю- чала 6691 STR-сайтов и 3 752 из них (56%) имели уровень ге- терозиготности более 60%. Карты сцепления для индексных мар- керов сконструированы, в основном, по результатам генотипи- рования сорока CEPH референтных семей (см.Глава II,2.3).
Среднее расстояние между соседними маркерами варьирует от 2 сМ для хромосомы 21 до 5 сМ для самых крупных хромосом с очень небольшим числом участков в геноме с расстоянием между маркерами большим, чем 10 сМ. GDB содержит 672 гена, локали- зованных на картах сцепления индексных маркеров, из общего числа 3485 клонированных генов (Guapay et al., 1994). Соз- данные в последние годы достаточно подробные геномные карты сцепления молекулярных маркеров в масштабах 13, 0; 5,0 и да- же 2,9 сантиморганид; автоматизация процесса генотипирования маркерных микросателлитных (STR) аллелей; большое число уже картированных структурных генов, анонимных ДНК-последова- тельностей значительно упрощают и, главное, ускоряют процесс генетического картирования. Если в 1992г. в распоряжении иследователей было только 814 динуклеотидных полиморфных сайтов (Weissenbach et al.,1992), то уже к маю 1994 г. их число возросло до 3 300 (Guyapay et al.,1994) , а к концу года - до 5 000- 6 000 (Shmitt, Goodfellow, 1994). Столь же быстрыми темпами нарастает число молекулярных маркеров и в геноме лабораторных мышей (Service, 1994). По всей види- мости, человек и лабораторная мышь будут первыми млекопитаю- щими с полностью расшифрованными геномами.
Картирование генов человека и выяснение первичной нук- леотидной последовательности человеческого генома составляют основные, взаимосвязанные задачи Международной программы
"Геном Человека". Официально эта научная программа с участи- ем ведущих молекулярно-генетических лабораторий США, Запад- ной Европы, России и Японии оформилась в 1990г. Однако, за- долго до приобретения официального статуса, в этих странах проводились важные молекулярные исследования по изучению ге- нома человека и картированию его генов. История отечествен- ной программы началась в 1987г. Её инициатором и безусловным лидером в течение многих лет был академик А.А.Баев. По его настоянию в 1989г. она стала одной из ведущих Государствен- ных научно-технических программ СССР. Основные разделы этой программы как в России, так и во всем мире включают три главных направления научных исследований: 1. Картирование и секвенирование генома; 2. Структурно-функциональное изучение генома; 3. Медицинскую генетику и генотерапию (Баев,1990;
1994).
Предполагалось, что основной раздел программы, касаю- щийся секвенирования всего генома, то есть выяснения первич- ной последовательности всей молекулы ДНК одной клетки чело- века длиной около 1,5 метров, состоящей из 3.5х10!9 нуклео- тидов, будет завершен уже к 2 005 году. Однако, серьезные технические усовершенствования этого трудоемкого процесса, его автоматизация и резкое снижение себестоимости (от 1$ США за один шаг в 1990г. до 0,2$ в 1995г.) позволяют надеяться, что эта гигантская молекула, несущая информацию о всей прог- рамме индивидуального развития человека и его эволюции будет полностью расшифрована уже к 2 000 году ! (Marshall, 1995).
Естественно, что в итоге этой работы будут идентифици- рованы и все гены человека, то есть будет точно определено их число, взаиморасположение на генетической карте и струк- турно-функциональные особенности. Предполагается, что осу- ществление этого проекта, помимо колоссальных теоретических обобщений для фундаментальных наук, окажет огромное влияние на понимание патогенеза, предупреждение и лечение наследственных болезней, значительно ускорит исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе развития очень многих моногенных нарушений, будет способствовать более эф- фективному поиску генетических основ мультифакториальных за- болеваний и наследственной предрасположенности к таким широ- ко распространенным болезням человека как атеросклероз, ише- мия сердца, психиатрические и онкологические заболевания.
ГЛАВА X.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ
МОНОГЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.
Раздел 10.1. Хромосомная локализация и принципы класси- фикации генов наследственных болезней.
Раздел 8.1 Хромосомная локализация и принципы классифи-
К настоящему времени на хромосомах человека картирова- но около 800 генов, мутации которых приводят к различным наследственным заболеваниям. Количество моногенных заболева- ний, для которых известна локализация контролирующего гена, еще больше и приближается к 950 за счет существования ал- лельных серий, то есть групп болезней, клинически сильно от- личающихся друг от друга, но обусловленных мутациями в одном и том же гене (см.Глава IV). Для всех этих заболеваний прин- ципиально возможна пренатальная диагностика с использованием косвенных методов молекулярного анализа (см.Главу VII).
Более половины картированных генов клонировано и оха- рактеризовано методами молекулярного анализа. Для каждого из этих генов описаны мутантные варианты среди соответствующих групп больных, причем количество идентифицированных аллелей в разных генах может колебаться от одного до нескольких со- тен (см.ниже). Молекулярное генотипирование мутации позволя- ет проводить прямую пренатальную диагностику соответствующе- го наследственного заболевания в семьях высокого риска
(см.Главу VII).
Число генов наследственных болезней, локализованных на каждой хромосоме приведено на Рис. 10.1. В среднем, на каж- дой из них к 1995г. идентифицировано около 30 таких струк- турных генов. Обращает на себя внимание неравномерный харак- тер распределения этих генов. Так, хромосомы 1 и 2 имеют примерно одинаковые размеры (хромосома 2 даже несколько крупнее), однако, число уже картированных генов, связанных с наследственными заболеваниями, на хромосоме 1 в 3 раза мень- ше, чем на хромосоме 2. Наибольшее число таких генов (больше
100) картировано на Х-хромосоме. Это, по-видимому, можно объяснить гемизиготным проявлением мутаций генов Х-хромосомы в компаунде гоносом ХУ у мужчин. Вместе с тем, анализ приве- денных данных (Рис. 10.1) свидетельствует и о феномене раз- личной насыщенности разных хромосом структурными генами. На- ибольшая плотность структурных генов свойственна хромосомам
1, 3, 7, 9, 17, 22, Х. Значительно меньшая - хромосомам 2,
13, 18, 21, У (Antonarakis, 1994). Неслучайно, дисбаланс не- которых из хромосом 2-й группы часто совместим с постнаталь- ным развитием (синдром Дауна - трисомия 21; синдром Эдвардса
- трисомия 18; синдром Патау - трисомия 13). По-видимому, это связано со сравнительно низкой плотностью структурных генов в этих хромосомах, а также с отсутствием в них генов, контролирующих ранние стадии развития. Напротив, сравнитель- но слабая насыщенность известными генами хромосом 2 и 15 в сочетании с редкостью их дисбаланса даже в абортном материа- ле, может рассматриваться в пользу наличия в этих хромосомах
"ранних генов", контролирующих начальные стадии онтогенеза человека: гаметогенез, ранний эмбриогенез. Мутации таких ге- нов отметаются селекцией уже на этих ранних стадиях, а пото- му не обнаруживаются постнатально. Стремительный рост даных о генетической информации, заключенной в каждой хромосоме, распределении в ней структурных и регуляторных генов, их взаимодействии с надмолекулярными структурами хромосом (ге- терохроматином), межхромосомных взаимодействиях и феномене геномного импринтинга открывает широкие возможности на новом методическом и концептуальном уровне подойти к проблеме хро- мосомного (геномного) контроля ранних стадий развития чело- века - основной проблемы цитогенетики развития млекопитающих
(Баранов, 1984; 1990; 1992; Dyban, Baranov, 1987).
Другое положение, которое следует напомнить в вводной части этой главы касается специфичности мутационных повреж- дений каждого структурного гена. Как указывалось ранее
(см.Глава V), несмотря на наличие общих закономерностей в мутационных процессах, спектр мутаций для каждого гена, рав- но как и сами структурные гены - уникальны. Причины этой уникальности кроются в особенностях первичной структуры ДНК каждого гена, в частности, обогащенности CG нуклеотидами, его размерах, наличии прямых и обращенных повторов, присутс- твии внутри гена ДНК последовательностей, гомологичных вне- генным участкам, что может приводть к нарушениям процессов рекомбинации в мейозе и.т.д. Для каждого идентифицированного гена, мутации которого приводят к наследственным заболевани- ям, разработаны эффективные методы молекулярной диагностики, как правило, направленные на генотипирование наиболее частых мутаций этого гена. Реже для этих же целей используется неп- рямой метод диагностики с помощью молекулярных маркеров
(см.Глава YII).
Цитогенетические карты представляют собой один из спо- собов однозначной и обьективной систематизации генов. Для практических целей медико-генетического консультирования и дифференциальной диагностики моногенных заболеваний подобная классификация не всегда удобна, так как при составлении карт генов никак не учитывается информация об особенностях коди- руемых генами продуктов или о фенотипическом проявлении му- тантных аллелей. В медицинскихх целях черезвычайно важно иметь представление о группах генов, кодирующих функциональ- но и структурно родственные белки, или контролирующие забо- левания со сходной клинической картиной. Однако, далеко не всегда классификация по клиническим параметрам может быть проведена однозначно по ряду причин. Во-первых, большое чис- ло моногенных наследственных заболеваний носит синдромальный характер и, зачастую, не удается выделить группу ведущих клинических симптомов. Во-вторых, многие болезни отличаются высоким уровнем фенотипической гетерогенности, связанной ли- бо со спецификой мутационных повреждений, либо с различиями в окружающих условиях и/или в генетическом фоне (см. Главу
IV). Кроме того, многие болезни, вызванные мутациями в раз- ных генах, могут протекать сходным образом и, основываясь только на клинических симптомах, трудно провести дифференци- альную диагностику подобных заболеваний. Поэтому наиболее обьективная классификация моногенных наследственных болезней с известными первичными биохимическими дефектами проводится на основе классификации соответствующих генопродуктов с уче- том их участия в определенных метаболических циклах.
В данной заключительной главе мы попытаемся проиллюст- рировать на ряде примеров теоретические положения, изложен- ные в предыдущих главах. В качестве примеров будут приведены краткие молекулярно-генетические характеристики некоторых классов хорошо изученных и достаточно распространенных моно- генных наследственных болезней. Большинство из этих завболе- ваний в той или иной мере изучаются в соответствующих науч- ных центрах России, а их диагностика в медико-генетических центрах страны проводится не только по клиническим парамет- рам, но и с обязательным учетом результатов молекулярного и/или биохимического обследования.
Раздел 10.2. Метаболические дефекты лизосомных фермен- тов. Болезни накопления.
В качестве примера наиболее полно и всесторонне изучен- ных заболеваний мы выбрали группу болезней, обусловленных наследственными дефектами лизосомальных гидролаз. В Табл.
10.1 представлены данные о наследовании и встречаемости ли- зосомных болезней, хромосомной локализации и структуре соот- ветствующих генов, кодируемых ими продуктах и идентифициро- ванных мутантных аллелях. Даны также ссылки на основные ра- боты по картированию соответствующих генов, их клонированию и идентификации мажорных (то есть наиболее частых) мутаций.
Таблица составлена по материалам Каталога наследственных бо- лезней В. МакКьюсика 1994 г.(McKusik, 1994) и дополнена не- обходимыми литературными данными.
Таблица 10.1 Молекулярно-генетические основы лизосомных болезней
( N) - примечания, представленные в конце таблицы).
---------------------T--------------T-----------------------T---------------
---------¬
Синдромы 1), номер по¦Встречаемость,¦Типы и количество му- ¦Литература
¦
МакКьюсику; хромосом-¦белок, размеры¦таций 5), мажорные мута¦(локализация и
структура¦
ная локализация; ген ¦в аминокисло- ¦ции -в скобках указаны
¦генов,клонирование кДНК,¦
2);размеры 3); экзоны¦тах 4) ¦частоты аллелей у б-ных¦идентификация
мутаций). ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
N-ацетил-альфа-D-га- ¦Очень редко 6)¦Миссенс - 2: ¦Wang et
al.,1990 ¦
лактозаминидазы деф.;¦ ¦E325K -Шиндлера болезнь¦Desnick, 1991
¦
Шиндлера;Канзаки б-нь¦Ацетилгалактоз¦R329W - Канзаки болезнь¦
¦
104170; 22q11; ¦аминидаза,аль-¦ ¦
¦
NAGA.2; кДНК-2.2 кб ¦фа-N-; 411¦ ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Ангиокератома Фабри; ¦1 : 40 000 ¦Миссенс -31;делеции (от¦ Bishop et
al.,1988 ¦
дистопический липидоз¦ ¦1 н. до неск.экз.) -11;¦ Kornreich et
al.,1990 ¦
301500; Xq22; ¦Галактозидаза ¦сплайс.-5 (из них 3 с ¦ Davies et
al., 1993 ¦
GLA.50; 12 кб, 7 экз.¦альфа; 429¦дел.экз); инс.,дупл.-3 ¦ Eng et
al.,1993 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Аспартилглюкозамину- ¦Более 100 случ¦Миссенс -5; делеции -4;¦Ikonen et
al.,1991 ¦
рия, ¦в Финляндии ¦инсерции -2; ¦Ikonen et
al.,1992 ¦
208400; 4q23-q27; ¦Аспартилглюкоз¦C163S - мажорная мута- ¦
¦
AGA.11; ¦аминидаза; 346¦ция в Финляндии (98%) ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Вольмана б-нь;гиперхо¦Более 70 случ.¦Делеция 72 н.,возникшая¦Anderson et
al.,1991 ¦
лестерин-гипертригли-¦ ¦в результате сплайсинго¦Anderson et
al.,1994 ¦
церидемия, ¦Лизосомальная ¦вой мутации -обнаружена¦Maslen et
al,1993 ¦
278000; 10q24-q25; ¦кислая липаза ¦в 2 случаях;миссенс -2;¦Klima et
al.,1993 ¦
LIPA.4; 36 кб;10 экз.¦-A ¦инсерция 1 н. - 1. ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Галактосиалидоз, ¦Преим.в Японии¦Делеция экз.7 (сплайс.)¦Galjard et
al.,1988 ¦
¦Протективный ¦-мажорная у взрослsх в ¦Wiegant et
al.,1991 ¦
256540; 20q13.1; ¦белок бета га-¦Японии; миссенс -6; ¦Takano et
al.,1991 ¦
PPGB.7; мРНК - 2 кб ¦лактозидазы452¦F412V - в 2 случаях ¦Zhou et
al.,1991 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Ганглиозидоз GMI; му-¦Неизвестно ¦Миссенс -10; дуплик.-2;¦Oshima et
al.,1988 ¦
кополисахаридоз 1YB, ¦ ¦I51T и R201C-мажорные в¦Noshimoto et
al.,1991 ¦
230500; 3p21.33; ¦Галактозидаза ¦в Японии, R482H и W273L¦Suzuki et.
al.,1993 ¦
GLB1.12; кДНК - 2кб ¦бета-1; 677¦мажорные в Европе ¦Mosna et
al.,1992 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Ганглиозидоз GM2-I, ¦1 : 300 000; у¦Миссенс-34;дел.-8;инс.-¦Proia et
al.,1987 ¦
варианты B,B1 и псев-¦евреев 1:3 000¦2;сплайс.-8; Мажорные:у¦Myerowitz et
al.,1988 ¦
до AB;Тея-Сакса б-знь¦Гексозаминида-¦евреев-инс.4 н.-70%,спл¦Arpaia et
al.,1988 ¦
272800; 15q23-q24; ¦за A, альфа ¦айс.-20%;G269S-взр.-20%¦Navon et
al.,1989 ¦
HEXA.52; 35 кб, 14экз¦ 529¦не евреи - R247W - 32% ¦Triggs-Raine
et al.,1992¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Ганглиозидоз GM2, тип¦1 : 300 000 ¦Миссенс -5; делеции -2;¦Proia: 1988
¦
II,Зандхоффа болезнь,¦ ¦инсерции - 2; Мажорные:¦Neote et
al.,1990 ¦
268800; 5q13; ¦Гексозаминида-¦16-кб делеция 1-5 экз.-¦Wakamatusi et
al.,1992 ¦
HEXB.9; 40 кб, 14экз.¦за B,бета; 556¦27%;делеция 50кб; P417K¦McInnes et
al.,1992 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Ганглиозидоз-GM2, AB ¦Очень редко ¦Миссенс -3: C107R; ¦Heng et
al.,1993 ¦
вариант, ¦ ¦R169P; C138R (1 пациент¦Schroder et
al.,1993 ¦
272750; q31.3-q33.1;¦GM2-активатор-¦гомозиготен) ¦
¦
GM2A.3; ¦ный белок; 193¦ ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Гоше болезнь; глико- ¦1:600 у евреев¦Миссенс -30;инс.-1;деле¦Sorge et
al.,1985 ¦
сфинголипидоз, ¦изол. в Швеции¦ции-3;сплайс.-1; Мажор-¦Sorge et
al.,1987 ¦
230800; 1q21; ¦Глюкоцеребро- ¦ные (98%):N370S, L444P,¦Beutler et
al.,1992 ¦
GBA.36; ¦зидаза; 644¦R463C,84insG;IVS2+1 G-A¦Horowitz et
al.,1994 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Лейкодистрофия глобо-¦1 : 50 000 в ¦Нонсенс мутация:E369TER¦Zlotogora et
al.,1990 ¦
ид-клеточная, Краббе,¦Швеции ¦ ¦Sakai et
al.,1994 ¦
245200; 14q21-q31; ¦Галактозилцера¦ ¦
¦
GALC.1; кДНК -3.78 кб¦мидаза 669¦ ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Лейкодистрофия ¦1 : 100 000 ¦Миссенс -7; делеции -2;¦Stein et
al.,1989 ¦
метахроматическая, ¦ ¦сплайс. -2; регулят. -1¦Polten et
al.,1991 ¦
250100; 22q13.31-qter¦Арилсульфатаза¦Мажорные:P426L и сплайс¦
¦
ARSA.12; 8 экз¦A 507¦2 -70%, регулят. - 1-2%¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Лейкодистрофия мета- ¦Редко ¦Миссенс -4: T23I,T216I,¦Rorman et
al.,1992 ¦
хроматическая, SAP1 ¦ ¦C241S,F385C; ¦Wenger et
al.,1989 ¦
деф.; Гоше б-нь, ¦ ¦инсерция 33 н. -1; ¦
¦
176801; 10q21-q22; ¦Просапозин ¦регуляторная мутация в ¦
¦
PSAP.6; 20 кб, 13экз.¦ 511¦инициирующем кодоне -1 ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Лизосомальной кислой ¦ ¦ ¦Pohlmann et
al.,1988 ¦
фосфатазы деф., ¦Кислая фосфата¦ ¦
¦
171650; 11p12-p11; ¦за 2, лизосом-¦ ¦
¦
ACP2.; кДНК-2.1 кб ¦ная 423¦ ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Липидоз сфингомиелино¦Редко ¦Миссенс - 8; делеции -3¦Quintern et
al.,1989 ¦
вый;Ниманна-Пика бо- ¦ ¦Мажорные:тип A евреи: ¦Levran et
al.,1991 ¦
лезнь,тип A/B, ¦ ¦R496L,L302P,дел.1н.P330¦Schuchman et
al.,1992 ¦
257200; 11p15.4-p15.1¦Сфингомиелина-¦в комплексе 65%; тип B ¦Suchi et
al.,1992 ¦ ¦
SMPD1.11; ¦за 629¦Сев.Африка R608del->80%¦Takahashi et
al.,1992 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Ниманна-Пика болезнь,¦Очень редко ¦ ¦Carstea et
al.,1993 ¦
тип C, ¦ ¦ ¦Kurimasa et
al,1993 ¦
257220; 18p; ¦ ¦ ¦
¦
NPC.; ¦ ¦ ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Ниманна-Пика болезнь,¦Очень редко ¦ ¦Winsor et
al.,1978 ¦
тип D, ¦ ¦ ¦
¦
257250; ¦ ¦ ¦
¦
¦ ¦ ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Маннозидоз, альфа B, ¦50-100 случаев¦ ¦Kaneda et
al.,1987 ¦
лизосомальный, ¦Лизосомальная ¦ ¦
¦
248500; 19p13.2-q12;¦альфа-D-манно-¦ ¦
¦
MANB.; ¦зидаза B ¦ ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Маннозидоз, бета, ¦Очень редко ¦ ¦Lundin,1987
¦
¦Лизосомальная ¦ ¦
¦
248510; chr.4?; ¦бета маннози- ¦ ¦
¦
MANB1.; ¦даза ¦ ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
MASA синдром (сложная¦Редко ¦ ¦Schrander-
Stumpel ¦
спастическая парапле-¦ ¦ ¦et al.,1990
¦ ¦
гия), 303350; Xq28; ¦Маннозосвязыва¦ ¦Rosenthal et
al.,1992 ¦
MASA.; ¦ющий лектин248¦ ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Мукополисахаридоз 1; ¦1:100 000, ¦Нонсенс -4; миссенс -3;¦Scott et
al.,1991 ¦
Гурлера синдром;Шейе,¦1:600 000-Шейе¦сплайс. -1; дел. 1н. -1¦Scott et
al.,1992 ¦
252800; 4p16.3; ¦Альфа-L-идуро-¦Мажорные: W402X (31%), ¦Moskowitz et
al.,1993 ¦
IDUA.9; 19 кб, 14экз.¦нидаза 653¦Q70X (15%), P533R (3%) ¦Scott et
al.,1993 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Мукополисахаридоз II;¦1:70 000 в Из-¦20% -крупные делеции,из¦Wilson et
al.,1990 ¦
Хантера синдром, ¦раиле ¦них 4,5 % -всего гена; ¦Bunge et
al.,1993 ¦
309900; Xq28; ¦Идуронат-2- ¦делеции 1-3н-7;миссенс-¦Flomen et
al.,1993 ¦
IDS.29; 24 кб, 9 экз.¦сульфатаза 550¦13;нонсенс -4;сплайс.-5¦Hopwood et
al.,1993 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Мукополисахаридоз ¦1 : 24 000 в ¦ ¦Kresse et
al.,1971 ¦
IIIA,Санфилиппо синд-¦Нидерландах ¦ ¦
¦ ром A, 252900; ¦(все типы A-D)¦ ¦
¦
¦ ¦ ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Мукополисахаридоз ¦Наиболее часто¦ ¦Pande et
al.,1992 ¦
IIIB,Санфилиппо синд-¦на юге Европы ¦ ¦
¦ ром B, 252920;Chr.17?¦ ¦ ¦
¦
¦ ¦ ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Мукополисахаридоз III¦Редко ¦ ¦Zaremba et
al.,1992 ¦
C, Санфилиппо синдром¦ ¦ ¦
¦
C, 252930;Chr.14 или ¦ ¦ ¦
¦
21?; ¦ ¦ ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Мукополисахаридоз III¦Редко ¦ ¦Robertson et
al.,1988a ¦
Санфилиппо синдром D,¦N-ацитил-глюко¦ ¦Robertson et
al.,1988b ¦
252940; 12q14; ¦зоамин-6-суль ¦ ¦
¦
GNS.; ¦фатаза 552¦ ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Мукополисахаридоз IYA¦1 : 300 000 ¦Миссенс - 3: N204K, ¦Tomatsu et
al.,1991 ¦
Моркио синдром, ¦ ¦A138V, R386C; ¦Tomatsu et
al.,1992 ¦
253000; 16q24.3; ¦Галактозамин-6¦делеция 2 н. - 1 ¦Masuno et
al.,1993 ¦
GALNS.4; ¦сульфатаза 522¦ ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Мукополисахаридоз YI;¦Редко ¦Миссенс - 4: C137V, ¦Litjens et
al., 1989 ¦
Марото-Лами синдром, ¦ ¦C117R, L236P, C405Y; ¦Schuchman et
al.,1990 ¦
253200; 5q11-q13; ¦Арилсульфатаза¦делеция 1н. - 1 ¦Jin et
al.,1992 ¦
ARSB.5; ¦B 533¦ ¦Litjens et
al., 1992 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Мукополисахаридоз YII¦Очень редко ¦Миссенс - 5: A619V, ¦Guise et
al.,1985 ¦
Слая синдром, ¦ ¦R382C, R216W, R354W, ¦Oshima et al.,
1987 ¦
253220, 7q21.11; ¦Бета-глюкуро- ¦R611W ¦Miller et
al.,1990 ¦
GUSB.5; 21 кб, 12экз.¦нидаза 651¦ ¦Tomatsu et
al.,1991 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Сиалидоз типы I и II;¦50-100 случаев¦ ¦Oohira et
al.,1986 ¦
липомукополисахаридоз¦ ¦ ¦Klein et
al.,1986 ¦
256550; 6p21.3; ¦Нейраминида- ¦ ¦Sasagasako et
al.,1993 ¦
NEU.; ¦за-1 ¦ ¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Фукозидоз, ¦30-60 случаев ¦Нонсенс - 5:Q351X-мажор¦Fowler et
al.,1986 ¦
¦Фукозидаза аль¦ная (20%), E375X, Q77X,¦Kretz et
al.,1992 ¦
230000; 1p34; ¦фа-L-1,ткане- ¦W382X, Y211X;делеции -4¦Roychoudhuri
et al.,1988¦
FUCA1.10; 23 кб, 8экз¦вая 461¦(экз2-1,1н-3);сплайс.-1¦Seo et
al.,1993 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
----------
1) - через ";" указаны различные наименования болезней либо аллельные варианты
2) - после наименования гена через "." указано количество идентифицированных мутантных аллелей к июлю 1994г.
3) - размеры генов указаны в килобазах (кб), иногда вместо размеров гена указаны размеры кДНК или мРНК
4) - размеры белка указаны в правом нижнем углу
5) - при количестве мутаций, меньшем 5, все они указываются после знака ":", при большем количестве перечисляются только типы мутаций
96) - частоты заимствованы из сводной таблицы Scriver et al., 189.
Сокращения - взр.- взрослые; дел.- делеция; дупл.- дуплика- ция; инс. - инсерция; н.- нуклеотиды; сплайс. - замена нуклеотидов в донорном или акцепторном сайтах сплайсинга или мутации в интронных об- ластях, создающие новый сайт сплайсинга; экз.- экзон
Из таблицы 10.1 следует, что для 29 из 31 лизосомных болезней определена хромосомная локализация гена, причем в
26 случаях - абсолютно однозначно. 23 лизосомных гена клони- рованы. Для 20 лизосомных заболеваний описаны различные му- тантные аллели, что подтверждает правильность идентификация соответствующих генов (см.Главу III). Для 12 заболеваний на- йены мажорные мутации в различных популяциях. Для 8 заболе- ваний общее количество идентифицированных мутаций пока не превысило шести и, возможно, мажорные мутации для них еще будут идентифицированы.
Спектр мутаций в разных лизосомных генах очень разнооб- разен. Так, при болезни Фабри наряду с явным преобладанием миссенс мутаций обнаружено 14 внутригенных перестроек разме- рами от 0.4 до 8 кб, многие из которых имеют точки разрыва в экзоне 2 - области локализации большого числа Alu-повторов.
Сам ген GLA содержит 12 различных Alu-элементов, составляю- щих около 30% его длины. В местах разрывов часто обнаружива- ются короткие прямые и обращенные 2-6 нуклеотидные повторы.
Одним из возможных механизмов возникновения структурных пе- рестроек в данном гене может быть незаконная Alu-Alu реком- бинация или, что более вероятно, рекомбинация между коротки- ми повторами. Участие Alu-элементов предполагается также при возникновении 16-кб делеции промоторной области и первых 5-и экзонов гена HEXB - мажорной мутации при болезни Зандхоффа.
Нарушение процесса рекомбинации является, по-видимому, при- чиной возникновения очень большого числа крупных и мелких делеций в IDS-гене при синдроме Хантера. Высокая концентра- ция CpG динуклеотидов рассматривается как возможный эндоген- ный механизм возникновения мажорной среди евреев-ашкенази мутации P330FS в гене SPDM1 при болезни Ниманна-Пика типа B, так как эта делеция возникает в районе, где из 10 остатков 9 составляют цистеины.
Делеции целых экзонов или инсерции интронных областей возникают сравнительно часто в результате точковых мутаций в донорных или акцепторных сайтах сплайсинга. Примерами являют- ся мажорная в Японии сплайсинговая мутация, сопровождающаяся делецией 7-го экзона гена- PPGB, приводящая к галактосиалидо- зу и сплайсинговая мутация IVS2+1, обусловливающая вырезание экзона 2 гена GBA при болезни Гоше. Появление в результате точковой мутации в интронной области нового сайта сплайсинга также может сопровождаться структурными перестройками. Тако- ва, в частности, природа 33-нуклеотидной инсерции в гене PSAP при метахроматической лейкодистрофии, обусловленной дефицитом
SAP1; 24-кб инсерции в гене HEXB при болезни Зандхоффа и
5-нуклеотидной инсерции в гене IDUA при синдроме Шейе. Важно отметить, что подобные мутации совместимы с образованием не- большого числа функционально активных мРНК, следствием чего является относительно более мягкое течение соответствующих форм заболеваний.
В некоторых случаях возникновению мутаций может способствовать наличие псевдогена. Молекулярный анализ псев- догена, тесно сцепленного с геном GBA, показал, что, по крайней мере, 4 мутации, обнаруженные у пациентов с болезнью
Гоше, присутствуют в норме в псевдогене. Это 2 мажорные му- тации - L444P и IVS2+1 и еще 2 миссенс мутации в 10-м экзоне
(A456P и V460V). Подобное сходство несомненно указывает на фундаментальную роль псевдогена в образовании мутаций в
GBA-гене. В то же время само по себе присутствие псевдогена не является мутагенным фактором, особенно если сам ген и его псевдоген локализованы в разных хромосомах, как, например, в случае генов GM2A и FUCA1, псевдогены которых находятся в хромосоме 3 и в области 2q31-q32, соответственно.
Для двух лизосомных болезней - фукозидоза и синдрома
Гурлера, мажорными являются нонсенс мутации. Более того, при фукосидозе все известные к настоящему времени мутации приво- дят к полному отсутствию продукта FUCA1-гена. Так, наряду с мажорной мутацией Q351X, представленной в 20% хромосом у больных фукосидозом, описаны еще 4 нонсенс мутации и 4 деле- ции со сдвигом рамки считывания. При синдроме Гурлера две мажорные нонсенс мутации - W402X и Q70X, составляют около
50% всех известных мутантных аллелей гена IDUA. Кроме того, при этом заболевании зарегистрированы еще 4 минорные по частоте нонсенс мутации и 1 делеция со сдвигом рамки считы- вания. 3 миссенс мутации и интронная мутация, создающая до- полнителный сайт сплайсинга в гене IDUA, не приводят к пол- ному блоку синтеза идуронидазы и реализуются в виде синдрома
Шейе. Уместно заметить, что оба заболевания - синдром Гурле- ра и синдром Шейе, являются классическим примером фенотипи- ческого разнообразия, обусловленного существованием аллель- ных серий (см.Главу IV). Такой спектр крайне тяжелых мутаций нельзя объяснить только повышенной частотой их возникнове- ния. Более вероятным представляется предположение о том, что кодируемые FUCA1- и IDUA-генами белки обнаруживают опреде- ленную устойчивость к небольшим повреждениям и сохраняют функциональную активность при определенных аминокислотных заменах, то есть миссенс аллели в этих генах проявляют себя как нейтральные мутации и не приводят к развитию заболева- ний.
Хорошо известно, что распространение мутаций в популя- циях определяется не только, и не столько повышенной часто- той их возникновения, но многими другими популяционно-гене- тическими факторами и, в первую очередь, связано с эффектом основателя (см.Главу V). Типичным следствием эффекта основа- теля, как известно, является наличие различных мажорных по частоте мутаций одного и того же гена у пациентов разных изолятов и этнических групп. Подобная картина наблюдается, в частности, при ганглиозидозе GMI. Так, в Японии мажорными при этом заболевании являются миссенс мутации I51T и R201C, тогда как в Европе преобладают мутации R482H и W273L. Эффек- том основателя можно объяснить высокую частоту аспартилглю- козаминурии в Финляндии, так как в 98% случаев у пациентов финского происхождения заболевание обусловлено присутствием одной и той же миссенс мутации C163S, резко уменьшающей ак- тивность аспартилглюкозаминидазы. Интересно отметить, что эта мутация у больных находится в сильном неравновесном сцеплении с другой миссенс мутацией в AGA-гене - R161Q, яв- ляющейся, в свою очередь, редкой формой полиморфизма. Невоз- можно, однако, исключить возможность комбинированного влия- ния этих двух мутаций на фенотип.
Яркие примеры этнических различий по частоте и спектру мажорных мутаций выявляются при анализе таких лизосомных бо- лезней накопления как болезнь Тея-Сакса, Ниманна-Пика и бо- лезнь Гоше. Прежде всего, эти заболевания особенно распрост- ранены среди евреев-ашкенази, среди которых они встречаются в десятки раз чаще, чем в других популяциях европейского или азиатского происхождения. Наличие специфических мажорных му- таций для всех трех заболеваний у 70 - 95% всех пациентов еврейского происхождения скорее всего нельзя обьяснить толь- ко эффектом основателя. Генетический дрейф, селективное пре- имущество гетерозигот, характер миграции, социальные и рели- гиозные особенности, обусловливающие ассортативность образо- вания супружеских пар - вот те факторы, которые, по всей ви- димости, лежат в основе этих различий. В этой связи инте- ресно отметить, что среди пациентов других национальностей мажорные мутации гомологичных генов, как правило, иные, чем у евреев-ашкенази. Так, болезнь Ниманна-Пика типа B часто встречается среди жителей стран, расположенных в западной части Северной Африки. Однако, в 80% случаев заболевание связано с делецией R608 в SMPD1-гене, которая не является мажорной среди евреев-ашкенази.
На примере лизосомных болезней могут быть хорошо прослежены корреляции между типами мутаций и клиническими особенностями заболеваний. Выше уже упоминалось об аллельных вариантах гена IDUA, приводящих либо к синдрому Гурлера, ли- бо к синдрому Шейе. Разные миссенс мутации в гене NAGA при- водят к болезни Шиндлера или к болезни Канзаки (Табл.
10.1.). Важное значение для анализа молекулярных основ пато- генеза заболеваний имеют специфические мутации с поздней фе- нотипической манифестацией (так называемые взрослые формы).
Такие мутации обнаружены в соответствующих генах при болез- нях Тея-Сакса и галактосиалидозе. Очень интересен случай различного фенотипического проявления на разном расовом ге- нетческом фоне одной и той же мутации - мажорной 16-кб деле- ции, обнаруживаемой у 27% пациентов с детской формой болезни
Зандхоффа (McInnes et al.,1992; Sidransky et al.,1994). В частности, в одной франко-канадской семье эта мутация в ком- паунде с миссенс мутацией P417L, описанной впервые в Японии у пациента с подростковой формой заболевания, провлялась как взрослая форма с очень мягким течением заболевания.
В ряде случаев удалось проанализировать молекулярную природу совместного влияния двух аллелей одного гена на фе- нотип. К примеру, при некоторых форм метахроматической лей- кодистрофии трудность молекулярной диагностики заболевания связана с существованем, так называемого, псевдодефицитного аллеля ARSA-гена. Этот полиморфный аллель встречается в по- пуляциях с достаточно высокой частотой, так что гомозиготы по нему состаляют 1 - 2% всего населения. Оказалось, что псевдодефицитный аллель представляет из себя сочетание двух мутаций в цис-положении. Одна из них - 3'-концевая ругуля- торная мутация в первом сайте после стоп кодона, изменяет сигнал полиаденилирования. Другая - миссенс мутация в 6-м экзоне, приводит к потере сайта N-гликозилирования. Попутно отметим, что для гена ARSA (также как и для IDUA-гена) обна- ружен альтернативный сплайсинг, в результате которого в фиб- робластах и печени образуются 2 различных типа мРНК, разме- ром 2.1 кб и 3.9 кб, соответственно. У гомозигот по псевдо- дефицитному аллелю в фибробластах отсутствует 2.1 кб мРНК, при этом клинических проявлений заболеваний не наблюдается.
Однако, при наличии S96F мутации в ARSA-гене на фоне псевдо- дефицитного аллеля развивается тяжелая форма лейкодистрофии.
В заключении раздела кратко рассмотрим состояние проб- лемы генокоррекции лизосомных заболеваний. В литературе отсутствуют сообщения об успешных клинических испытаниях программ генотерапевтического лечения этих заболеваний, од- нако, по крайней мере, для некоторых лизосомных болезней та- кие программы уже разработаны и утверждены (см.Главу IX,
Табл.9.2). Имеются сведения о положительных результатах та- ких исследований на культурах мутантных клеток и на модель- ных животных. Так, в опытах in vitro был осуществлен успеш- ный ретровирусный перенос нормальной кДНК гена GBA в культу- рах мутантных фибробластов (Sorge et al.,1987) и в культурах клеток крови пациентов с болезнью Гоше (Fink et al., 1990), в результате чего была достигнута коррекция глюкоцеребрози- дазной активности. Такая же коррекция метаболическоих дефек- тов при болезни Ниманна-Пика и при синдроме Хантера была достигнута путем введения в соответствующие мутантные линии клеток нормальных кДНК генов SMPD1 и IDS соответственно. При этом активность идуронат-2-сульфатазы после ретровирусной трансдукции in vitro оказалась существенно выше нормальной и рекомбинантный фермент активно участвовал в метаболизме глю- козамногликанов. Генокоррекция первичного биохимического де- фекта при мукополисахаридозе YII (синдром Слая) была получе- на как in vitro, путем ретровирусного переноса нормального гена GUSB в мутантные фибробласты человека, так и in vivo на собаках и мышах. При этом у больных собак нормальный белок
(бета-глюкуронидаза) не только экспрессировался, но появ- лялся в лизосомах и восстанавливал процессинг специфических глюкозоаминогликанов (Wolf et al., 1990). Введение этого же гена (GUSB) в мутантные стволовые клетки мышей приводило к длительной экспрессии бета-глюкуронидазы, снижению лизосо- мального накопления в печени и мозге и частичной коррекции болезни у трансгенных животных (Wolf et al.,1992). В другом эксперименте GUBS-кДНК вводили в культивируемые мутантные фибробласты кожи мышей и затем трансдуцированные клетки имп- лантировали подкожно мутантным мышам. У всех животных наблю- дали экспрессию введенного гена и полное исчезновение ли- зосомальных отложений в печени и в мозге (Sly, 1993). Полу- ченные результаты подтверждают принципиальную возможность лечения, по крайней мере, некоторых лизосомных болезней с помощью методов генной терапии.
Раздел 10.3. Болезни экспансии, вызванные "динамически- ми" мутациями.
Обнаруженный в 1991г. новый тип так называемых динами- ческих мутаций и связанные с ними наследственные заболевания частично рассматривались нами в Главе IV. Однако их уникаль- ность, необычный механизм экспрессии, особенности наследова- ния, быстрый рост нозологий, обусловленных подобными наруше- ниями в последовательности ДНК, и, как оказалось, достаточно широкая распространенность (см.Табл.9.2) делают целесообраз- ным их более подробный анализ.
Как упоминалось, этот тип мутаций пока найден только у человека и не зарегистрирован ни у одного вида млекопитающих или других хорошо изученных организмов (дрозофила, нематоды и пр.). Суть мутаций заключается в нарастании числа триплет- ных повторов, расположенных в регуляторной или в кодирующей, а значит и в транслируемой части генов. Впервые такой тип мутации был обнаружен при молекулярном анализе синдрома фра- гильной (ломкой) Х-хромосомы, наследственная передача кото- рой не подчинялась обычным менделевским законам. В дальней- шем аналогочные динамические мутации были описаны и при 7 других наследственных заболеваниях, контролируемых генами, расположенными на разных хромосомах - Таблица 10.2. Вместе с тем, все нижеперечисленные нозологии имеют ряд общих призна- ков, позволяющих объеденить их в одну самостоятельную груп- пу. Прежде всего, для триплетных повторов, экспансия которых блокирует функцию гена, характерен выраженный популяционный полиморфизм, причем число аллелей может варьировать от еди- ниц до нескольких десятков. Другой их особенностью является доминантный тип наследования, характерный как для Х-сцеплен- ных генов, так и для генов, находящихся на аутосомах. Осо- бенностью практически всех болезней "экспансии" является также эффект антиципации (ожидания), смысл которого заключа- ется в нарастании тяжести симптомов заболевания в последую- щих поколениях, что, как оказалось, является результатом на- копления ("экспансии") исходного числа триплетов после того как их количество возрстает больше нормального. Характерными для этих нозологий являются и особенности их передачи по- томству: для некоторых заболеваний типична передача по мате- ринской (Fra-X, миотоническая дистрофия), а для других - преимущественно по отцовской линии (хорея Гентингтона).
Практически для всех "динамических" мутаций характерно пора- жение головного мозга и особенно подкорковых структур, при- чем тяжесть заболевания и его начало четко коррелируют с числом повторов. Молекулярный анализ этих генов позволяет предполагать определенное сходство механизма экспансии трип- летов, которая, по всей вероятности, происходит в митозе, затрагивает чаще аллели с начально большим числом повторов, при этом нередко сигналом экспансии является утрата негомо- логичного триплета, в норме разделяюего цепочку монотонных повторов. Вместе с тем, патогенетические механизмы проявле- ния мутаций экспансии принципиально различны. В случае раз- личных вариантов FRAX мутаций наблюдается блок экспрессии соответствующих генов вследствие стабильного метилирования области CpG островка в промоторной части генов. При миотони- ческой дистрофии нарушение экспрессии, по-видимому связано с ошибками взаимодествия транскрибируемой нити ДНК с нуклеосо- мами. В случае остальных сугубо нейродегенеративных заболе- ваний (хорея Гентингтона, спинально-бульбарная мышечная ат- рофия и др.) экспрессия гена не нарушена, однако, образую- щийся белковый продукт с необычно длинной полиглутаминовой цепочкой каким-то образом нарушает процессы нормального ме- таболизма нервных клеток подкорковых отделов мозга.
Таким образом, причиной повреждающего действия одних
"динамических" мутаций является блок генной экспрессии, то есть потеря функции (loss-of-function mutation), тогда как другие мутации того же типа, связанные с нейродегенративными заболеваниями, ведут к появлению белковых продуктов с ано- мальными функциями ( мутации типа -gain-of-function). Инте- ресно отметить, что помимо динамических мутаций для каждого названного гена обнаружены единичные точковые мутации, число которых крайне невелико. Для каждой болезни "экспансии" раз- работан свой вариант диагностики, основанный на ПЦР. Ампли- фикация области триплетных повторов и дальнейший электрофо- ретический анализ синтезированных продуктов позволяет опре- делить число повторов, то есть провести генотипирование ал- лелей. Вместе с тем, при числе повторов более 200, амплифи- кация с помощью ПЦР обычно не достигается. В этих случаях размеры участка повторов определяются методом блот-гибриди- зации с соответствующими ДНК зондами. Например, используются зонды StB12.3, Ох1.9 или Ох 0.55 в случае синдрома FRAXA; зонд cDNA25 в случае миотонической дистрофии.
Подробней с этой интересной группой заболеваний можно ознакомиться в ряде обзоров (Willems, 1994; Баранов и др.,1993; Иллариошкин и др., 1995).
Таблица 10.2. Болезни экспансии, вызванные динамическими му- тациями.
-----------------------T-----------T-------T-----T------T------T------------
----------¬
Болезнь, номер по ¦ Ген, лока-¦Триплет¦Норма¦Прему-¦Мута- ¦Литература
¦
МакКьюсику (MIM) ¦ лизация ¦ ¦ ¦тация ¦ция ¦
¦
-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------
----------+
Синдром ломкой X-хро- ¦FMR1, FRAXA¦(CGG)n ¦5-50 ¦50-90 ¦>90 ¦Rousseau et
al.,1991 ¦
мосомы; 309550¦Xq27.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Hirst et
al.,1991 ¦
-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------
----------+
Синдром ломкой X-хро- ¦FMR2, FRAXE¦(CGG)n ¦6-25 ¦25-200¦>200 ¦Knight et
al.,1994 ¦
мосомы тип 2; 309548¦Xq27.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦
-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------
----------+
Миотоническая дистро- ¦DM, MP-1 ¦(CTG)n ¦5-10 ¦19-30 ¦>30 ¦Shelbourne
et al.,1992¦
фия; 160900¦19q13.3 ¦ ¦ ¦ ¦
¦Wieringa,1994 ¦
-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------
----------+
Хорея Гентингтона; ¦HD, IT-15 ¦(CAG)n ¦6-37 ¦ ¦37-
121¦Huntington's Dis. ¦
143100¦4p16.3 ¦ ¦ ¦ ¦
¦Collab.Res.Group,1993 ¦
-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------
----------+
Спинально-мозжечковая ¦SCA1 ¦(CAG)n ¦6-39 ¦ ¦41-81 ¦Orr et
al.,1993 ¦
атаксия тип 1; 164400¦6p21.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Chung et
al.,1993 ¦
-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------
----------+
Денто-рубральная-палли-¦DRPLA, B-37¦(CAG)n ¦7-34 ¦ ¦54-75 ¦ Koide et
al.,1994 ¦
до-люисовая дегенерация¦12pter-p12 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Nagafuchi
et al.,1994¦
125370¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦
-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------
----------+
Спинально-бульбарная ¦AR ¦(CAG)n ¦12-33¦ ¦40-62 ¦La Spada et
al.,1991 ¦
мышечная атрофия;313200¦Xq11-q12 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦
-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------
----------+
Спинально-мозжечковая ¦MJD ¦(CAG)n ¦13-36¦ ¦68-79 ¦Kawaguchi
et al.,1994 ¦
дегенерация Мачадо- ¦14q32.1 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦
Джозефа ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦
-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------
-----------
Раздел 10.4. Моногенные наследственные болезни, диаг- ностируемые молекулярными методами в России.
Сводка, представленная в таблице 10.3, составлена на основании анализа работ основных отечественных лабораторий и публикаций, связанных с проблемой молекулярной диагностики наследственных болезней. Сводка не является исчерпывающей и включает преимущественно те заболевания для которых возможна или уже проводится диагностика на внутриутробных стадиях развития (Баранов, 1994).
Таблица 10.3. Моногенные наследственные болезни, диагности- руемые молекулярными методами и доступные пренатальной диаг- ностике в России.
-----T-----------------------------------T------------------¬
¦N пп¦ Болезни ¦Медицинские центры¦
+----+-----------------------------------+------------------+
¦1 ¦ Муковисцидоз ¦ИАГ;ИЭМ РЦМГ; ТИМГ¦
¦2 ¦ Миодистрофия Дюшенна/Беккера ¦ИАГ;РЦМГ; ТИМГ ¦
¦3 ¦ Гемофилия А ¦ИАГ; ГНЦ; ¦
¦4 ¦ Гемофилия В ¦ИАГ; ГНЦ ¦
¦5 ¦ Фенилкетонурия ¦ИАГ; ГНЦ;ПМА;РЦМГ ¦
¦6 ¦ Синдром ломкой Х-хромосомы ¦ИАГ; ¦
¦7 ¦ Миотоническая дистрофия ¦ИАГ ¦
¦8 ¦ Болезнь Виллебранда ¦ИАГ;ГНЦ ¦
¦9 ¦ Хорея Гентингтона ¦ИАГ; РЦМГ; НИИН ¦
¦10 ¦ Болезнь Леш-Нихана ¦ИАГ ¦
¦11 ¦ Спинально-бульбарная мышечная ¦ИАГ; НИИН ¦
¦ ¦ атрофия ¦ ¦
¦12 ¦ Гепато-лентикулярная дегенерация ¦РЦМГ; ИАГ ¦
¦13 ¦ Болезнь Хантера ¦ИАГ ¦
¦14 ¦ Адрено-генитальный синдром ¦ЦОЗМиР; РЦМГ ¦
¦15 ¦ Атаксия Фридрейха ¦ГНЦ ¦
¦16 ¦ в- Талассемия ¦ГНЦ; ПМА ¦
¦17 ¦ Болезнь Верднига-Гоффмана ¦РЦМГ ¦
¦18 ¦ Дефицит альфа-1-антитрипсина ¦ИЭМ ¦
¦19 ¦ Семейная гиперхолестеринемия ¦ИЭМ; ПМА ¦
¦20 ¦ Предрасположенность к инсулин- ¦ПМА ¦
¦ ¦ зависимому диабету ¦ ¦
¦21 ¦ Дефицит ацил-СоА дегидрогеназы ¦ПМА ¦
L----+-----------------------------------+-------------------
ИАГ - Институт Акушерства и Гинекологии РАМН, Санкт Петербург
ИЭМ - Институт Экспериментальной Медицины РАМН, Санкт Петербург
ПМА - Педиатрическая Медицинская Академия, Санкт Петербург
РЦМГ- Российский Центр Медцинской Генетики РАМН, Москва
ГНЦ - Гематалогический Научный Центр МЗ РФ, Москва
ТИМГ- Томский Институт Медицинской Генетики, Томск
НИИН- Научно-исследовательский Институт Неврологии РАМН, Москва
ЦОЗМиР- Центр Охраны Здоровья Матери и Ребенка, Москва
Молекулярные характеристики некоторых из приведенных в таблице заболеваний уже были рассмотрены в разделах 10.1 и
10.2. Отдельные аспекты, касающиеся идентификации соот- ветстующих генов, их картирования, клонирования и сканирова- ния мутаций уже упоминались в качестве примеров при изложе- нии соответствующих вводных глав монографии (см.Главы II,
III, IV, V). В этой части нам представляется целесообразным суммировать эти разрозненные сведения и охарактеризовать те наиболее частые, социально значимые моногенные заболевания, в отношении которых у нас накоплен достаточно большой собственный опыт молекулярных исследований. Список этих но- зологий, их частоты и основные молекулярные характеристики приведены в Таблице 10.4.
Таблица 10.4. Основные молекулярно-генетические характе- ристики моногенных болезней, диагностируемых в Лаборатории пренатальной диагностики ИАГ
РАМН, Санкт-Петербург.
(примечания в конце таблицы те же, что в Табл.10.1).
---------------------T--------------T-----------------------T---------------
---------¬
Синдромы 1), номер по¦Встречаемость,¦Типы и количество му- ¦Литература
¦
МакКьюсику; хромосом-¦белок, ¦таций 4), мажорные мута¦(локализация и
структура¦
ная локализация; ген ¦размеры в ами-¦ции -в скобках указаны
¦генов,клонирование кДНК,¦
2),размеры 3), экзоны¦нокислотах ¦частоты аллелей у б-ных¦идентификация
мутаций). ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Муковисцидоз; врожден¦1:2500- Европа¦Точковые-преобладающие;¦Rommens et
al., 1989 ¦
ное отсутствие vas de¦1:3800 -Россия¦небольшие дел.и дупл.; ¦Kerem et al.,
1989 ¦
ferens, ¦CF-трансмемб- ¦Мажорные:delF508-30-90%¦Riordan et
al., 1989 ¦
219700; 7q31.2 ¦ранный регуля-¦W1272X-2-33%,3732delA -¦Горбунова и
др., 1991 ¦
CFTR.500; 260кб,27экз¦тор 1480¦4%,394delTT,G542X,R117H¦Баранов и др.,
1995 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Миопатия Дюшенна; Бек¦1:3500 мальчи-¦Делеции протяженные - ¦Kunkel et
al.,1985 ¦
кера;кардиомиопатия ¦ков ¦60%; дупликации - 6-7%;¦Kunkel et
al.,1986 ¦
делеционная, ¦ ¦делеции нескольких н. -¦Koenig et
al.,1988 ¦
310200; Xp21.2 ¦Дистрофин ¦7; нонсенс - 9; сплайс.¦Roberts et
al.,1992a;b ¦
DMD.21; 2000кб,73экз ¦ 3685¦-3; миссенс -1; инс.-1 ¦Ahn et
al.,1993 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Гемофилия А, ¦1:6500 мальч. ¦Делеции экз. - 31; мис-¦Wood et al,
1984 ¦
фактора YIII деф.; ¦Фактор YIII ¦сенс - 21; нонсенс -8 ¦Toole et al.,
1984 ¦
306700; Xq28 ¦свертываемости¦Мажорные: инверсия 26 -¦Higuchi et
al.,1991 ¦
F8C.66; 186 кб, 26экз¦крови 2351¦25 экзонов - 45% семей ¦Naylor et al.,
1993 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Гемофилия B, Кристма-¦1:20000 мальч.¦Миссенс и нонсенс более¦Kurachi et
al., 1982 ¦
са, фактора IX деф.; ¦Фактор IX ¦60%; сплайс.-10%; регу-¦Jagadeeswaran
et al,1984¦
306900, Xq27.1-q27.2 ¦свертываемости¦лят.- 3.5%; делеции -до¦Green et al.,
1991 ¦
F9.400; 34 кб, 8 экз ¦крови 461¦40% при тяжелых формах ¦Giannelli et
al., 1993 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
фон Виллебранда бо- ¦1: 5 - 20 000 ¦Тип I и II-миссенс; Ма-¦Lynch et al.,
1985 ¦
лезнь, ¦Фактор Y111R ¦жорные:R543W,R545C,V553¦Bonthorn et
al., 1986 ¦
193400; 12pter-p12 ¦свертываемости¦M,R578Q.Тип III-делеции¦Cooney et al.,
1991 ¦
F8VWF.22; 178кб,52экз¦крови ¦1 н.в 28экз; нонсенс -4¦Randi et al.,
1991 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Фенилкетонурия; гипер¦1 : 10 -15 000¦Миссенс -62%; нонсенс -¦Guttler, Woo,
1986 ¦
фенилаланинемия, мяг-¦Фенилаланин- ¦13%;сплайс.-13%;делеций¦DiLella et
al., 1986 ¦
кая, 261600; 12q24.1¦гидроксилаза ¦9%; Мажорные: IVS12+1, ¦Cotton, 1990
¦
PAH.70; 90 кб, 13 экз¦ 452¦R408W,R261Q,R158Q,IVS10¦Барановская и
др. 1995 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Леш-Нихана синдром; ¦ ¦Миссенс -53%;небольшие ¦Jolly et al.,
1983 ¦
HPRT-родств. подагра,¦Гипоксантин- ¦структ.перестройки -40%¦Edwards et
al., 1990 ¦
308000; Xq26-q27.2 ¦фосфорибозил ¦сплайс. -5%; нонсенс-2%¦Rossiter et
al., 1991 ¦
HPRT.100; 44 кб,9 экз¦трансфераза217¦Мажорные: R170TER (15%)¦Sculley et
al., 1992 ¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
---------+
Гепато-лентикулярная ¦ ¦Миссенс -15; делеции/ ¦Bull et al.,
1993 ¦
дегенерация Вильсона-¦ ¦инсерция -14;Мажорные -¦Petruchin et
al., 1993 ¦
Коновалова, ¦Медь-транспор-¦H714Q - 31% в Америке, ¦Tanzi et al.,
1993 ¦
277900; 13q14.3-q21.1¦тирующая АТФа ¦22% в России; 1 н. дел.¦Thomas et al.,
1995 ¦
ATP7B.34; ¦за P типа 1434¦H1070Gl-28%;Gl1267L 10%¦
¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
----------
Многим из приведенных в Табл.9.4 заболеваний посвящены обстоятельные обзоры, руководства и монографии, включающие наряду с клиническими данными специальные разделы, посвящен- ные молекулярной природе патологического процесса, характе- ристике гена, его мутаций, их фенотипических проявлений, а так же последним достижениям и перспективам лечения, включая генную терапию. Некоторые из этих публикаций уже были упомя- нуты в предыдущих разделах книги, другие будут процитированы в соответствующих подразделах этой главы. Следует так же упомянуть, что все приведенные нозологии были первыми моно- генными болезнями, которые были исследованы молекулярными методами в нашей стране и для которых, в итоге , были разра- ботаны и оптимизированы с учетом этнических и национальных особенностей аллельного полиморфизма, частот и паттерна му- таций оптимальные схемы молекулярной обследования семей высокого риска с целью пренатальной диагностики и выявления гетерозиготного носительства. Практически все эти исследова- ния проводились в рамках основных научных программ ГКНТ "Ге- ном Человека" и "Приоритетные направления генетики". Обзор отечественных работ по молекулярной диагностике наследствен- ных болезней представлен в ряде научных сводок (Баранов,
1992; 1994; Baranov, 1993; Баранов и др., 1994; Евграфов,
1993).
10.4.1 Муковисцидоз.
Муковисцидоз (кистозный фиброз поджелудочной железы) - самое распространенное моногенное наследственное заболевание у представителей белой расы. Это первая "генная" болезнь, молекулярные основы которой определены методами позиционного клонирования без использования каких-либо данных о структур- ных перестройках в области локализации предполагаемого гена.
Напомним, что обнаружение пациентов с транслокациями или крупными делециями, затрагивающими исследуемый ген, значи- тельно облегчает его картирование и идентификацию, как это было при миопатии Дюшенна, ретинобластоме или хроническом грануломатозе. В области локализации гена муковисцидоза хро- мосомные перестройки, практически, отсутствуют. Подробно об истории открытия гена, его структуре, клонировании, анализе функций, идентификации мутаций можно ознакомиться в следую- щих отечественных работах (Гембицкая, Баранов, 1991; Бара- нов, Гинтер, 1994).
Белковый продукт гена -трансмембранный регуляторный бе- лок муковисцидоза -ТРБМ (cystic fibrosis transmembrane regulator -CFTR), как оказалось, является белком хлорных ка- налов, регулирующих обмен ионов хлора через апикальные мемб- раны всех эпителиальных клеток организма. В зависимости от типа мутаций, их локализации функция гена ТРБМ при муко- висцидозе может быть полностью или частично нарушенной.
К началу 1995г. в гене ТРБМ идентифицировано более 500 мутаций, несколько делеций и дупликаций. Наболее распростра- ненной у жителей Западной Европы и Северной Америки является мутация delF508, приводящая к отстутсвию фенилаланина в 508 положении белка ЕРМБ. В этих странах частота delF508 нахо- дится в пределах 70-85%. В Европе частота мутации обнаружи- вает определенный градиент распространения с севера на юг и с запада на восток, достигая 85% в Дании она уменьшается до
50% в Италии и до 20-30% в Турции. В Европейской части
России она составляет около 50% всех мутантных (CF) хро- мосом. У евреев-ашкенази доминируюшей по частоте является мутация W1282X (33%).
Биохимический анализ клеток пациентов, больных муко- висцидозом, позволил выяснить фенотипические особенности экспрессии мутантных аллелей гена ТРБМ, установить опреде- ленный градиент патологических нарушений на мембранном, кле- точном и организменном уровнях в зависимости от типа мута- ции, её локализации и структуры аномального белкового про- дукта (Баранов, Гинтер,1994). Так, было установлено, что не- которые CFTR- мутации, в том числе и delF508, не препятствуя трансляции, нарушают процессинг белка так, что он не дости- гает апикальной мембраны и не создает хлорный поток. Этим объясняется тяжелая клиника муковисцидоза при подобных нару- шениях (Sheppard et al.,1993). Другие мутации ( R117H, R334W и R347P), выявленные при более мягких формах заболевания, не затрагивают процессинга белка, хлорный канал формируется, но функционирует менее эффективно, чем в норме. Сопоставление процессинга, локализации и функционирования белка в 3-х ли- ниях L-клеток, трансдуцированных нормальным CFTR-геном и двумя его аллельными вариантами, показало, что дефект одной из мажорных мутаций - G551D, связан с частичной инактивацией функции хлорного канала, в то время как delF508, как оказа- лось, обладает комбинированным эффектом - нарушает локализа- цию и стабильность белка и снижает эффективность его функци- онирования в качестве хлорого канала (Yang et al., 1993).
Интересно, что мутация R117H в гомозиготном состоянии, чаще в компаунде с другими аллелями, в том числе с delF508, обна- руживается у пациентов с врожденным отсутствием семявыводя- щих канальцев (vas deferens). При этом клиника муковисцидоза у таких пациентов, как правило, отсутствует или очень стер- та. Это еще один из примеров фенотипического разнообразия, обусловленного аллельными сериями.
В настоящее время в России доступны идентификации по наличию известных мутаций около 65% больных муковисцидозом
(Иващенко,1992; Потапова,1994). Диагностическая ценность основных мажорных мутаций в порядке убывания их частоты сле- дующая delF508 (50%), 3732delA (4,3%), W1282X (2,4%),
394delTT (2,1%); G542X (2,0%) (Иващенко, 1992). Cогласно на- шим данным (Баранов, 1994) молекулярная диагностика муко- висцидоза прямыми методами возможна примерно в 55 -60% се- мей. В случае непрямой диагностики используются полиморфные сайты локусов ДНК, расположенные в непосредственной близости
(IRP, D7S8, D7S23, MET) или внутри самого гена CFTR - ми- нисателлитные последовательности в интронах 6, 8, 17b гена
СFTR (Zielenski et al., 1991; Morral et al., 1991; Chehab et al., 1991; Агбангла и др., 1992; Potapova et al., 1994). При отсутствии мажорных мутаций и информативности по полиморфным сайтам молекулярные исследования могут быть дополнены биохи- мическим анализом амниотической жидкости на содержание фер- ментов микроворсинок кишечника плода (Гобунова и др.,1989;
Баранов и др.,1991).
Методами направленного мутагенеза (gene targeting см. Главу VIII) в различных лаборатория США и Великобритании осуществлено успешное конструирование трансгенных моделей муковисцидоза на мышах (Clarke, et al., 1992; Colledge et al., 1992; Dorin et al., 1992; Snouwaert et al., 1992). Вы- яснены признаки сходства и некоторые межвидовые различия проявления мутации гена CFTR у мышей и человека. Показано, что различные мутации этого гена по-разному реализуются в фенотипе СFTR дефицитных мышей. Так, в одной из трансгенных линий отмечено преимущественное поржаение легких, у других - поджелудочной железы и кишечника. В одной мутантной линии наблюдается гибель большого числа зародышей от причин, сход- ных с мекониальным илеусом. Таким образом, эти линии представляют собой идеальные модели для исследования молеку- лярных основ патогенеза муковисцидоза, а также для разработ- ки и испытания терапевтических мероприятий, включая геноте- рапию. Как уже отмечалось в предыдущей главе, программы ге- нотерапии муковисцидоза реализуются по крайней мере в 7 центрах США и двух центрах Западной Европы (Великобритания и
Франция). Уже успешно осуществлены не только апробации ген- ноинженерных конструкций на мутантных культурах клеток и мо- дельных животных, но начаты и успешно проводятся клинические испытания генотерапевтического лечения муковисцидоза на 70 пациентах. Исследования по генотерапии муковисцидоза, нача- тые в нашей стране пока проводятся на уровне клеточных куль- тур.
10.4.2 Миодистрофия Дюшенна.
Миодистрофия Дюшенна - сцепленная с полом мышечная дистрофия; выделяют две клинические формы: тяжелую - мио- дистрофию Дюшенна (МД) и гораздо более мягкую - миодистрофию
Беккера (МБ). Ген миодистрофии Дюшенна (DMD) - один из самых крупных известных генов человека, кодирует белок дистрофин, входящий в состав сарколеммы мышечного волокна. При МД дист- рофин либо полностью отсутствует, либо деградирует вскоре после синтеза. При форме Беккера, как правило, дистрофин присутствует, хотя и в измененном, чаще всего в укороченном состоянии.
В соответствии с современными представлениями (Ahn,
Kunkel, 1993) огромный DMD-ген находится под контролем слож- ной системы регуляции транскрипции и сплайсинга. По крайней мере, 5 независимых промоторов осуществляют альтернативную специфическую транскрипцию первых экзонов в разных тканях и на разных стадиях эмбрионального развития. 3 промотора экспрессируют полноразмерную молекулу дистрофина, в то время как 2 осущесвляют экспрессию последних доменов взаимоисклю- чающим способом. Высоко консервативные последовательности 6- и экзонов, кодирующих C-конец белка, альтернативно сплайси- руются, образуя несколько структурно различающихся форм дистрофина, осуществляющих различные функции. Так, идентифи- цирована 6.5-кб мРНК, транскрибируемая с DMD-гена и являюще- еся, по-видимому, его основным продуктом в не-мышечных тка- нях, включая мозг (Bar et al.,.1990). Соответствующий белок значительно отличается от дистрофина и его уровень в некото- рых не-мышечных тканях сопоставим с количеством дистрофина в мышцах. Описан также 4.8-кб транскрипт того же локуса, экспрессирующийся во многих типах тканей, но особенно в
Шванновских клетках проводящей нервной системы, где сам дистрофин отсутствует (Blake et al., 1992). Этот белок полу- чил название апо-дистрофин-1. Клонирован и секвенирован еще один 2.2-кб транскрипт DMD-гена, кодирующий аподистро- фин-3, экспрессирующийся в позднем эмбриогенезе (Tinsley et al., 1993).
В 60% случаев в гене DMD у больных мальчиков обнаружи- ваются протяженные делеции, захватывающие от одного до нескольких соседних экзонов и сосредоточеные, обычно, в двух
"горячих" районах - в области 5'-конца гена (экзоны 6-19) и в 3'- конце (экзоны 40-53), при этом 30% делеций локализова- ны в проксимальной части гена и 70% - в дистальной. Прокси- мальные делеции возникают, по-видимому, в раннем эмбриогене- зе и имеют больше шансов стать "семейными" мутациями.
Дистальные делеции возникают позднее и чаще встречаются, как изолированные случаи. Считается, что в спорадических случаях повторный риск рождения больного ребенка при проксимальной делеции составляет 30%, тогда как при дистальной - только 4%
(Passos-Bueno et al., 1992).
Отмечены популяционные особенности паттерна делеций в разных европейских популяциях, а также в популяциях России и стран СНГ (Baranov et al., 1993). У некоторых пациентов де- летирован не только весь ген, но достаточно протяженные соседние области. Очень часто концы делеций локализованы в центральной части дистрофинового гена. Так в интроне 44, протяженностью 160-180 кб, расположено около 30% точек раз- рыва всех делеций. Показано, что проксимальный конец одной из делеций в интроне 43 расположен внутри транспозон-подоб- ного элемента, принадлежащего THE-1 семейству ретротранспо- зонов (Pizzuti et al.,1992). Описан еще один пациент, у ко- торого делеция оканчивается в THE-1 элементе. Эти элементы, размером 2.3 кб, фланкированные 350-нуклеотидными LTR, пов- торены около 10 000 раз в геноме человека. Гипотеза неста- бильности DMD-гена, вызванная присутствием транспозон-подоб- ного элемента, привлекается также для обьяснения нескольких случаев обнаружения различий в молекулярном дефекте у паци- ентов, принадлежащих одной и той же родословной, то есть имеющих мутацию общего происхождения (Miciak et al.,1992). В
2-х случаях дупликаций из 8, для которых был проведен сик- венс концевых участков, показано присутствие Alu-элементов.
В остальных 6 случаях рекомбинация осуществлялась между не- гомологичными последовательностями (Hu, Worton, 1992).
Прямой корреляции между тяжестью течения заболевания и протяженностью делеции не отмечается, но различия между фор- мами Дюшенна и Беккера, в общем случае, связаны с наличием или отсутствием сдвига рамки считывания. Ген дистрофина мо- жет быть вовлечен также в другие структурные перестройки - дупликации, транслокации. Так, примерно 5% мутаций гена дистрофина составляют дупликации и около 35%-точечные мута- ции, преимущественно, микроделеции (от 1 до нескольких нук- леотидов), а также нонсенс мутации. Относительно высокий процент нонсенс мутаций в гене дистрофина связывают с присутствием большого количества глютаминовых триплетов, му- тации в котором часто приводят к образованию стоп-кодона.
Крайне редки миссенс мутации. Считается, что в 30% семей с
МД и МБ мутации спонтанного происхождения и возникают преи- мущественно в оогенезе, в остальных семьях это наследствен- ные формы.
Разработаны очень эффективные методы диагностики деле- ций в DMD-гене, основанные на мультиплексной ПЦР. Одновре- менное тестирование 18 экзонов + промоторной части гена поз- воляет выявить до 98% всех крупных делеций гена (Baranov et al., 1993). Для обнаружения гетерозиготного носительства де- леций используется метод RT PCR, то есть изоляция эктопи- ческой DMD-мРНК из клеток крови, обратная транскрипция, амп- лификация кДНК, рестрикционный анализ и секвенирование
(Roberts et al.,1991). Для этой же цели применяется метод иммунодетекции мутантного белка в белковом лизате мышц и на гистологических срезах биоптатов мышц (Arahata et al.,1989). При отсутствии идентифицируемой делеции применяют косвенный метод ДНК-диагностики с использованием внутриген- ных полиморфных сайтов: pERT87-8/Taq1; pERT87-15/BamH1;
124/Pst1;16intron/ Taq1, и аллельных вариантов динуклеотид- ных СА повторов в интронах 49 и 50 - STR-49; STR-50 (Малыше- ва и др., 1991; 1992; Евграфов, Макаров, 1987; Евграфов и др., 1990).
Серьезную проблему для диагностики гетерозиготного носительства и, следовательно, для медико-генетического консультирования предствляют случаи, так называемого, гонад- ного мозаицизма - присутствие в соматических клетках гонад женщины-неносительницы мутаций гена дистрофина, что, в свою очередь, приводит к появлению нескольких генераций (клонов) половых клеток (ооцитов) с мутанынм и нормальным генами дистрофина. Предполагается, что такие мутации могут возни- кать еще на уровне первичных половых клеток, то есть на ран- них стадиях внутриутробного развития будущей матери. По ори- ентировочным оценкам примерно 6-7% всех спорадических случа- ев являются следствием гонадного мозаицизма у матери. Оце- нить величину аберрантного клона ооцитов практически не представляется возможным. В связи с этим прогноз в отношении здоровья следующего ребенка в семьях, в которых у матери больного МД не удается определить гетерозиготное носительст- во, весьма затруднен. Эмпирически определено, что при нали- чии спорадического случая рождения ребенка с МД и при отсутствии прямых молекулярных доказательств гетерозиготного носительства мутации гена дистрофина у матери риск повторно- го рождения больного ребенка может достигать 14% (Essen et al.,1992).
У многих пациентов с миопатией Дюшенна при иммуногисто- химическом окрашивании мышц обнаруживаются редкие дистро- фин-положительные волокна. Однако, при использовании антител с антигенными детерминантами, кодируемыми делетированным участком гена, окрашивания не происходит и это позволяет от- вергнуть гипотезу соматического мозаицизма. Наиболее вероят- ный механизм такого явления - возникновение второй сомати- ческой делеции в мышечных клетках, устраняющей сдвиг рамки считывания, вызванный основной делецией. В результате му- тантный ген может транскрибироваться с образованием стабиль- ного, хотя и аномального дистрофина (Klein et al.,1992).
Имеется модельная линия мышей с миодистрофией Дюшенна - mdx. Эта модель была получена в результате отбора мутации, спонтанно возникшей в C57BL/10 линии (Bulfield et al.,
1984). В мышцах и в мозгу у мышей этой линии обнаруживается резко сниженное количество Dmd-мРНК, однако дистрофин пол- ностью отсутствует. Несмотря на это, никаких видимых клини- ческих аномалий у mdx-мышей не наблюдаются. Идентифицирована нонсенс мутация в mdx-гене, в результате которой у мышей транслируется лишь 27% дистрофинового полипептида. Обнаруже- на также сплайсинговая мутация, приводящая к вырезанию экзо- на 7 DMD-гена у собак (Sharp et al., 1992).
В серии экспериментов на mdx-мышах доказана принципи- альная возможность генокоррекции МД. Появление дистрофина человека в сарколемме мышечных волокон mdx-мышей наблюдали после введения ретровирусных или аденовирусных генноинженер- ных конструкций, содержащих полноразмерную кДНК гена дистро- фина (14 кб) или его делетированную, но функционально актив- ную форму, так называемый мини-ген (6.3 кб) (Wells et al.,
1992; Cox et al., 1993; Aсsadi et al., 1995). После внутри- венного введения фрагментов Dmd-гена в составе рекомбинант- ного аденовируса наблюдали длительное присутствие экзогенной
ДНК в скелетных и сердечных мышцах животных
(Srataford-Perricaudet et al., 1992). Несмотря на эти оче- видные успехи, проблема генноинженерной коррекции МД еще да- лека от своего решения. До сих пор ведутся оживленные дебаты исследователей о перспективности генной терапии МД по срав- нению с клеточной терапией (пересадка здоровых эмбриональных миобластов). Пока не утверждена ни одна программы клини- ческих испытаний генотерапевтического подхода МД (см.Главу
IX). Основная сложность проблемы генокоррекции - необходи- мость обеспечения системы эффективной доставки гена дистро- фина в миофибриллы не только скелетных мышц, но, что особен- но важно - в мышцы сердца и диафрагмы. В 1995г. исследования по генотерапии МД начаты в рамках программы Геном человека и в нашей стране.
10.4.3 Гемофилия А.
Гемофилия А - сцепленное с полом заболевание, вызванное наследственным дефектом фактора VIII, важнейшего звена в системе свертывания крови (cм. Табл. 10.4). Комплекс фактора
YIII с молекулярным весом более 1 миллиона состоит из 2-х компонентов. Главный компонент - YIIIC, кодируется геном
F8C, локализованным в X-хромосоме. С YIIIC нековалентно свя- зан фактор Виллебранда - YIIIR, кодирующийся аутосомным ге- ном. Фактор Виллебранда стабилизирует фактор VIII и регули- рует его активность.
Ген F8C - одним из очень крупных генов человека; содер- жит 26 экзонов (размером от 69 до 3106 нуклеотидов). Общая длина интронов соствляет 177 кб; около 20% этой ДНК прихо- дится на интрон 22 (32.4 кб). мРНК гена F8С размером 9 009 нуклеотидов включает 5'нетранслируемую последовательность
(150 п.о.), 3'нетранслируемую последовательность (1 806 п.о.) и кодирующий фрагмент (7053 п.о.). Внутри гена F8 в интроне 22 локализовано еще два других структурных гена не- известной природы - F8А и F8В, что было обнаружено методами молекулярный анализ. Ген F8A, целиком локализованный в инт- роне 22 гена F8C, не содержит интронов и транскрибируется в направлении, противоположном фактору VIII (3'-5'). Первый экзон гена F8B также расположен в интороне 22, а следующие его области распределены до экзонов 23-26; транскрибируется он в том же направлении, что и ген F8C (5'-3'). Оба гена экспрессируются во всех тканях (Levinson et al.,1990;
Freije,Schlessinger, 1992; Lakich et al., 1993). Интрон 22 оказался необычным и в том отношении, что содержит CpG-ост- ровок на расстоянии около 10 кб от экзона 22 - предположи- тельное место локализации бинаправленного промотора для ге- нов F8A и F8B. Оказалось, что на расстоянии примерно 500 кб в 5-'направлении от гена F8 находятся еще 2 транскрибируемые копии гена F8A (Lakich et al.,1993).
Во время процессинга первичного белкового продукта гена
F8C от исходного пептида из 2 351 аминокислотных остатка от- щепляется последовательность в 335 аминокислотных остатка. В плазме крови фактор VIII существует в виде металлозависимого гетеродимера, состоящего из С-концевой легкой цепи (80 кД) и
N-концевой тяжелой цепи (200 кД). Половина всех больных с гемофилией A не имеют фактора VIII, 5%- имеют нормальное ко- личество нефункционирующего белка и в остальных случаях ак- тивность белка сохранена, но его количество резко снижено
(McGinnis et al.,1993).
Изолированные случаи гемофилии A составляют 30%; 70% - семейные варианты. Показано, что мутации в гене F8 возникают в сперматогенезе в 3 - 5 раз чаще, чем в оогенезе (Rosendaal et al., 1990; Brocker-Vriends et al., 1991). Это означает, что в 80-86% спорадических случаев матери являются носителя- ми мутации, возникшей в зародышевых клетках их отца. Кроме того, около 14% матерей, не являющихся носителями мутации, могут быть соматическими или гонадными мозаиками, так что вероятность повторного рождения больного ребенка у них также повышена.
Около 10% всех идентифицированных мутаций в гене F8 яв- ляются делециями одного или нескольких смежных экзонов. При- мерно 5% всех мутаций составляют короткие делеции и дуплика- ции гена, остальные мутации - точковые замены (Antonarakis et al.,1995). Почти половина миссенс мутаций идентифицирова- на в домене A2. Показано, что 35% всех известных мутаций ло- кализовано в CpG динуклеотидах, причем свыше 90% из них представляют собой C-T или G-A транзиции (Cooper,
Youssoufian, 1988). Подобные мутации в кодирующих районах встречаются в 42 раза чаще, чем это можно было бы ожидать на основании случайного характера мутагенеза. Для подавляющего большинства мутаций гена F8C характерно практически полное отсутствие "горячих" точек: каждая семья высокого риска по гемофилии А имеет свою собственную мутацию. Исключение составляет группа обнаруженных сравнительно недавно протя- женных инверсий интрона 22, захватывающих экзоны 1-22 и пол- ностью блокирующих функцию гена. Такие инверсии, как оказа- лось, присутствуют в 45% семей с тяжелой формой гемофилии А
(Lakich et a.,1993). Причиной инверсий в этой области гена является гомологичная рекомбинация между идентичными после- довательностями гена F8А, расположенного в интроне 22
F8C-гена, и другими копиями этого же гена,находящимися на расстоянии 500 кб от 5'конца гена F8 (см.выше).
Помимо инверсий и точечных мутаций в гене ФVIII заре- гистрированы несколько случаев инсерционного мутагенеза, связанных с перемещением в геноме транспазонподобных элемен- тов типа LINE ( см. Главу II). У двух пациентов неродствен- ного происхождения был идентифицирован инсертированный в эк- зоне 14 F8C-гена длинный элемент LINE-1 (L1) (Kazazian et al.,1988). В обеих семьях это были мутации de novo. L1 последовательности представляют собой специфическое для ге- нома человека семейство длинных, размером от 2 до 4 кб, пов- торяющихся элементов, распределенных по всем хромосомам и состоящее, примерно, из 100 000 копий. Было показано что оба
L1 элемента, инсертированные в F8C-ген, родственны ретрот- ранспозону, локализованному на хромосоме 22 (Dombroski et al., 1991). В третьей семье инсертированный в интроне 10
F8C-гена L1 элемент не был связан с болезнью. Все 3 L1 эле- мента имели открытые рамки считывания, а соответствующие ре- конструируемые аминокислотные последовательности были высоко идентичны друг другу с уровнем гомологии, превышающим 98%.
Таким образом, были получены еще одни косвенные подтвержде- ния существования ряда функциональных L1 элементов, кодирую- щих 1 или несколько белков, необходимых для их ретротранспо- зиции.
Прямая диагностика протяженных инверсий в гене F8 осу- ществляется путем блот-гибридизации с ДНК зондом р482.6 c последующей рестрикцией эндонуклеазами Bcl1, Dra1, Nco1
(Lakich et al.,1993). В остальных случаях, в силу отсутствия мажорных мутаций в гене F8C, чаще всего используют косвенные методы молекулярной диагностики. С помощью ПЦР анализируют полиморфные динуклеотидные СА-повторы экзона 13, HindIII по- лиморфизм в интроне 19; HbaI полиморфизм в интроне 22 и вне- генный полиморфизм локуса DXS52 (St14/TaqI) (Асеев и др.,
1989; Aseev et al., 1994; Сурин и др., 1990).
Учитывая наличие функционально активной формы белка фактора VIII в плазме крови генноинженерые подходы в терапии этого заболевания направлены на получение в чистом виде пол- ноценного белкового продукта (заместительная терапия), либо на введение в организм больного соответствующей кДНК, обеспечивающей синтез ФVIII и его поступление в кровь. Осу- ществленное 10 лет назад выделение и клонирование кДНК этого гена сделало реальным оба эти подхода. Имеются сообщения о получении трансгенных животных (коз), в геном которых введен ген фактора VIII. Они могут быть использованы как продуценты полноценного белкового продукта. Генная терапия этого забо- левания находится на стадии экспериментальных разработок
(см.Главу IX). Успешно осуществлена трансдукция фибробластов человека in vitro с помощью ретровирусного вектора. Основная проблема в данном направлении заключается в выборе эффектив- ного промотора и подборе клеток, в которых экспрессия гена могла быть достаточно длительной. В настоящее время найдены невирусные промоторы, обеспечивающие эффективную и длитель- ную экспрессию гена фактора VIII in vivo. В качестве возмож- ных клеток-мишеней используют мышечные клетки, фибробласты, гепатоциты и клетки эндотелия сосудов. В 1994г. методом нап- равленного мутагенеза (см.Главу VIII) получены трансгенные модели гемофилии А на мышах. Есть все основания считать, что клинические испытания генокоррекции этого заболевания нач- нутся уже в ближайшем будущем.
10.4.4 Гемофилия B.
Гемоофилия B - сцепленное с полом заболевание, вызван- ное наследственным дефектом фактора IX - важного компонента средней фазы внутреннего каскада свертывания крови. Белок
(фактор IX) - гликопротеин, состоит из 415 аминокислотных остатков, объединенных в 8 доменов, синтезируется в виде мо- лекулы-предшественника клетками печени. В плазме крови фак- тор IX находится в виде гетеродимера, состоящего из 2-х по- липептидных цепей - легкой (L) и тяжелой (H), ковалентно связанных между собой одним дисульфидным мостиком. Фактор IX циркулирует в виде неактивного зимогена до тех пор, пока не произойдет протеолитическое высвобождение его активирующего пептида, что позволяет ему принять конформацию активной се- риновой протеазы. Его роль в свертывании крови связана с ак- тивацией фактора X посредством взаимодействий с ионами каль- ция, фосфолипидами мембраны и фактором VIII.
Ген фактора IX транскрибируется в гепатоцитах с образо- ванием мРНК размером 1 383 п.о. Для гена F9 характерна высо- кая частота возникновения мутаций - 4.1*10!6 за поколение.
Также как и при гемофилии A мутации значительно чаще возни- кают в сперматогенезе, чем в оогенезе (Montandon et al.,1992). Считается, что вероятность получения мутации от отца в 11 раз выше, чем от матери. Это означает, что в изо- лированном случае вероятность гетерозиготного носительства мутации у матери составвляет более 80%. Обнаружена четкая корреляция между возрастом отца и вероятностью получения от него новой мутации в гене F9. Так, средний возраст отца в момент рождения дочери - носительницы новой мутации, состав- ляет около 42 лет (King et al.,1992).
К 1994 г идентифицировано около 400 мутаций в гене ге- мофилии B. Подавляющее большинство из них замены нуклеоти- дов, приводящие к заменам аминокислот или к образованию стоп-кодонов. Характерно, практически, полное отсутствие вы- раженных мажорных мутаций и доминирующих областей повышенной частоты мутирования. Только одна мутация - I397T, встрети- лась в 7 самьях. Около 42% точечных мутаций возникает в CpG динуклеотидах (Bottema et al., 1993). Показано, что частота
G-A или C-T транзиций в CpG cайтах в 24 раза выше, чем в других местах гена (Koeberl et al., 1990). Кроме того, в CpG динуклеотидах гена F9 в 7.7 раз чаще возникают трансверсии
(A-T, A-C, G-T или G-C). Это обьясняется тем, что содержание
(G+C) в кодирующих областях F9-гена составляет 40% (Bottema et al., 1991).
В 40% случаев при тяжелых, ингибиторных формах гемофи- лии В у пациентов обнаруживаются делеции различной протяжен- ности. Около 10% точковых мутаций локализовано в донорных или акцепторных сайтах сплайсинга или создают новые сайты сплайсинга внутри интронов. В одной семье разрушение гена произошло в результате инсерции Alu-элемента в экзон 5
(Vidaud et al., 1993). Описано 13 точковых мутаций в промо- торной области гена F9. Именно с такими мутациями связана
Лейденовская (Leyden) форма заболевания, при которой к воз- расту половозрелости наступает улучшение многих клинических показателей и, в частности, исчезает кровоточащий диатез.
Обьясняется это тем, что мутации в промоторной области могут приводить к переключению конститутивной экспрессии гена на стероид-гармон-зависимую, нарушая связывание гепатоцитарного ядерного фактора 4 (HNF-4), принадлежащего к суперсемейству транскрипционных факторов для рецепторов стероидных гормонов.
Гемофилия B была использована как модель для выработки стратегии генетического консультирования при моногенных за- болеваниях, обладающих выраженной мутационной гетероген- ностью (Giannelli et al., 1992). Основой такой стратегии яв- ляется составление национальных баз данных молекулярных де- фектов и специфических методов их диагностики. В частности, основываясь на подобной информации, авторы провели характе- ристику мутаций в группе из 170 неродственных индивидуумов с гемофилией B шведского и английского происхождения и только в одном случае им не удалось идентифицировать мутацию.
Молекулярная диагностика гемофилии В проводится как непрямыми так и прямыми методами. Непрямая диагностика осно- вана на анализе методом ПЦР внутригенных полиморфных сайтов:
Taq1 (в положении 11 109-11 113); инсерционного полиморфизма в интроне А (рестриктазы Hinf1 и Dde1) ; Taq1 в интроне F в положении 72. Метод ПДРФ анализа информативен только у
60-70% всех семей с гемофилией В (Aseev et al., 1994; Сурин и др., 1994). Прямая диагностика гемофилии В включает ампли- фикацию геномных фрагментов гена фактора IX с последующей детекцией ошибок комплементации методом mismatch detection
(см.Главу IV) и прямое секвенирование продуктов амплификации
(Montadont et al.1990).
Сравнительно небольшие размеры гена, присутствие белко- вого генопродукта в сыворотке крови и наличие естественных биологических моделей способствовали быстрому прогрессу исследований по генотерапия гемофилии В, которая в настоящее время уже включена в программы клинических испытаний. Успеш- ная трансдукция и коррекция генетического дефекта получена в опытах in vitro и in vivo на самых различных модельных системах (Culver, 1994; Gerrard et al., 1993). Так, при вве- дении полноразмерной кДНК в составе ретровирусного вектора в первичные культуры кератиноцитов человека наблюдали экспрессию F9 и секрецию биологически активного фактора IX.
После трансплантации этих трансдуцированных клеток nu/nu мы- шам человеческий фактор IX в небольшом количестве появлялся в кроветоке и сохранялся там в течение недели (Gerrard et al.,1993). На собаках, страдающих гемофилией B, осуществлена трансдукция гепатоцитов in vivo путем прямой инфузии реком- бинантного ретровирусного вектора в портальную вену. При этом наблюдали устойчивую экспрессию фактора IX в течение более 5 месяцев и улучшение биохимических показателей свер- тываемости крови (Kay et al.,1993). Имеется сообщение об успешной коррекции гемофилии В в Китае в 1992г. Двум больным мальчикам в кожу спины трансплантировали культуру аутологич- ных фибробластов, предварительно трансдуцированных ex vivo рекомбинантной кДНК гена FVIII. Несмотря на определенный скептицизм в оценке этого достижения со стороны специа- листов, нет сомнения в том, что успешная генотерапия гемофи- лии В - событие самого ближайшего будущего.
10.4.5 Болезнь Виллебранда.
Болезнь Виллебранда- аутосомно-доминантное (при некото- рых формах рецессивное) заболевание, обусловленное наследственным дефицитом белка VIIIR, родственного фактору
VIIIС свертывания крови (см.Гемофилия А) и известного, как фактор фон Виллебранда. Этот большой гликопротеин синтезиру- ется клетками эндотелия, в которых специфическая YIIIR-мРНК составляет 0.3%, и поступает в кровь в виде двух мультимеров с молекулярными весами от 850 кД до 20 миллионов дальтон.
Фактор VIIIR осуществляет взаимодействие между стенкой сосу- дов и тромбоцитами, регулируя их адгезию в местах поврежде- ния эндотелия. Фактор VIIIR участвует также в регуляции син- теза и секреции фактора YIIIC и стабилизирует комплекс фак- тора VIII.
Различают 7 типов болезни Виллебранда - I, IIA-IIE и
III (Zimmerman, Ruggeri, 1987). При типе I снижена концент- рация всех мультимеров в плазме, но их качество не нарушено.
Генетически эта форма заболевания подразделяется на ре- цессивные и доминантные варианты. Типы IIC и III - рецессив- ны. Тип II характеризуется качественными аномалиями фактора
VIIIR, выражающимися в уменьшении способности формировать большие мультимеры, (типы IIA и IIC) или в увеличении ско- рости их выведения из плазмы (тип IIB).
Ген F8VWF достаточно протяженный и состоит из 52 экзонов, размерами от 40 до 1379 п.о. (Mancuso et al., 1989). Величи- на интронов варьирует в огромных пределах (от 100 до 20 000 пар нуклеотидов). Сигнальный пептид и пропептид кодируются первыми 17 экзонами, в то время как зрелая субьединица
VIIIR- фактора и 3'нетранслируемая область - остальными 35 экзонами. Внутри гена идентифицированы повторяющиеся после- довательности, включая 14 Alu-элементов и полиморфный TCTA повтор размером около 670 п.о. в интроне 40. Районы гены, кодирующие гомологичные домены, имеют сходную структуру. На хромосоме 22q11-q13 обнаружен псевдоген длиной 21-29 кб, соответствующий экзонам 23-34 F8VWF-гена (Mancuso et al.,
1991). Идентифицированные в нем сплайсинговые и нонсенс му- тации препятствуют образованию функционального транскрипта.
Наибольшее число мутаций идентифицировано при типе II болезни Виллебранда. Подавляющее большинство из них - замены аминокислот, чаще всего происходящие в результате транзиций в CpG динуклеотидах (Cooney et al., 1991; Randi et al.,
1991; Donner et al., 1992). Мутации при болезни типа IIA кластерированы в A2 домене, где предположительно локализован сайт протеолетического отщепления, в то время, как при типе
IIB - в домене, обеспечивающим взаимодействие с тромбоцитар- ным гликопротеиновым комплексом (Ib-IX рецептором). Большая группа мутаций при форме заболевания IIB локализована в сег- менте из 11 аминокислот внутри единственного дисульфидного изгиба (loop), соединяющего цистеины в 509 и 695 положениях.
При форме заболевания Нормандского типа, мимикриющей гемофи- лию A, фактор Виллебранда структурно и функционально норма- лен, за исключеним того, что нарушено его взаимодействие с фактором YIII. У таких пациентов действительно идентифициру- ются миссенс мутации, расположенные в области гена, кодирую- щей сайты связывания фактора VIIIR с фактором VIIIС
(Mazurier, 1992).
Тип III представляет собой наиболее тяжелую форму забо- левания, при которй фактор VIIIR, как правило, отсутствует.
Получены доказательства, что такие пациенты являются гомози- готами или компаундами по нонсенс мутациям, обнаруживаемым в одной дозе у больных типа I (Zhang et al., 1992). При этом же типе заболевания выявлен кластер мутаций со сдвигом рамки считывания, возникаюших в результате делеции одного из 6 ци- тозинов в положении 2679-2684 экзона 18. Именно такая мута- ция была обнаружена в семье, зарегистрированной впервые фон
Виллебрандом в 1926 году. У некоторых членов этой родослов- ной как было установлено недавно, она находилась в компаунде с мутацией P1266L, возникшей в результате рекомбинации между геном F8VWF и псевдогеном (см. выше) (Zhang et al., 1993).
Выбор адекватного метода молекулярной диагностики бо- лезни Виллебранда в значительной мере предопределяется пра- вильностью предшествующей клинической и лабораторной диаг- ностики и результатами медико-генетического консультирова- ния, позволяющей достаточно четко определить характер насле- дования заболевания в семье высокого риска и установить его форму. К сожалению, достичь этого далеко не всегда возможно, а отсутствие характерных мажорных мутаций значительно снижа- ет эффективность прямой молекулярной диагностики. Вместе с тем, по крайней мере, в некоторых популяций (Финляндия, Шве- ция) обнаружены "горячие" точки мутаций, которыми являются экзоны 18 и 42, при типе II болезни Виллебранда (Holmberg et al,1993). В популяциях России такие "горячие " точки пока не обнаружены, хотя исследования в этом направлении ведутся
(Асеев, Шауи Абдельрхани, 1995). Значительно более перспек- тивной на современном этапе представляется непрямая диаг- ностика. В промоторной части гена, в интронах
15, 17, 23, 40, 41, 49, а также в экзонах 26, 35, 39 иденти- фицированы многочисленные полиморфные сайты рестрикции с достаточно высоким уровнем полиморфизма. Особенно перспек- тивным для диагностики является полиморфизм интрона
40, представляющий собой две области варьирующих по числу тетрамерных повторов ТСТА на расстоянии 212 п.о. Амплифика- ция этой части интрона 4О с помощью ПЦР, рестрикция AluI с последующим электрофоретическим разделением позволяет иден- тифицировать до 98 аллельных вариантов этого полиморфизма
(Mercter et al.,1991). Столь выраженный полиморфизм позволя- ет с высокой эффективностью маркировать мутантную хромосому
(ген) и проследить её передачу в потомстве.
Сведения о генокоррекции болезни Виллебранда в доступ- ной литературе не обнаружены.
10.4.6 Фенилкетонурия.
Фенилкетонурия (ФКУ) - одно из наиболее частых аутосом- но-рецессивных заболеваний, обусловленных наследственным де- фектом фенилаланингидроксилазы, приводящим при отсутствии своевременной терапии к тяжелой умственной отсталости. В Ев- ропе один больной ребенок встречается в среднем среди 10 -
17 000 новорожденных. В Ирландии и Шотландии частота ФКУ достигает 1 на 4500 новоржденных (DiLella et al., 1986).
Распространена ФКУ также в Польше и в Белоруссии. В России частота заболевания колеблется в пределах 1 : 8 - 10 000.
Очень важна ранняя диагностика ФКУ, так как при своевремен- ном назначении пациенту диеты, не содержащей фенилаланин, умственная ограниченность, как правило, не развивается или имеет очень стертые формы. Разработаны биохимические скрини- рующие тесты диагностики ФКУ у новорожденных.
Гидроксилирование фенилаланина является достаточно сложным процессом, в котором участвуют, по крайней мере, 3 фермента. Фенилаланингидроксилаза (РАН), гомополимерный фер- мент, состоящий из субъединиц с молекулярным весом 52 кД, продуцируется клетками печени и регулирует превращение L-фе- нилаланина в L-тирозин. Его дефицит приводит к накоплению фенилаланина в сыворотке крови. Гиперфенилаланинемия может возникать также при дефиците дигидроптеридинредуктазы и при дефектах синтеза биоптерина. Однако, эти заболевания, хотя и сопровождаются снижением активности РАН, значительно отлича- ются от классической ФКУ и не коррегируются диетой, лишенной фенилаланина.
PAH-ген транскрибируется в гепатоцитах с образованием мРНК размером 2.4 кб. Наиболее распространенный тип мутаций
- однонуклеотдные замены (миссенс, нонсенс, мутации в сайтах сплайсинга), причем часто эти мутации являются результатом транзиций в 22-х обнаруженных в PAH-гене CpG динуклеотидах.
Крупных структурных перестроек не найдено, хотя имеется не- большой процент точечных делеций. Отмечается неравномерный характер внутригенной локализации мутаций (Scriver et al.,1989). Так, наибольшее число миссенс мутаций встречается в центральной части гена: в экзоне 7, кодирующем участок связывания белка с кофактором, где располжено 5 CpG дупле- тов, а также в экзонах 9 и 12. Преимущественный район лока- лизации делеций - экзоны 1, 2 и 3.
Втури РАН-гена локализованоно более 10 полиморфных сай- тов рестрикции, причем распределения гаплотипов по этим мар- керам среди представителей разных рас и этнических групп значительно различаются. Обнаружено сильное неравновесие по сцеплению между определенными мутациями в PAH-гене и гапло- типами по внутригенным сайтам рестрикции. Так, каждая из 5-и наиболее частых в европейских популяциях мутаций ассоцииро- вана только с одним из более, чем 70 гаплотипов по 8 рест- рикционным полиморфизмам (Eisensmith et al., 1992). Мажорная в западно-европейских популяциях сплайсинговая мутация в до- норном сайте 12-го интрона сцеплена с гаплотипом 3 (DiLella et al.,1986). В то же время другая мутация в экзоне 12 -
R408W, наиболее распространенная на востоке Европы, в част- ности в Белоруссии и России, и не найденная в Японии и Ки- тае, связана с гаплотипом 2 (DiLella et al.,1987). Мажорная в
Европе мутация R158Q в 40% сцеплена с гаплотипом 4, наиболее частым среди жителей Японии и Китая. Распространенная в Тур- ции сплайсинговая мутация в интроне 10, приводящая к
9-и-нуклеотидной инсерции, ассоциирована с "южными" гаплоти- пами 6, 10 и 36.
Сопоставление частот различных гаплотипов по полиморф- ным сайтам рестрикции и мутаций в PAH-гене в разных популя- циях, национальностях и этнических группах позволяет сделать вывод , что большинство из них, или даже все, произошли уже после дивергенции рас. Распространение мажорных мутаций гена
РАН в различных популяциях и этнических группах связано с эффектом основателя. По некоторым оценкам эти мутации воз- никли однократно от нескольких сотен до нескольких тысяч лет тому назад. Однако, в ряде случаев распределение мутаций не может быть обьяснено в генетических терминах, сопоставимых с демографической историей. Несомненно доказанными являются примеры независимого и рекуррентного возникновения в разных популяциях таких мутаций, как R261Q или R158Q. Высокие попу- ляционные частоты специфических мутаций в PAH-гене связаны, по-видимому, не только с эффектом основателя и/или с сущест- вованием эндогенных механизмов повышенного мутагенеза, но и с преимуществом гетерозигот. Высказано предположение, что носительство РАН - мутаций повышает устойчивость организма к токсическому эффекту охратоксина А, продуцируемого некоторы- ми видами грибковой плесени (Aspergillus, Penicillium), раз- вивающимися при хранении зерна и других продуктов
(Woolf,1986). Предполагается, что беременные женщины, гете- розиготные пл РАН -мутациям имеют меньшую вероятность абор- та, индуцированного действием этих микотоксинов. Возможно, высокая частота ФКУ в Ирландии и Шотландии частично может быть обьяснена мягким и влажным климатом этих стран, способствующем росту таких грибов.
В медицинской практике используется как прямая, так и косвенная диагностика мутаций в PAH-гене. Разработан очень быстрый и эффективный метод ПЦР/StyI-диагностики cамой частой в России (более 70%) мутации R408W (Ivaschenko,
Baranov, 1993; Иващенко и др., 1993). Дигностика других ма- жорных мутаций в PAH-гене осуществляется методами ПЦР+АСО, аллель-специфической амплификации (ARMS), методом одноните- вого конформационного полиморфизма (SSCP) (см. Главу IY).
При первичном обследовании семьи черезвычайно удобно исполь- зовать три полиморфные нейтральные мутации в кодонах 232,
245 и 385, сцепленные в Кавказских популяциях с определенны- ми ПДРФ-гаплотипами, а значит и со специфическими мутантными аллелями. Каждая из этих мутаций создает новый сайт рестрик- ции и поэтому их аллельное состояние может быть легко проти- пировано с помощью амплификации и рестрикции (Kalaydjieva et al., 1991). При анализе семьи, в которой отсутствуют легко идентифицируемые прямыми методами мутации, молекулярная ди- агностика может быть проведена с помощью внутригенных поли- морфных сайтов рестрикции. Удобен, в частности, Msp1-поли- морфизм в 8-м экзоне, анализ которого может быть осуществлен методом ПЦР/рестрикции (Wedmeyer et al., 1993). В последнее время появились даные о наличии высокополиморфных сайтов внутри интронов гена РАН, которые оказались особенно удобны- ми для молекулярного маркирования мутантных аллелей (Goltzov et al.1994).
Генокоррекция ФКУ успешно осуществлена в опытах in vitro и в настоящее время находится на стадии эксперимен- тальной разработки (Табл.9.2. Глава IX).
10.4.7 Синдром Леш-Нихана.
Синдром Леш-Нихана - рецессивное сцепленное с полом за- болевание, обусловленное наследственной недостаточностью ги- поксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT) и сопровож- дающееся тяжелыми поражениями центральной нервной системы.
Фермент HPRT участвует в регуляции метаболизма пуринов, контролируя превращение гуанина и инозина в соответствующие рибонуклеотиды. Ген HPRT экспрессируется во всех типах кле- ток с образованием мРНК размером 654 п.о.. Культивируемые линии клеток, дефектные по HPRT, устойчивы к 8-азагуанину и
6-тиогуанину, и таким образом, могут быть отобраны на соот- ветствующих селективных средах. Гетерозиготные носители му- таций по HPRT-гену могут быть легко выявлены по наличию 2-х типов клеток - устойчивых и чувствительных к 8-азагуанину, в первичной культуре фибробластов или в клетках волосяных лу- ковиц. В большинстве мутантных клеточных линий количество мРНК нормально, а белок отсутствует. У части пациентов хотя и транскрибируется достаточно много мРНК, но в этих молеку- лах обнаруживаются структурные и функциональные аномалии. В небольшом проценте случаев у больных не удается выявить ни белка, ни мРНК.
В 15% хромосом у больных с синдромом Леш Нихана ген
HPRT вовлечен в крупные структурные перестройки, корторые могут быть выявлены методами Саузерн или Нозерн блот-гибри- дизации. Синдром Леш Нихана одно из первых моногенных наследственных заболеваний, для которых была проведена моле- кулярная идентификация точечных мутантных аллелей. Именно на этой моделе впервые был разработан и опробован метод анализа мутаций, основанный на расщеплении РНК-ДНК гибридов рибонук- леазой А в местах негомологичноно спаривания (метод расщеп- ления рибонуклеазой А - см.Главу VI, Gibbs, Caskey, 1987).
Комбинация методов блот-гибридизации и расщепления рибонук- леазой А позволяет выявить до 50% мутаций. В настоящее время в гене HPRT найдено более 100 спорадических мутаций, полови- на которых - однонуклеотидные замены типа миссенс, нонсенс и в сайтах сплайсинга. Около 40% мутантных хромосом имеют структурные аномалии, в том числе крупные делеции, нехватки отдельных зкзонов и микроделеции одного или нескольких нук- леотидов. В HPRT-гене, практически, отсутствуют мутации, до- мининирующие по частоте в каких-либо популяциях. Исключение составляет нонсенс мутация R170TER, которая составляет около
15% всех нуклеотидных замен (Gibbs et al., 1989). Также как и при гемофилиях мутации гена HPRT чаще возникают в сперма- тогенезе, чем в оогенезе. Вероятность мутирования возрастает с возрастом отца. Идентифицировано 3 HPRT-псевдогена в хро- мосомах 3, 5 и 11 (Stout, Caskey, 1984).
Описаны редкие случаи синдрома Леш Нихана у гетерози- готных девочек. При этом, как правило, болезнь развивается вследствие неслучайной инактивации X-хромосомы, не содержа- щей мутации (Ogasawara et al., 1989). Однако, у 3-х женщин - облигатных носительниц мутаций в HPRT-гене, селективный тест не выявил присутствия мутантных клеток в культивируемых фиб- робластах и волосяных луковицах. В связи с этим высказано предположение, что определенные мутации гена HPRT находятся в неравновесном сцеплении с неидентифицированной летальной мутацией в X-хромосоме, что и приводит к селекции клона кле- ток только с одной (мутантной или немутантной по гену HPRT)
X-хромосомой (Marcus et al., 1992).
Молекулярная диагностика болезни Леш-Нихана возможна прямыми и непрямыми методами. Прямой вариант основан на про- ведении обратной транскрипции мРНК, ее амплификации,
SSCP-анализе одноцепочечных ДНК фрагментов с их последующим секвенированием (см.Глава VI). Косвенная диагностика пре- дусматривает маркирование мутантной хромосомы при помощи по- лиморфных сайтов (в частности, локуса DXS52 - зонд
St14/TaqI).
Как мы уже отмечали (Главы VII,VIII), первая трансген- ная животная модель наследственного заболевания человека, сконструированная путем направленного переноса мутациий в культивируемые эмбриональные стволовые клетки, была получена для синдрома Леш-Нихана (Hooper et al., 1987; Kuehn et al.,
1987). На этой моделе впервые была проведена генокоррекция наследственного дефекта in vivo. Эти успехи в значительной степени связаны с существованием селективных сред, позволяю- щих вести автоматический отбор мутантных клеток. Вообще, синдром Леш-Нихана представляет собой идеальную систему не только для изучения пуринового метаболизма, но и для решения многих теоретических вопросов биологии и медицины
(Seegmiller, 1989; Maraus et al., 1993; Boyel et al., 1993).
Сложность генокоррекции заболевания, однако, заключается в необходимости обеспечения эффективной доставки гена HPRT
(или его кДНК) непосредственно в мутантные нервные клет- ки. Эта проблема еще не решена. Поэтому реальные клинические программы генотерапии этого заболевания на сегоднешний день отсутствуют (см.Главу IX).
10.4.8 Болезнь Вильсона-Коновалова.
Болезнь Вильсона-Коновалова (БВК) - гепатолентикулярная дегенерация - аутосомно-рецессивное заболевание, обусловлен- ное наследственным дефектом одной из медь-транспортирующих
АТФаз. У больных резко снижена концентрация основного медь-содержащего белка плазмы крови - церулоплазмина и в меньшей степени - цитохромоксидазы, еще одного белка, участ- вующего в метаболизме меди. Выделяют, по крайней мере, 3 формы БВК (Cox et al. , 1972). При редкой атипичной форме, предположительно Германского происхождения, у гетерозигот содержание церулоплазмина снижено, по крайней мере, в два раза. При двух других, типичных формах - славянской и юве- нильной, содержание церулоплазмина у гетерозигот находится в пределах нормы. Славянский тип БВК характеризуется сравни- тельно поздним началом и преимущественно неврологической симптоматикой. Ювенильная форма чаще встречается в Западной
Европе и ведущими в этиологии заболевания являются печеноч- ные нарушения. Среди евреев-ашкенази встречается БВК с позд- ним началом и почти нормальным содержанием церулоплазмина в сыворотке крови больных.
Ген БВК, идентифицированный в 1993г. независимо сразу в
2х лабораториях США, представляет собой медь-транспортирую- щую АТФазу P типа с 6-ю металл-связывающими районами. Ген имеет 60% гомологию по нуклеотидному составу с ранее иденти- фицированным геном АТФ-азы (АТР7А), мутантном при болезни
Менкеса (Bull et al., 1993; Petruchin et al., 1993; Tanzi et al., 1993). По аналогии с геном болезни Менкеса, также обусловленной нарушением транспорта меди, ген БВК назван
АТР7В. Два пациента с БВК оказались гомозиготными по 7-нукле- отидной делеции в кодирующей области гена ATP7B , что дока- зывало его идентичность гену БВК (Petruchin et al, 1993).
Ген экспрессируется в клетках печени, мозга, почках, лимфо- узлах. Типичным для экспрессии АТР7В оказался альтернативный сплайсинг двух и более экзонов центральной части гена
(6, 7, 8, 12 и 13).
Кодируемый ATP7B-геном белок содержит несколько мемб- ранных доменов, АТФ-консенсусную последовательность, сайт фосфорилирования и, по крайней мере, 2 медь-связывающих сай- та. В мозге, печени, почках и ломфоузлах обнаружены изоформы белка, соответствующие продуктам альтернативного сплайсинга гена АТР7В. Их назначение и функции пока неизвесты. В гене
АТР7В идентифицированы полиморфные микросателлитные маркеры, а также около 10 полиморфных сайтов рестрикции. В настоящее время в гене АТР7В идентифицированы более 30 мутаций, в том числе 14 мелких делеций/инсерций, 2 - нонсенс мутации, 15 - миссенс мутаций, 3 - сплайсинговые мутации. Диагностическую ценность для европейцев представляют мутации His1070Gln и
Gly1267Lys, зарегистрованные в 28% и 10% всех мутантных хро- мосом, соответственно (Thomas et al., 1995).
В заключении данного раздела представляется целесооб- разным кратко рассмотреть другие достаточно частые моноген- ные заболевания, для которых показана и проводится молеку- лярная диагностика, в том числе и пренатальная, в других ме- дико-генетических центрах России и, прежде всего, в Лабора- тории молекулярной диагностики Институтата клинической гене- тики РАМН (Москва).
10.4.9 Адрено-генитальный синдром.
Адрено-генитальный синдром - (врожденный дефицит
21-гидроксилазы) - достаточно распространенное аутосомно-ре- цессивное заболевание. Частота "классических" форм 1:10 000 новоржденных, "неклассической" - около 1% в популяции. В за- висимости от характера нарушения функции гена и, соот- ветственно клинических проявлений "классическая форма" под- разделляется на два варианта: 1. летальная сольтеряющая фор- ма; 2. нелетальная - вирилизирующая форма, связанная c из- бытком андрогенов (Morel, Miller, 1991).
В локусе 6р21.3, внутри сложного супергенетического комплекса HLA идентифицированы два тандемно расположенных
21-гидроксилазных гена - функционально активный CYP21B и псвдоген - CYP21А, неактивный вследствие делеции в 3-м экзо- не, инсерции со сдвигом рамки считывания в 7-м экзоне и нонсенс мутаций - в 8-м экзоне. Ген и псевдоген разделены смысловой последовательностью гена С4В, кодирующей 4-й фак- тор комплемента. Оба гена состоят из 10 экзонов, имеют длину
3,4 кб и отличаются только по 87 нуклеотидам. Высокая сте- пень гомологии и тандемное расположение указвают на общность эволюционного происхождения этих генов. Любопытно отметить, что такие же тандемно расположенные гены 21-гидроксилазы
(называемые также Р450с21) обнаружены и у других млекопитаю- щих, причем у мышей, в отличие от человека, активен только ген CYP21A, но не CYP21B, тогда как у крупного рогатого ско- та функционально активны оба гена.
Белок- 21-гидроксилаза ( Р450с21- микросомальный цитох- ром 450) обеспечивает превращение 17-гидроксипрогестерона в
11-дезоксикортизол и прогестерона - в дезоксикортикостерон.
В первом случае возникает дефицит глюкокортикоидов и, прежде всего, кортизола, что в свою очередь стимулирует синтез
АКТГ, и ведет к гиперплазии коры надпочечников (вирилирующая форма). Нарушение превращения прогестерона в дезоксипрогесте- рон ведет к дефициту альдостерона, что в свою очередь нару- шает способность почек удерживать ионы натрия и приводит к быстрой потере соли плазмой крови (соль теряющая форма).
Как и в случае гемофилии А, наличие рядом с кодирующим геном гомологичной ДНК последовательности зачастую ведет к нарушениям спаривания в мейозе и, как следствие этого, к конверсии генов (перемещения фрагмента активного гена на псевдоген), либо к делеции части смыслового гена. В обоих случаях функция активного гена нарушается. На долю делеций приходится около 40% мутаций, на долю конверсий - 20% и при- мерно 25% составляют точечные мутации. Согласно отечествен- ным данным в случае наиболее тяжелой сольтеряющей формы АГС, на долю конверсий приходится более 20% мутантных хромосом, на долю делеций - около 10% (Evgrafov et al., 1995).
Непрямая диагностика АГС возможна с помощью типирования тесно сцепленных с геном CYP21B аллелей HLA A и HLA B генов, а также алелей гена HLA DQA1. Прямая ДНК диагностика АГС основана на амплификакции с помощью ПЦР отдельных фрагментов генов CYP21B и CYP21A, их рестрикции эндонуклеазами HaeIII или RsaI и анализе полученных фрагментов после электрофореза
(Evgrafov et al., 1995).
10.4.10 Спинальная мышечная атрофия.
Спинальная мышечная атрофия (СМА) - аутосомно-рецессив- ное заболевание, характеризуется поражением моторных нейро- нов передних рогов спинного мозга, в результате чего разви- ваются симметричные параличи конечностей и мышц туловища.
Это - второе после муковисцидоза наиболее частое летальное моногенное заболевание (частота 1: 6 000 новорожденных).
СМА подразделяется на три клинические формы. Тип I. Острая форма (болезнь Верднига-Гоффмана), проявляется в первые 6 ме- сяцев жизни и приводит к смерти уже в первые два года; Тип
II. Средняя (промежуточная) форма, пациенты не могут стоять, но обычно живут более 4-х лет; Тип III. Ювенильная форма
(болезнь Кугельберга-Веландера) - прогрессирующая мышечная слабость после 2-х лет. Все три формы представляют собой ал- лельные варианты мутаций одного гена SMN (survival motor neurons), картированного в локусе D5S125 (5q13) и идентифи- цированного методом позиционного клонирования (см.Главу III) в 1995г (Lefebvre et al. 1995). В этой пока единственой ра- боте показано, что ген SMN размером всего 20 000 п.о.состоит из 8 экзонов. мРНК этого гена содержит 1 700 п.о. и кодирует ранее неизвестный белок из 294 аминокислотных остатков с молекулярным весом 32 КилоДальтона.
Ген дуплицирован. Его копия (возможно вариант псевдоге- на) располагается несколько ближе к центромере и отличается от гена SMN наличием 5-и точечных мутаций, позволяющих отли- чить оба гена путем амплификации экзонов 7 и 8 и их исследо- ванием методом SSCP анализа (см.Главу IV). Ген назван сBCD541, по аналогии с первоначальным вариантом названия для теломерной копии, т 4о 0е 4сть 0гена SMN, tBCD541. Ген cBCD541 экспрессируется, но в отличие от гена SMN его сДНК подверга- ется альтернативному сплайсингу с утратой экзона 7.
Отсутствие гена SMN (tBCD541) у 93% больных (213 из 229), его разорванная (interrupted) структура у 13 обследованных пациентов (5.6%) и наличие серьезных мутаций у оставшихся
3-х больных дали основание именно данную теломерную копию гена считать ответственной за заболевание. Существенно отме- тить, что центромерная копия гена обнаружена у 95 4. 05% боль- ных, 4тогд 0а 4как 0 отсутств 4ует она 0 только у 4,4% 4 пациентов 0.
В непосредственной близости от теломерного конца гена
SMN идентифицирован еще один ген - ген белка-ингибитора зап- рогаммированной гибели нейронов (neuronal apoptosis inhibitory protein -NAIP). При тяжелых клинических формах
СМА (Тип I), обусловленных делециями, по-видимому, нередко происходит утрата гена NAIP.
Согласно гипотезе авторов СМА возникает при гомозигот- ном состоянии мутаций (обычно-делеций) в гене SMN, 4при этом различ 4ия между 0форм 4ами 0СМА определяются двумя основными
фак- торами: 1. числом копий гена cBCD541 (две - в случае Типа I и четыре (возникающих вследствие конверсии между SMN и cBCD541) - в случае Типа III), 2. наличием или отсутствием ген 4а 0NAIP. 4С 0реди всех обследованных СМА-больных
4не
4обнаружены 0случа 4и одновременной 0делеции обоих гомологичных генов 4- 0SMN (tBCD541) и сBCD541 4, что 0указывает, по мнению авторов, 4на то, 0что такая аберрация должна проявляться как доминантная леталь еще в эмбриогенезе.
Некоторые положения этой, безусловно, основополагающей работы французских авторов, по-видимому, еще требуют уточне- ния, однако, уже сейчас она сделала возможной прямую молеку- лярную диагностику СМА у 98,6% больных. С этой целью прово- дится амплификация экона 7, который отсутствует у подавляю- щего большинства больных. Нормальный экзон 7 (ген SMN) диф- ференцируют от мутантного варианта (ген cBCD541) c помощью
SSCP анализа. При необходимости возможна косвенная диаг- ностика - ПЦР анализ динуклеотидных (CA) повторов ДНК ло- кусов D5S125; D5S112; D5S127; ПДРФ-анализ с фланкирующими
ДНК-зондами MU, 105-153RA; 153-6741 GT.
10.4.11 Атаксия Фридрейха.
Атаксия Фридрейха (АФ) - сравнительно редкое (1 : 22
-25 000) аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующе- еся прогрессивной дегенерацией нервных клеток мозжечка. Ген
АФ не идентифицирован, но достаточно точно картирован на хромосомных (9q13-q21) и физических картах ДНК-маркеров. На- иболее тесное сцепление гена АФ показано для локуса D9S5
(зонд 26Р). Сконструированы космидные библиотеки и составлены подробные физические карты области 4 0геномной ДНК хромосомы 9, включающей локус D9S7 и, предположительно, ген
АФ. Определено положение гена ФА по отношению к другим флан- кирующим молекулярным маркерам (Fujita etal., 1991; Wilkes et al., 1991) 4. 0В настоящее время известно, по крайней мере,
5 таких ДНК маркеров: GS4, MCT-112, GS2 -дистальные и мик- росателлитные маркеры FD1 (на расстоянии 80 кб 4) 0и MLS1 (на расстоянии 150 кб) - проксимальные. Изучены особенности ал- лельного полиморфизма этих систем для различных популяций
Западной Европы. Для всех 5 молекулярных маркеров выяснены гаплотипы, сцепленные с заболеванием. Гаплотипы обоих мик- росателлитных маркеров оказались в абсолютном генетическом неравновесии с АФ, что доказывет их весьма близкое располо- жение на генетической карте по отношению к мутантному гену
АФ (Pianese et al., 1994).
Диагностика АФ пока возможна только непрямыми методами.
ПДРФ анализ с помощью ДНК-зондов на дистальные полиморфные сайты, либо ПЦР анализ полиморфизма проксимальных по отноше- нию к гену АФ микросателлитных маркеров MLS1 или FD1.
Нами рассмотрены лишь некоторые моногенные наследствен- ные болезни, условно разделенные на три подгруппы, исходя, главным образом, из того насколько они изучены с молекулярно
-генетических позиций, их актуальности для пренатальной ди- агностики и в какой мере они важны для медико-генетической службы нашей страны. Более того, исторически сложилось так, что именно такие заболевания как муковисцидоз, миодистрофия
Дюшенна, гемофилия А, фенилкетонурия, то 4 0есть 4 0социально наи- более значимые, раньше других генных болезней стали предме- том детального молекулярного анализа в нашей лаборатории и в других медико-генетических центрах и научно-практических подразделениях России (см. Баранов, 1991, 1994;
Baranov,1993; Евграфов, Макаров, 1987).
Естественно, что рассмотренными нозологиями отнюдь не исчерпывается список тех болезней, которые являются объекта- ми молекулярных исследований в нашей стране. Например, из обзора выпали такие моногенные 4 0болезни как гиперхолестерине- мия, гемоглобинопатии, дефицит альфа-1 антитрипсина, мито- хондриальные болезни. 4 0Для многих из них разработаны и широко применяются эффективные методы молекулярной диагностики, ве- дутся исследования по генотерапии. 4 0Мы не касались также ра- бот проводимых, 4 0главным образом, 4 0в возглавляемой профессором
Е.И.Шварцем лаборатории молекулярной диагностики ПИЯФ РАН и посвященных молекулярному анализу мультифакториальных забо- леваний, 4 0таких как диабет, гипертония, ишемия сердца. Ре- зультаты этих 4 0исследований 4 0будут, по-видимому, предметом следующих обзоров и монографий.
ГЛАВА I
СТРУКТУРА И МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК.
Раздел 1.1 Общие представления, центральная догма, гене- тический код.
Универсальная генетическая субстанция или "энциклопедия жизни", ДНК, содержит информацию, необходимую для синтеза белков и нуклеиновых кислот, присутствующих во всех типах клеток как про- так и эукариот. Дезоксирибонуклеиновые кис- лоты (ДНК) - это нитевидные молекулы, состоящие из четырех расположенных в варьирующем порядке нуклеотидов: пуринов - аденина и гуанина, и пиримидинов - цитозина и тимина, соеди- ненных в полинуклеотидную цепь с остовом из чередующихся ос- татков сахара - дезоксирибозы, и фосфата. Последовательность нуклеотидов ДНК или пар оснований составляет информационную емкость молекулы, определяя порядок синтеза и аминокислотную последовательность белков в соответствии с универсальным для всех живых существ трехбуквенным - триплетным, генетическим кодом (Табл.1.1). Дезоксирибонуклеиновые кислоты представля- ют собой единственный тип молекул, способных к самовоспроиз- водству или репликации, что и обеспечивает преемственность генетической информации в ряду поколений. Записывается последовательность ДНК слева направо (5' - 3') первыми заг- лавными буквами соответствующих нуклеотидов, являющихся од- новременно единицами измерения молекулы. Размеры ДНК могут меняться в гигантских пределах от нескольких нуклеотидов до миллиардов пар оснований (п.о.). В качестве единиц измерения размеров ДНК используются также килобазы (kb) и мегабазы
(mb) - последовательности, соответствующие тысячи и миллиону пар оснований, соответственно.
ДНК могут существовать как в виде однонитевых, так и в виде двухнитевых молекул. Двухнитевые или двухцепочечные мо- лекулы образуются за счет химического комплементарного спа- ривания между аденином и тимином (А - Т) и между гуанином и цитозином (Г - Ц). Эти водородные связи между парами нуклео- тидов достаточно непрочные, так что цепи ДНК могут легко диссоциировать - разделяться, и ассоциировать - соединяться, при изменении температуры или солевых концентраций. При каж- дом цикле ассоциаци - диссоциации или, как еще говорят, от- жиге - плавлении, будет точно воспроизводиться двухнитевая структура - дуплекс, устойчивость которого определяется со- ответствием нуклеотидных пар. Наиболее устойчивы структуры, представленные полностью комплементарными нитями ДНК. Про- цесс образования дуплексов носит название гибридизации. Спо- собность к комплементарному спариванию оснований - одно из самых замечательных свойств ДНК, определяющих возможность ее саморепликации и точного выбора специфических участков акти- вации молекулы в процессе считывания генетической информа- ции. Это свойтво широко используется в молекулярной биологии для поиска и идентификации нужных последовательностей в ог- ромных молекулах ДНК при использовании в качестве зондов ее сравнительно небольших меченых фрагментов.
У человека большая часть ДНК- 3.2 миллиарда пар основа- ний, находится в ядрах клеток в виде 46 плотно упакованных, суперскрученных за счет взаимодействий с ядерными белками структур, называемых хромосомами. Сравнительно небольшая часть ДНК - около 5%, пристствует в митохондриях - органел- лах цитоплазмы, обеспечивающих процессы дыхания и энерегети- ческого обмена клеток эукариот. В большинстве соматических клеток ДНК представлена в двух копиях - по одной в каждой хромосоме. Таким образом, в клетках присутствуют 23 пары хромосом, 22 из которых гомологичны друг другу - аутосомы, и одна пара (X и Y) - половые хромосомы. Наличие Y хромосомы определяет мужской пол особи. При записи нормального карио- типа индивидуума указывается общее число хромосом и тип по- ловых хромосом. Таким образом, нормальный кариотип мужчины -
46,XY, а женщины -46,XX. В процессе гаметогенеза происходит случайное расхождение гомологичных хромосом в мейозе и в каждой зрелой половой клетке - гамете, остается только 23 хромосомы, то есть гаплоидный набор хромосом. При этом в каждой гамете сохраняется лишь одна половая хромосома - го- носома. В яйцеклетках это X хромосома, тогда как сперматозо- иды с равной вероятностью несут как X, так и Y хромосому, то есть пол будущей особи детерминируется геномом сперматозои- да. При оплодотворении диплоидный набор хромосом восстанав- ливается. В соответствии с современными представлениями ге- ном человека состоит из 25 хромосом, 22 из которых аутосомы,
2 половые хромосомы и одна митохондриальная . В каждой клет- ках присутствует порядка 1000 митохондрий, а в каждом мито- хондрионе содержится около 10 кольцевых митохондриальных хромосом, сходнах с хромосомами бактерий. Таким образом, в клетках присутствует около 1000 копий митохондриальных хро- мосом.
В хромосомах эукариот ДНК находится в двухнитевой форме, что обеспечивает возможность ее точной репликации при каждом цикле деления клетки. Одна нить кодирующая или смысловая, комплементарная ей нить - антисмысловая. Декодирование ин- формации, заключенной в молекуле ДНК, или процесс транскрип- ции, осуществляется за счет избирательного синтеза молекул
РНК, комплементарных определенным участкам ДНК, так называе- мых первичных РНК транскриптов. Транскрибируемые участки ДНК носят название генов. Рибонуклеиновые кислоты (РНК) по своей структуре очень сходны с молекулами ДНК. Они также состоят из четырех нуклеотидов, только одно из пиримидиновых основа- ний - тимин, заменено на урацил и в сахарозном остове вместо дезоксирибозы представлена рибоза. Молекулы РНК существуют только в однонитевой форме, но могут образовывать дуплексы с молекулами ДНК. После синтеза молекулы РНК претерпевают достаточно сложную модификацию - процессинг. При этом про- исходят изменения в концевых участках молекул и вырезаются области, гомологичные интронам - некодирующим частям гена.
Этот процесс называется сплайсингом. В результате из первич- ных РНК транскриптов образуются молекулы информационной или матричной РНК (мРНК), представляющие собой непрерывную последовательность нуклеотидов, гомологичную только экзонам
- смысловым участкам гена. Молекулы мРНК в виде рибонуклео- протеиновых гранул выходят из ядра в цитоплазму и соединяют- ся с рибосомами, где происходит процесс трансляции - синтез полипептидной цепи. Трансляция мРНК происходит в точном со- ответствии с генетическим кодом, согласно которому последо- вательность из трех нуклеотидов РНК - кодон, соответствует определенной аминокислоте или сигналу терминации синтеза по- липептидной цепи (Табл.1.1). Реализация генетического кода осуществляется с участием 20-ти типов транспортных РНК
(тРНК), единственных нуклеиновых кислот, содержащих в своем составе наряду с нуклеотидами одну из аминокислот. тРНК име- ют кленовообразную форму, в хвостовой части молекулы распо- ложена определенная аминокислота, в точном соответствии с последовательности из трех нуклеотидов в области, называемой антикодоном. Прохождение мРНК по рибосоме является сигналом приближения к рибонуклеопротеидному комплексу той тРНК, у которой последовательность нуклеотидов в антикодоне компле- ментарна кодирующему триплету мРНК. Таким образом транспор- тируется соответствующая аминокислота и осуществляется пос- ледовательный синтез полипептидной цепи. Митохондрии имеют свою автономную систему белкового синтеза: рибосомальные
РНК, мРНК и транспортные РНК.
Генетический код универсален для всех живых существ - это одно из его главных свойств. Небольшие отличия в струк- туре кода найдены только для митохондриальной ДНК. Так в ми- тохондриальном генетическом коде стоп кодонами являются триплеты АГА и АГЦ, кодирующие аргинин в ядерной ДНК
(Табл.1.1). Универсальность генетического кода служит наибо- лее веским аргументом в пользу гипотезы об едином источнике возникновения жизни на земле и о филогенетическом родстве всех видов живых существ. Кроме того, именно это свойство обеспечивает возможность прочтения в любых модельных клеточ- ных системах искусственно введенной генетической информации, сконструированной из фрагментов ДНК разного видового про- исхожденеия. Таким образом, вся генная инженерия основана на универсальности генетического кода. Другим свойством генети- ческого кода является его вырожденность, заключающаяся в том, что все аминокислоты кроме двух кодируются несколькими вариантами триплетов. Действительно, из 64 возможных комби- наций нуклеотидных триплетов РНК три соответствуют термини- рующим кодонам - ochre, amber и opal, остальные варианты
(61) кодируют 20 аминокислот, причем триплеты, кодирующие одну и ту же аминокислоту, как правило, различаются по третьему нуклеотиду в кодоне. Таким образом, зная нуклеотид- ную последовательность кодирующего участка ДНК, можно одноз- начно прогнозировать аминокислотную последовательность соот- ветствующего полипептидного фрагмента, тогда как одна и та же аминокислотная последовательность может кодироваться раз- личным образом. При этом, число возможных вариантов кодирую- щих ДНК резко возрастает с увеличением длины полипептида.
На следующем этапе полипептидные цепи транспортируются к специфическим органеллам клетки и модифицируются с образо- ванием зрелого функционально активного белка. В некоторых случаях информация с молекул РНК может обратно транскрибиро- ваться в молекулы ДНК. В частности, при обратной транскрип- ции мРНК образуются молекулы комплементарной ДНК - кДНК, в которой в зависимости от полноты процесса представлены частично или полностью все смысловые кодирующие последова- тельности гена. Рассмотренная схема реализации однонаправ- ленного потока информации ДНК-РНК-Белок составляет основу центральной молекулярно-биологической догмы - рис.1.1.
Более детально с процессами репликации, транскрипции, процессинга и трансляции можно ознакомиться в многочисленных руководствах по молекулярной биологии, цитологии и генетике
(Стент, Кэлиндер, 1981; Зенгер, 1987; Льюин, 1987).
1.2 Выделение ДНК, ее синтез и рестрикция.
ДНК может быть изолирована из любого типа тканей и кле- ток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис клеток, удаление с помощью центрифугирования фрагмен- тов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и хлороформа, концентрирование молекул ДНК путем преципитации в этаноле. Из 1 грамма сырой ткани или из 10!9 клеток обычно получают 2 миллиграмма ДНК. У человека ДНК, чаще всего, вы- деляют из лейкоцитов крови, для чего собирают от 5 до 20 мл венозной крови в стерильную пробирку с раствором, пре- пятствующим коагуляции (например, с глюгециром или гепари- ном). Затем отделяют лейкоциты и разрушают клеточные и ядер- ные мембраны добавлением буферных растворов, содержащих де- натурирующие агенты. Наилучшие результаты при выделении ДНК дает применение протеиназы-К с последующей фенол - хлоро- формной экстракцией разрушенных белков. ДНК осаждают в эта- ноле и растворяют в буферном растворе. Оценку качества экс- трагированной ДНК проводят на основании измерения оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового спектров поглощения. В чистых образцах ДНК соотношение
А(260)/A(280) > 1.8. В противном случае процедуру очистки необходимо повторять, так как для успешного использования и хранения ДНK белки должны быть полностью удалены. Более под- робно с методами выделения и очистки ДНК из различных тканей можно ознакомиться в работах и руководствах, приведенных в конце книги (Маниатис и др., 1984; Дейвис, 1990; Горбунова и др., 1991).
В процессе сложного и многообразного функционирования различные участки хромосом и ДНК претерпевают разнообразные регулируемые и, в основе своей, обратимые изменения. Эти мо- дификации осуществляются с помощью специальных белков - фер- ментов. Описание ферментативного аппарата репликации, транс- крипции, репарации - системы защиты и восстановления повреж- денных участков ДНК, рекомбинации, то есть обмена участками гомологичных хромосом и ДНК, далеко выходит за рамки нашего изложения. Мы кратко ознакомимся только с двумя классами ферментов ДНК - полимеразами и рестриктазами, особенно важ- ными для понимания основ современной молекулярной диагности- ки.
Ферменты, осуществляющие синтез ДНК, называются ДНК-по- лимеразами. И в бактериальных клетках, и в клетках эукариот содержатся три различные формы ДНК-полимераз, все они обла- дают синтезирующей активностью и способны удлинять цепи ДНК в направлении 5' - 3', последовательно наращивая по одному нуклеотиду к 3'-OH концу, причем точность синтеза определя- ется специфичностью спаривания оснований. Таким образом, для работы ДНК-полимеразы необходима однонитевая матричная ДНК с двухнитевым участком на 3'- конце молекулы. Кроме того, в среде должны присутствовать четыре типа трифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP) - молекул, состоящих из основания -A,C,G или T, сахара - дезоксирибозы (d) и трех фосфатных остатков
(P). В клетках эукариот репликацию осуществляет ДНК-полиме- раза альфа, а в клетках E. coli - ДНК-полимераза 111.
ДНК-полимеразы обладают различными активностями, в том числе и экзонуклеазной в направлении 3' - 5', что позволяет им исправлять - репарировать, дефекты, допущенные при подборе комплементарных оснований. ДНК-полимераза 1 E. coli способна инициировать репликацию в месте разрыва ДНК и замещать гомо- логичный участок в двойной цепи ДНК. Это свойство использу- ется для введения в ДНК меченых нуклеотидов методом ник-трансляции.
Открытие бактериальных ферментов, обладающих эндонукле- азной активностью - рестрикционных эндонуклеаз или рестрик- таз, значительно продвинуло исследование структуры ДНК и возможности генноинженерного манипулирования с молекулами
ДНК. In vivo эти ферменты участвуют в системе распознования и защиты "своих" и уничтожении чужеродных ДНК. Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4 - 6, реже 8 -
12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК и разрезают ее на фрагменты в местах локализации этих последовательностей, называемых сайтами рестрикции. Количество образующихся рест- рикционных фрагментов ДНК определяется частотой встречаемос- ти сайтов рестрикции, а их размер - характером распределения этих сайтов по длине исходной молекулы ДНК. Чем чаще распо- ложены сайты рестрикции, тем короче фрагменты ДНК после рестрикции. В настоящее время известно более 500 различных типов рестриктаз бактериального происхождения, причем каждый из этих ферметов узнает свою специфическую последователь- ность. Рестриктазы выделяют путем биохимической очистки из различных видов бактерий и обозначают тремя буквами, соот- ветствующими первым трем буквам латинского названия вида бактерий, и римской цифрой, соответствующей хронологии отк- рытия этого фермента у данного вида бактерий. В зависимости от частоты встречаемости сайтов рестрикции в молекуле ДНК различают три класса рестриктаз часто-, средне- и редкощепя- щие. Естественно, что рестриктазы, узнающие длинные специфи- ческие последовательности (8-12 п.о.), как правило, являются редкощепящими (например Nor1), а узнающие короткие (4-5 п.о.) - частощепящими (Taq1, EcoR1).
Сайты рестрикции могут быть использованы в качестве генетических маркеров ДНК. Действительно, образующиеся в ре- зультатае рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по длине путем электрофореза в агарозном или полиакриломидном геле, и тем самым может быть определена их молекулярная мас- са, а, значит, и физическое расстояние между сайтами. Напом- ним, что обычным методом выявления ДНК в геле, также как и
РНК, является ее специфическое окрашивание, чаще всего эти- диумом бромидом, и просмотр геля в проходящем ультрофиолете.
При этих условиях места локализации ДНК имеют красную окрас- ку. При использовании для рестрикции нескольких эндонуклеаз с последующим электрофоретическим анализом перекрывающихся аддитивных по длине фрагментов ДНК можно добиться полного упорядочивания сайтов узнавания для каждого из ферментов от- носительно друг друга и каких-то иных маркеров, присутствую- щих в исследуемой молекуле ДНК. Процесс этот называется фи- зическим картированием и является обязательным элементом анализа плазмидных, вирусных, бактериальных ДНК и относи- тельно небольших фрагментов ДНК эукариот. На рис.1.2. предс- тавлен простейший пример такого картирования в том случае, когда в исследуемой молекуле ДНК присутствует по одному сай- ту рестрикции для двух эндонуклеаз. После обработки исходной
ДНК отдельно каждой из рестриктаз образуется два фрагмента, соответствующих по длине расстоянию от концов молекулы ДНК до сайтов рестрикции. При совместной обработке обеими эндо- нуклеазами на электрофореграмме появляется новый фрагмент, размер которого соответствует расстоянию между сайтами рест- рикции. Очевидно, что эти данные еще не позволяют однозначно определить положение сайтов рестрикции по отношению к концам молекулы ДНК. Однако, достаточно знать расположение хотя бы одного маркера для того, чтобы произвести точное физическое картирование исходной молекулы ДНК независимо от количества локализованных в ней сайтов рестрикции.
При обработке тотальной геномной эукариотической ДНК, в частности ДНК человека, часто- или среднещепящими эндонукле- азами образуется так много фрагментов различной длины (в среднем, порядка 1 миллиона), что их не удается разделить с помощью электрофореза, то есть не удается визуально иденти- фицировать отдельные фрагменты ДНК на электрофореграмме.
После электрофореза рестрцированной геномной ДНК получается равномерное окрашивание по всей длине геля - так называемый шмер. Идентификация нужных фрагментов ДНК в таком геле воз- можна только путем гибридизации с мечеными ДНК-зондами. Это достигается при помощи метода блот-гибридизации по Саузерну.
1.3. Блот-гибридизация по Саузерну, гибридизация in situ.
Одним из наиболее эффективных методов идентификации определенных молекул ДНК среди электрофоретически разделен- ных фрагментов является ставший уже классическим метод блот-гибридизации по Саузерну, по фамилии автора Edцuard So- uthern, предложившего данный метод в 1975г . Последователь- ные этапы данного метода представлены на Рис.1.3. Суть мето- да заключается в том, что геномная ДНК подвергается рестрик- ции одной или несколькими рестриктазами, после чего образую- щиеся фрагменты разделяются по молекулярному весу в агароз- ном или акриламидном гелях. Затем ДНК подвергается денатура- ции in situ и переносится с геля на плотный носитель (обычно нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану). Сам пере- нос (блоттинг) осуществляется за счет действия капиллярных сил, электрического поля или вакуума. Фиксированную на филь- тре ДНК гибридизуют с радиоактивномеченым ДНК или РНК зон- дом. Методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме. Блот-гибридиза- ция - высоко чувствительный метод идентификации специфичес- ких последовательностей ДНК. При достаточно длительной экс- позиции (в течение несколько дней) и при высокой удельной радиоактивности ДНК-зонда (более 10!9 расп/ мин/микроГ) этот метод позволяет выявлять менее, чем 0,1 пикоГ ДНК. Так при использовании зонда размерами в несколько сот оснований уни- кальная последовательность в 1 000 п.о. может быть выявлена в 10 микроГ геномной рестрицированной ДНК в виде отдельной полосы на радиоавтографе после его экспозиции в течение 12 часов. Метод позволяет работать и с очень короткими олиго- нуклеотидными зондами (20 п.о.), однако требует особенно хо- рошего мечения и длительной экспозиции фильтра. Необходи- мость работы с чистыми препаратами ДНК, применение высокоме- ченых радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость всей процедуры делают её весьма дорогостоящей. Тем не менее, в ряде случаев и сегодня метод не потерял своего значения в том числе и для диагностики генных болезней. В последнее время для этих целей нередко используют различные варианты нерадиоактивного мечения или окраску ДНК азотно-кислым се- ребром.
Гибридизация с меченым ДНК-зондом препаратов ДНК или
РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предвари- тельной рестрикции и электрофореза носит название дот- или слот-гибридизации в зависимости от конфигурации пятна ДНК на фильтре, округлой или продолговатой, соответственно. На рис.1.3 также изображены последовательные этапы этих мето- дов. Попутно отметим, что метод гибридизации ДНК-зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК носит назва- ние Нозерн блот, тогда как Вестерн блот или иммуноблот - это связывание электрофоретически разделенных белков, фиксиро- ванных на фильтрах, с мечеными антителами. Название этих ме- тодов - дань уважения молекулярных генетиков профессору Сау- зерну, внесшему неоценимый вклад в разработку эксперимен- тальных подходов, используемых для анализа ДНК.
В ряде случаев для проведения гибридизации с ДНК зонда- ми не требуется предварительного выделения и очистки ДНК.
Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле, на фильтрах или в растворе, но и на гистологических или хромо- сомных препаратах. Этот метод носит название гибридизации in situ. Вариант метода, при котором в качестве зондов исполь- зуются препараты ДНК или РНК, меченые флюорохромами, называ- ется FISH (flurescein in situ hybridization). Меченый
ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафаз- ных хромосом. Предварительная обработка хромосом направлена на облегчение доступа зонда к геномной ДНК. Важное значение имеет также подбор условий, максимально способствующих про- цедуре гибридизации. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК и нанесения светочувствительной эмульсии (при использовании радиоактивной метки), либо проведения соответствующей обра- ботки (при использовании биотин- или флюоресцеин-меченых ДНК зондов) места локализации последовательностей ДНК, компле- ментарных использованному ДНК-зонду, можно непосредственно наблюдать в микроскоп в виде характерных точек над соответс- твующими участками определенных хромосом (Рис.1.4).
Гибридизация in situ, является одним из наиболее эф- фективных методов картирования комплементарных ДНК-зонду последовательностей ДНК на хромосомах. Эта методика особенно эффективна при исследовании распределения по геному повторя- ющихся последовательностей ДНК, клонированных последователь- ностей ДНК анонимного происхождения, при определении не только хромосомной принадлежности, но и внутри-хромосомной локализациии уникальных генов в тех случаях, когда имеются соответствующие ДНК-зонды. При этом разрешающая способность метода может достигать нескольких хромосомных бэндов. Сог- ласно последним данным, в экспериментах на специально приго- товленных и растянутых интерфазных хромосомах человека раз- решающая способность метода FISH может достигать 50 kb, что составляет всего около 1/20 величины среднего хромосомного бэнда. Проблемы взаиморасположения клонированных фрагментов
ДНК даже в пределах одного хромосомного локуса также с успе- хом решаются методом FISH.
Гибридизация in situ между молекулами РНК и кДНК-овыми зондами, проводимая на гистологических препаратах, является одним из наиболее эффективных методов анализа тканеспецифи- ческого распределения и внутриклеточной локализации мРНК
(Манк, 1990). Подробно с этим и другими современными мето- дом молекулярного и цитогенетического анализа, а также с их многочисленными модификациями и вариантами можно ознако- миться в серии работ, руководств и обзоров (Маниатис и др.,
1984; Дейвис, 1990; Sambrook et al., 1989).
1.4 ДНК-зонды, клонирование, векторные системы.
ДНК-зондом может служить любая однонитевая ДНК огра- ниченного размера, используемая для поиска комплементарных последовательностей в молекуле большего размера или среди пула разнообразных молекул ДНК. В ряде случаев в качестве зондов используют искусственным образом синтезированные оли- гонуклеотидные последовательности ДНК, размер которых обычно не превышает 30 нуклеотидов. Зондом также могут служить вы- деленные из генома последовательности ДНК. Однако значитель- но чаще такие последовательности предварительно клонируют, чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неог- раниченном количестве. Клонирование предполагает встраивание
(инсерцию) чужеродной экзогенной ДНК в векторную молекулу
ДНК, обеспечивающую проникновение этой конструкции в бакте- риальные клетки хозяина (Рис 1.5). Химерные молекулы ДНК, составленные из фрагментов разного происхождения, носят наз- вание рекомбинантных ДНК. В качестве клонирующих векторов используют модифицированные плазмиды, фаги, космиды, ретро- и аденовирусы, а также некоторые другие генетические конс- трукции. Размеры клонированных ДНК-зондов составляют от со- тен до нескольких тысяч нуклеотидов, что определяется, глав- ным образом, способностью вектора удерживать чужеродный фрагмент ДНК. Особенно широко применяют в качестве векторов плазмидную ДНК.
Плазмиды - это небольшие кольцевые двухцепочечные мо- лекулы ДНК, которые могут присутствовать в различном числе копий в бактериальных клетках. Открытие плазмид связано с изучением генетической природы антибиотикоустойчивости. Ока- залось, что именно плазмиды могут нести гены, сообщающие клеткам устойчивость к различным антибиотикам, и потеря чувствительности инфекционных бактерий к их действию как раз и происходит за счет отбора тех штаммов, в которых имеются плазмиды с соответствующей генетической информацией. Заме- тим, что присутствие плазмиды в бактериальной клетке вовсе не обязательно для обеспечения ее жизнедеятельности, так как при отсутствии антибиотиков в среде обитания бактерий штам- мы, не содержащие плазмид, вполне жизнеспособны. Плазмиды имеют автономную систему контроля репликации, обеспечивающую поддержание их количества в клетке на определенном уровне - от одного до нескольких сотен плазмидных геномов на клетку.
Обычно для клонирования выбирают плазмиды с ослабленным контролем репликации, что позволяет им накапливаться в клет- ке в большом числе копий. Конструирование плазмидных клони- рующих векторов заключается во внесении изменений в систему контроля репликации и в добавлении или вырезании генов анти- биотикоустойчивости или удобных для клонирования иных гене- тических элементов: специфических сайтов рестрикции, инициа- ции и регуляции транскрипции и т.п. Чаще всего для клониро- вания используют плазмиды pBR322, ColE1 или их производные.
Кольцевую молекулу плазмидной ДНК можно легко перевести в линейную форму путем единичного разрыва в месте локализа- ции уникального сайта рестрикции. Присоединение (встраива- ние, инсерция) фрагмента чужеродной ДНК к концам линейной молекулы осуществляется с помощью специфических ферментов
-лигаз, после чего гибридная плазмида вновь принимает коль- цевую форму. Разработаны достаточно простые и эффективные методы трансформации бактерий, то есть искусственного введе- ния плазмид в бактериальные клетки. При этом, присутствующие в плазмидах гены антибиотикоустойчивости используют в ка- честве маркеров трансформированных бактерий для их отбора на соответствующих селективных средах. При размножении трансформированных бактерий происходит увеличение числа ко- пий инсертированного фрагмента ДНК. Таким образом, этот чу- жеродный для бактерий генетический материал может быть полу- чен, практически, в любых количествах. Выделенная из бакте- рий плазмидная ДНК или изолированный из плазмиды инсертиро- ванный фрагмент могут быть в дальнейшем использованы в ка- честве ДНК-зондов.
Для некоторых целей в качестве клонирующих векторов оказалось удобнее использовать фаги - бактериальные вирусы.
Фаговая ДНК существует только в линейной форме, поэтому при ее рестрикции образуются два фрагмента, которые сшивают с чужеродной ДНК с образованием химерного фага. Чисто техни- чески эта операция проще, чем инсерция в плазмиду. Однако, размеры встраимовой ДНК ограничены пакующей способностью го- ловки фага. Поэтому при конструировании вектора вырезают последовательности фаговой ДНК, не имеющие критического зна- чения для жизнеобеспечения фага. Такой бактериофаг может су- ществовать только в том случае, если в него встроена чуже- родная ДНК, по размерам сопоставимая с вырезанной фаговой
ДНК. Наиболее удачные конструкции векторов были получены на основе фага лямбда - лямбда gt10, лямбда gt11, лямбда Zap.
Многие проблемы молекулярной генетики успешно решаются с использованием экспрессионных векторов, содержащих в своем составе регуляторные последовательности, обеспечивающие син- тез чужеродных белков в клетках хозяина. Так в случае лямбда gt11 фаги могут быть выращены в, так называемых, репликатив- ных условиях, обеспечивающих экспрессию инсертированной ДНК.
Так как обычно ДНК встраивают в район локализации маркерного гена, позволяющего вести селекцию химерных фагов, то экспрессироваться будет слитый белок, в котором часть поли- пептидной цепи будет соответствовать маркерному белку, а часть цепи будет транслироваться в соответствии с информаци- ей, заключенной во встроенном фрагменте ДНК. Этот белок мо- жет быть идентифицирован путем детекции фрагмента маркерного белка либо с помощью антител к специфическим участкам, коди- руемым чужеродной ДНК.
В последнее время большое распространение получило клонирование в космидах - конструкциях, обьединяющих в себе преимущества плазмид и фагов. Космиды получены на основе плазмид, но в них введены генетические элементы фага лямбда, отвечающие за упаковку ДНК в фаговой частице. Такие векторы могут существовать не только в виде плазмид, но и в виде фа- говых частиц in vitro. Космиды обладают большей клонирующей способностью по сравнению с плазмидными и фаговыми векторами и могут нести до 40-45 тысяч пар оснований инсертированной
ДНК. Все вышеперечисленные векторы используются для клониро- вания в прокариотических системах.
Векторы, пригодные для направленного переноса в эука- риотические клетки, конструируют на основе прокариотических или дрожжевых плазмид - единственных плазмид, найденных в клетках эукариот, а также используют различные эукариоти- ческие вирусы, чаще всего ретровирусы, аденовирусы или аде- ноассоциированные вирусы. При использовании плазмид в ка- честве клонирующих векторов в них вводят вирусные последова- тельности, ответственные за начало репликации. Введение век- торов в эукариотические клетки часто осуществляют путем ко-трансформации, то-есть одновременно вводят плазмиду и сегмент чужеродной ДНК. Векторные последовательности, вве- денные в клетки эукариот, могут сохраняться там в течение нескольких дней в виде суперскрученных кольцевых молекул - эписом. В редких случаях возможна интеграция экзогенной ДНК в хромосомную ДНК. В этих случаях введенные последователь- ности устойчиво сохраняются в геноме клеток хозяина и насле- дуются по менделевскому типу (см. Глава VIII).
Для клонирования субхромосомальных фрагментов ДНК, со- держащих целые гены, разработана система дрожжевых минихро- мосом. Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC - artificial yeast chromosomes) конструирют на основе плазмидных векто- ров, содержащих в своем составе известные центромерные и те- ломерные последовательности хромосом дрожжей, необходимые для поддержания и репликации векторов в клетках хозяина. Та- кие системы способны удерживать фрагменты чужеродной ДНК размером в несколько сотен тысяч и даже миллионов пар осно- ваний.
Остановимся коротко на методах введения векторов в клетки хозяина. Но прежде всего, определим основные термины. Как уже упоминалось, введение плазмидной ДНК в бактериальные клетки назвается трансформацией. Если перенос генов осущест- вляется с помощью фага, то говорят о трансдукциии. Процесс введения экзогенной ДНК в эукариотические клетки называется трансфекцией. Все эти методы основаны на подборе условий, облегчающих прохождение плазмидной или фаговой ДНК через клеточные и ядерные мембраны. Для повышения проницаемости мембран используют два разных подхода. В первом случае про- водят обработку векторной ДНК и клеток хозяина буферными растворами, повышающими проницаемость клеточных и ядерных мембран (метод кальций-фосфатной преципитации,
DEAE-декстран-опосредованная трансфекция). Во втором случае используют краткосрочное физическое воздействие на клетки для создания в мембранах микропор, проходимых для макромоле- кул ДНК (метод электропорации - воздействие высоковольтным электрическим полем, "бомбардировка" частицами золота и т.п.). Более подробно проблемы векторов и методы генетичес- кой трансфрмации (трансдукции) рассмотрены в Главе IX. Воп- росам молекулярного клонирования также посвящена обширная литература (Гловер, 1988; 1989; Шишкин, Калинин, 1992; Мани- атис и др., 1984; Дейвис, 1990; Sambrook et al., 1989).
1.5 Геномные и к-ДНК-овые библиотеки генов, их скрининг.
Рассмотрим более подробно методы выделения и идентифи- кации фрагментов ДНК, необходимых для анализа или для использования в качестве ДНК-зондов. Основным источником этих фрагментов являются искусственным образом сконструиро- ванные библиотеки генов, в которых осуществляют поиск или скрининг нужных последовательностей ДНК разными методами в зависимости от специфических особенностей этих последова- тельностей. Библиотека генов это полный набор клонированных перекрывающихся фрагментов ДНК, полученных в результате рестрикции или механического разрезания тотальной ДНК, выде- ленной из какого-либо специфического источника. В зависи- мости от происхождения ДНК различают геномные и кДНК-овые библиотеки генов. Для конструирования геномных библиотек ис- пользуют ДНК, выделенную из тканей, культур клеток, из от- дельных хромосом или из их фрагментов. При создании кДНК
-овых библиотек выделяют тотальную мРНК из тканей или куль- тивируемых клеток, в которых заведомо экспрессируются инте- ресующие исследователя гены. На следующем этапе методом об- ратной транскрипции (РНК-ДНК) синтезируют кДНК. Затем её разрезают и упаковывают в выбранный для клонирования вектор.
Схема конструирования геномных и кДНК-овых библиотек предс- тавлена на рис.1.6. Как видно на схеме в геномных библиоте- ках присутствуют не только кодирующие последовательности ге- нов, но также несмысловые внутригенные последовательности - интроны и межгенные участки ДНК, причем удельный вес некоди- рующих фрагментов ДНК значительно выше. кДНК-овые библиотеки состоят только из кодирующих - экзонных, областей генов. На- иболее удобный размер инсертируемой ДНК сопоставим со сред- ним размером гена млекопитающих и составляет 15 - 25 тысяч пар оснований (kb). Оптимальный по размеру набор перекрываю- щихся последовательностей геномной ДНК человека получается после ее переваривания частощепящими рестриктазами Sau3a или
Mbo1. Информационная емкость каждой библиотеки, то есть ко- личество клонов с различными инсертированными фрагментами
ДНК, определяется размерами исходного генома и необходи- мостью присутствия каждой его последовательности хотя бы в одном клоне. Поэтому достаточно представительные геномные библиотеки млекопитающих обычно содержат не менее 8*10!5 -
10!6 различных клонов.
Чаще библиотеки конструируют на основе фаговых или космидных клонирующих векторов, так как в таком виде легче хранить большие количества химерных ДНК. Для создания библи- отек генов человека особенно удобны векторы, полученные на основе фага лямбда, такие как EMBL3 или EMBL4. Пакующая способность этих векторов от 9 до 23 кб, они содержат много удобных клонирующих сайтов, так что для инсерции ДНК могут быть использованы разные рестриктазы. Кроме того, эти векто- ры не содержат последовательностей плазмид, наиболее часто используемых для клонирования : pBR322 и ColE1. Это позволя- ет проводить отбор нужных клонов с помощью фаговой ДНК, не вырезая предварительно инсертированный в нее фрагмент. Для создания библиотек клонов, содержащих большие районы ДНК, используется технология искусственных дрожжевых хромосом
-YAC. Последние представляют собой крупные (до 1 млн п.о.) фрагмены геномной ДНК человека, сшитые с центромерными райо- нами хромосом дрожжей. После идентификации в таких библиоте- ках нужных клонов с инсертированными фрагментами чужеродных
ДНК последние могут быть субклонированы в фаговых или космидных библиотеках.
Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на фильтрах с олигонуклеотидными, кДНК-овыми или любыми иными
ДНК-зондами, а также с помощью антител, если библиотека сконструирована на основе экспрессионного вектора (рис.1.7).
Для этого химерные фаги, составляющие библиотеку, высевают на плотно растущий в чашках Петри газон бактерий таким обра- зом, чтобы образовались отдельные литические бляшки в ре- зультате инфецирования клеток одним рекомбинантным фагом.
Все культуры дублируют путем отпечатка - реплики, на другие чашки Петри. Затем на исходные культуры накладывают фильтры и переносят на них растущие и лизированные колонии, проводят их разрушение, фиксацию белков и ДНК на фильтре и блот гиб- ридизацию с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными ан- тителами (для экспрессионных библиотек). После отмывки филь- тров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локали- зации колоний, содержащих в инсертированном фрагменте ДНК последовательности, комплементарные зонду, или специфические антигены. Отбор положительных колоний фагов на дублированных культурах производят именно в тех местах, где произошло по- темнение пленки. Чтобы избежать возможного загрязнения, отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринирова- нию. Обычно, инсертированную ДНК изолируют из бактериофага и субклонируют в плазмидном векторе, позволяющем наращивать большие количества этой ДНК.
1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.
Следующими этапами анализа отобранного и клонированного
ДНК фрагмента являются его физическое картирование и опреде- ление нуклеотидной последовательности, то есть секвенирова- ние. Методология секвенирования достаточна проста и заключа- ется в том, чтобы получить серию комплементарных молекул
ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике, однако, определение нуклеотидной последовательности протя- женных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую за- дачу. Существует два основных метода секвенирования: хими- ческое - метод Максама-Гильберта и дидезоксисеквенирование - метод Сэнджера. В первом случае используют химическое расщепление ДНК по одному основанию, во втором - синтезируют нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез на заданном основании.
Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, так как он более надежный и простой в исполнении. Принцип данно- го метода показан на рис.1.8. На первом этапе ДНК денатури- руют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют секвенирующий праймер - искусственно синтезированную олиго- нуклеотидную последовательность, комплементарную определен- ному участку исходной молекулы ДНК. Создают условия для гиб- ридизации праймера, то есть для образования двухцепочечного участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную смесь ДНК-полимеразу и трифосфаты - dATP, dCTP, dGTP и dTTP, один из которых является радиоактивным. Синтез ведут в четы- рех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют один из специфических дидезоксинуклеотидов или терминаторов
- ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP. При встраивании ddNTP на место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается.
Таким образом, в каждой из пробирок получают набор различаю- щихся по длине радиоактивномеченых фрагментов ДНК с одним и тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминато- ром на конце молекулы. После одновременного электрофорети- ческого разделения этих фрагментов на четырех соседних до- рожках и радиоавтографии, размер синтезированных фрагментов может быть определен, а значит и определена локализация ди- дезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов в исходной молекуле ДНК (Рис.1.9). На каждом секвенирующем геле может быть определена первичная последовательность все- го около 500 пар оснований. В своем первоначальном варианте этот метод является достаточно трудоемким и дорогостоящим.
Достаточно заметить, что цена одного звена (шага) в цепи ДНК в Международной Программе "Геном человека" еще несколько лет назад оценивалась в 1$.
В качестве модификаций метода Сэнджера используют пред- варительное клонирование ДНК в векторах, сконструированных на основе фага M13, для получения протяженных однонитевых участков ДНК, которые могут быть непосредственно секвениро- ваны без денатурации и праймирования. Очень эффективной ока- залась система векторов mp8 и mp9, позволяющих вести сиквенс одовременно в обоих направлениях и прочитывать участки боль- шей протяженности. Интенсивно разрабатывается методология автоматического ДНК секвенирования. Особенно перспективным для массового секвенирования в автоматическом режиме оказа- лось применение меченых различными флюорохромами дидеокси- нуклеотидов. В этом варианте каждому из нуклеотидов соот- ветствует свой цвет полосы в геле, который легко учитывается автоматически. Этот метод нашел особенно широкое применение в реализации программы Геном человека. По последним данным, разработка автоматических секвенаторов позволила снизить стоимость одного звена до 0,5$ и резко повысить эффектив- ность этого процесса. Так, на 30 автоматических секвенаторах фирмы Applied Biosystems за одну неделю работы в 1994г.мож- но было просеквенировать до 1 млн пар оснований.
В последние годы активно разрабатываются принципиально новые, более эффективные и экономичные методы секвенирова- ния. Особенно перспективным на сегоднешний день представля- ется метод секвенирования путем гибридизации исследуемой последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов, так назы- ваемой олигонуклеотидной матрицей (Мирзабеков, 1990; Барский и др.,1994; Southern, et al, 1992). Наиболее удобными для этой цели являются наборы матриц - чипы, в ячейках которых пришиты (иммобилизованы) октануклеотиды. Суть данного подхо- да в том, что пришивается набор всех возможных вариантов пе- рестановок из 4-х стандартных нуклеотидов (А,Г,Ц,Т) опре- деленной длины, при этом в случае октануклеотидов количество возможных вариантов нуклеотидов составляет 65536. Секвениру- емый фрагмент ДНК метят радиоактивным фосфором и гибридизуют с октануклеотидной матрицей. Фрагмент ДНК гибридизуется только с теми октануклеотидами, последовательности которых комплементарны его участкам. Таким образом, определяется на- бор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в иссле- дуемом фрагменте ДНК. После этого, при помощи специальной компьютерной обработки упорядочивается расположение этих ок- тамеров в изучаемом фрагменте ДНК. Этот перспективный метод позволяет значительно ускорить время секвенирования за счет автоматизации процесса.
1.7 Полимеразная цепная реакция.
До недавнего времени гибридизация с ДНК-зондами и клони- рование являлись единственными способами поиска и выделения специфических геномных или к-ДНК-овых последовательностей
ДНК с целью их дальнейшего исследования. Не говоря уже о большой трудоемкости этих методов, они имеют ряд принципи- альных недостатков и ограничений. Во-первых, исследуемые фрагменты значительно превосходят по длине ДНК-зонды и слиш- ком велики для прямого молекулярного анализа. Концы этих последовательностей не могут быть выбраны произвольно, так как определяются наличием соответствующих рестрикционных сайтов в исследуеммой молекуле ДНК. Во-вторых, для проведе- ния успешной рестрикции и гибридизации необходимо большое количество хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК
(не менее 10 микроГ на одну реакцию). Такое количество ДНК обычно получают из 3- 5 мл крови. Часто это количество ока- зывается слишком большим, если учесть, что речь идет о детях и о тяжело больных людях. Кроме того, необходимость немед- ленного использования собранной крови для выделения ДНК или хранения ее до использования при -20 С затрудняет исследова- ние нетранспортабильных пациентов или родственников, прожи- вающих на отдаленном расстоянии от исследовательских цент- ров. В-третьих, для геномной гибридизации, как правило, не- обходимы радиоактивные ДНК-зонды с высокой удельной актив- ностью, не менее 10!8-10!9 имп./мин/мкГ., причем они должны быть использованы в течение очень короткого периода после их приготовления. Кроме того, работа с радиоактивным материалом требует соблюдения необходимой техники безопасности и нали- чия специально оборудованного изотопного блока, что возможно лишь для некоторых диагностических центров. В-четвертых, не- обходимость длительной экспозиции автографов значительно уд- линяет время получения результатов, что также ограничивает использование методов блот-гибридизации для пренатальной ди- агностики плода, специфика которой во многом определяется сроком беременности.
Предложенный в 1983г. американским исследователем
Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993г., альтернативный метод анализа геномной ДНК - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), явился эпохальным открытием молекулярной биологии нашего века. Метод ПЦР или специфической амплификации ДНК позволяет избирательно синте- зировать in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, реже до 1000 - 2000 п.о., используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность.
Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нук- леотидной последовательности амплифицируемой области ДНК, так как специфический выбор этого участка осуществляют путем гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезиро- ванными праймерами - олигонуклеотдными последовательностями
ДНК, длиной, обычно, от 15 до 30 п.о., комплементарными 3'- концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между праймерами определяяет длину синтезируемых молекул. В ка- честве матрицы для синтеза может быть использован любой тип
ДНК - геномная ДНК отдельных индивидуумов различных видов про- и эукариот; ДНК, выделенная из культур клеток, бактери- альных клонов, библиотек генов или из других источников. Для проведения специфической амплификации не требуется больших количеств матричной ДНК и, в принципе, достаточно даже одной молекулы ( Li et al., 1988). Успех в разработке метода ПЦР в значительной мере связан с использованием в качестве фермен- та, обеспечивающего синтез ДНК, термофильной ДНК полимеразы, выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и по- тому устойчивой к действию высоких температур (Kogan et al.,
1987).
Принципиальная схема полимеразной цепной реакции пока- зана на Рис.1.10. На первом этапе исследуемая двухнитевая матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее наг- ревания в течение нескольких минут до температуры, превышаю- щей +95 - +98 С. Дальнейшая схема проведения ПЦР достаточно проста и заключается в чередовании циклов (1) гибридизации или отжига ДНК с праймерами, (2) синтеза последовательности, комплементарной матричной ДНК, и (3) денатурации образовав- шихся двухнитевых структур. При гибридизации, достигаемой за счет понижения температуры реакционной смеси до +30 - + 50
С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго специфичных областях, комплементарных праймерам. При темпе- ратуре, оптимальной для работы ДНК-полимеразы - +60 - +70 С, начинается синтез ДНК в направлении 5' - 3' с двухнитевого участка, образованного праймерами. Затем при нагревании раствора примерно до +80 - +90 С синтез прекращается и двух- нитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК расплавляется (денатурирует). В первом цикле олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а за- тем в последующих циклах и с вновь синтезированными молеку- лами ДНК по мере их накопления в растворе. В последнем слу- чае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифициро- ванного участка, что и определяет, в кончном счете, размер вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного нуклеотида.
Таким образом, при каждом цикле происходит двухкрат- ное увеличение числа синтезированных копий выбранного для амплификации участка ДНК и содержание продуктов амплификации в растворе нарастает в геометрической прогрессии. Каждая из процедур цикла определяется двумя параметрами - температурой реакции и ее длительностью, меняющейся в диапозоне от десят- ков секунд до 1 - 3 минут, так что полный цикл длится от одной до несколько минут. За 25 - 30 циклов число синте- зированных копий ДНК достигает нескольких миллионов. ПЦР обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого специальные приборы - термоциклеры или амплификаторы ДНК.
Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждой процедуры цикла из большой и часто непрерывной шкалы возможных вариантов. В техническом исполнении ПЦР очень проста. Все компоненты реакции - матричную ДНК, олигопрайме- ры, смесь трифосфатов и термофильную ДНК полимеразу добавля- ют в специфический буфер (часто одномоментно), наслаивают небольшой обьем вазелинового масла для предотвращения раст- вора от высыхания, затем помещают пробирку с реакционной смесью в автоматический термоциклер и выбирают необходимую программу циклической смены температуры и длительности каж- дого шага реакции. Общий обьем реакционной смеси, обычно, составляет от 10 до 50 - 100 микролитров. Выбор оптимального режима работы определяется длиной и специфичностью амплифи- цируемого участка. Следует подчеркнуть, что, реально, для каждой полимеразной реакции в звисимости от типа праймеров, длины амплифицированного фрагмента, особенностей его первич- ной нуклеотидной структуры, а также от типа используемой термофильной ДНК-полимеразы оптимальные режимы температуры и состав амплификационной смеси могут существенно варьировать и зачастую подбираются эмпирически.
С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а также изучать наличие любых других специфических особен- ностей ДНК. Подбор системы олигопраймеров производят на основании анализа нуклеотидной последовательности амплифици- руемого участка. Разработаны различные варианты автомати- ческого поиска последовательностей ДНК, использование кото- рых в качестве праймеров оптимизирует процедуру амплификации специфического участка геномной ДНК. Для того, чтобы гибри- дизация проходила строго специфично, праймеры не должны со- держать повторяющихся последовательностей ДНК. Мы уже отме- чали, что для проведения ПЦР достаточно минимального коли- чества ДНК, вплоть до одной молекулы. Кроме того, различные органические компоненты клеток, такие как белки, липиды, уг- леводы, фрагменты клеточных органелл или мембран заметно не препятствуют процессу амплификации. Поэтому в качестве источника матричной ДНК может быть использован любой, даже деструктурированный биологический материал, сохранивший в своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных молекул ДНК. Для специфической амплификации наряду с очищен- ной ДНК используют высушенные на фильтровальной бумаге пятна крови, небольшие кусочки тканей, например, такие как ворсины хориона, смывы из полости рта, луковицы корней волос, куль- туры клеток и сливы среды с клеточных культур, содержащие не прикрепившиеся и не давшие роста клетки, соскребы с цитоге- нетических препаратов и, что особенно удивительно, получен- ные при паталогоанатомическом анализе и длительно хранивши- еся фиксированные ткани (Higuchi, R. et al., 1988). Более подробные сведения о постановке ПЦР можно получить в ряде специальных руководств и инструкций.
Существуют различные модификации ПЦР, которые исполь- зуются в зависимости от конкретных целей проведения реакции или от характера последующего молекулярного анализа амплифи- катов. Так, для трудноамплифицируемых участков ДНК (содержа- щих различные повторяющиеся последовательности или необычные структурные элементы), а также в тех случаях, когда матрич- ная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в два раунда, используя в качестве матричной ДНК на втором этапе амплификации, или как еще говарят при доамплификации, продукты ПЦР, синтезированные в первом раунде. Часто в этих случаях для повышения специфичности праймирования используют систему, так называемых вмонтированных (nested) праймеров, то есть при доамплификации в качестве праймеров выбирают последовательности, локализованные внутри амплифицируемого в первом раунде участка ДНК.
В ряде случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР, то есть одновременную амплификацию нескольких участков мат- ричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в реакционную смесь меченые трифосфаты. Особого внимания зас- луживает возможность проведения ПЦР с молекулами кДНК.
На основе этой реакции разработаны методы анализа экспрессии генов и получения больших количеств кДНК. Уместно заметить, что реакцию амплификации можно проводить не только в раство- рах, но и непосредственно на хромосомных препаратах, при этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты амплификации будут гибридизоваться и выявлять комплементар- ные им участки ДНК на хромосомах (метод PRINS - polymerase reaction in situ). До настоящего времени доступными амплифи- кации были участки ДНК, не превышающие по длине 5 kb. В последнее время, благодаря внесению ряда кардинальных усо- вершенствований (особый подбор праймеров, использование сра- зу двух различных ДНК полимераз, трицинового буфера, специ- ального температурного режима полимеразных циклов), возможно проведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих 35 kb. В частности, таким образом удалось амплифицировать плазмиду со вставкой 8.5 kb, равной целому геному вируса HIV 1 (Cheng et al., 1994). И это еще не предел. В дальнейшем мы неоднократ- но будем возвращаться к описанию различных модификаций ПЦР, так как этот метод по праву стал один из основных в молеку- лярной диагностике наследственных болезней ( Erlich, 1993;
Rolfs et al., 1993; RT-PCR, Methods and Applications, 1991).
Возможность очень точного и специфичного выбора участ- ка ДНК для амплификации, небольшие размеры синтезируемых мо- лекул, их огромное количество черезвычайно облегчают молеку- лярный анализ продуктов ПЦР. Как правило, амплифицированную
ДНК можно непосредственно наблюдать в проходящем ултрофиоле- те в виде красной полосы после электрофоретического концент- рирования и обычного окрашивания геля этидиумом бромидом.
Кроме того, возможна идентификация этих молекул путем блот гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами.
При наличии сайтов рестрикции в амплифицированных участках
ДНК после их обработки эндонуклеазами и электрофореза коли- чество и положение окрашенных полос на геле изменяется в соответствии с положением этих сайтов (Рис. 1.11 ). Путем электрофореза могут быть выявлены небольшие отклонения в размерах синтезированных молекул, которые возникают за счет делеций или инсерций нескольких нуклеотидов в исходной мат- ричной молекуле ДНК; конформационные изменения в однонитевых молекулах ДНК, возникающие при замене оснований; а также структурные изменения в дуплексах между нормальными и му- тантными вариантами амплифицированных фрагментов ДНК. И, на- конец, возможно определение полной нуклеотидной последова- тельности синтезированных молекул с идентификацией всех му- таций в исследуемом районе матричной ДНК (см. Главу IV).
Разработаны варианты ПЦР, при которых синтезируются преиму- щественно однонитевые фрагменты ДНК, что в последуюшем зна- чительно облегчает их секвенирование. В дальнейшем мы более подробно рассмотрим методы генотипирования мутаций с помощью
ПЦР, позволяющие производить полный молекулярный анализ определенных участков ДНК у отдельных индивидуумов. При этом отпадает необходимость визуализации малых количеств ДНК пу- тем их гибридизации с мечеными геномными или кДНК-зондами.
Это не означает, конечно, что методы блот гибридизации и клонирования потеряли свою актуальность. Без их использова- ния невозможна молекулярная идентификация генов, предшеству- ющая разработке методов молекулярной диагностики с использо- ванием ПЦР.
ГЛАВА VI.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ.
Раздел 6.1 Дифференциальная активность генов, выбор адекватных биологических моделей.
Молекулярная идентификация гена, нарушение работы кото- рого приводит к развитию наследственного заболевания, созда- ет предпосылки для дальнейшего более подробного анализа ге- нетических и биохимических основ патогенеза и разработки на этой базе наиболее эффективных методов лечения. Начальные этапы решения поставленной задачи включают в себя иссследо- вание механизмов тканеспецифической экспрессии и регуляции активности генов в нормальных клетках, оценку клинического выражения различных типов нарушений гена, выявление первич- ного биохимического дефекта, а также сопоставление молеку- лярных основ работы генов в нормальных и мутантных клетках.
Естественно, что в различных тканях организма экспрессируется не все, а лишь определенные группы генов.
Исключение составляют лишь так называемые гены домашнего хо- зяйства (house-keeping genes), генопродукты которых обеспе- чивают жизнедеятельность всех типов клеток (см.Главу II). По весьма ориентировочным оценкам в тканях млекопитающих и че- ловека работают в среднем около 2-3% всех генов, в клетках печени - основной биохимической лаборатории организма - око- ло 5%, тогда как в клетках мозга - примерно 9-10% (Корочкин,
1977). Это означает, что в различных соматических клетках эукариот транскрибируется от 5 до 20 тысяч генов (Льюин,
1987). Значительная часть контролируемых ими белков необхо- дима для обеспечения жизнедеятельности самих клеток. В про- цессе онтогенеза и клеточной дифференцировки в разных тканях организма происходит избирательная активация многих других специфических генов, что, в конечном итоге, обусловливает значительные межклеточные различия в наборе белков и в ско- рости их синтеза.
Контроль генной активности осуществляется за счет диф- ференциальной транскрипции и процессинга РНК в клеточных яд- рах, различной стабильности мРНК в цитоплазме, избирательной трансляции мРНК. Дифференциальная экспрессия генов, конечным результатом которой является синтез функционально активного белка, предполагает не только адекватную регуляцию генной активности, но и полноценность всех последующих этапов, включая сам белковый продукт, его устойчивость, способность к посттрансляционным модификациям, правильную локализации и корректное взаимодействие с другими компонентами клетки. Ре- шающее значение для успешного анализа всего этого сложного комплекса имеет выбор адекватных биологических моделей, по- иск и целенаправленное конструирование которых представляет вполне самостоятельную научную задачу.
Наиболее доступными модельными системами для анализа экспрессии генов in vitro являются культуры клеток. Для кло- нирования, генноинженерного манипулирования, направленного введения сайт специфических мутаций, получения большого ко- личества клонированных последовательностей ДНК, специфи- ческих молекул мРНК, а также белкового продукта гена обычно используют генетически хорошо изученные прокариотические системы (Хеймс, Хиггинс, 1987). Для исследования процессов трансляции, посттрансляционных модификаций белка, его внут- риклеточной локализации и функционирования чаще используют культуры клеток эукариот и, в частности, специфические куль- туры клеток человека. Особая роль в изучении начальных эта- пов развития патологического процесса, обусловленного присутствием генных мутаций, а также в разработке терапевти- ческих методов, включая генноинженерную коррекцию метаболи- ческого дефекта, принадлежит культурам мутантных клеток. Это могут быть первичные или перевиваемые культуры клеток, полу- ченные из специфических тканей больного человека, либо выде- ленные из тканей линейных животных, служащих генетической моделью наследственного заболевания.
Идентификация гомологичных генов у экспериментальных животных во многих случаях значительно облегчает и ускоряют исследование функциональной активности нормальных и мутант- ных генов человека. Большая роль в изучении молекулярных ме- ханизмов развития патологических процессов in vivo принадле- жит генетическим линиям животных. Это могут быть линии, по- лученные в результате отбора спонтанно возникших или индуци- рованных мутаций, а также искусственно сконструированные мо- дели на базе трансгенных животных, в геном которых введен чужеродный ген или фрагмент ДНК. Рассмотрим основные экспе- риментальные подходы, используемые для анализа экспрессии генов.
Раздел 6.2 Анализ регуляторных элементов гена, изоляция и исследование мРНК, искусственные транскрипционные системы.
Регуляция экспрессии генов в цепочке ДНК - РНК - белок может осуществляться на различных молекулярных уровнях. В соответствии с этим исследования дифференциальной активности генов в разных типах клеток и тканей включают оценку работы контролирующих элементов генов, анализ молекул РНК на всех этапах от появления первичного транскрипта до зрелой мРНК и изучение соответствующего белкового продукта, включая его процессинг (созревание), внутриклеточную локализацию, тка- неспецифическое распределение .
Исследования регуляторных цис-действующих элементов ге- нома, таких как промоторы, инхансеры, участки ДНК, подавляю- щие транскрипцию, являются составной частью анализа молеку- лярной структуры любого гена. Идентификацию таких элементов проводят с использованием разнообразных современных методов молекулярной генетики. В частности, последовательности ДНК в
5'- фланкирующей области гена, ответственные за тканеспеци- фическую индукцию генной активности, могут быть локализованы путем исследования транскрипции в различных линиях клеток при введении в них генов с искусственными делециями этих участков ДНК. Для оценки активности идентифицированных регу- ляторных последовательностей их сливают с чужеродными хорошо изученными неиндуцибельными клонированными генами, так назы- ваемыми "репортерами". Такие генетические конструкции в составе векторных последовательностей вводят в культивируе- мые клетки эукариот и наблюдают за изменением уровня экспрессии. В качестве "репортера" часто использую ген хло- рамфеникол-ацетил-трансферазы (CAT-ген), который в естест- венных условиях экспрессируется только в клетках прокариот.
Сам фермент (CAT) обладает высокой активностью, что позволя- ет не только легко обнаруживать ее минимальные количества в клетке, но и с высокой точностью проводить количественную оценку. Для повышения чувствительности анализ экспрессии хи- мерных генов часто проводят в культуре фибробластов почек африканской зеленой мартышки (COS-клетки). Эти клетки моди- фицированы таким образом, что в них после трансфекции про- исходит амплификация копий сконструированных определенным образом эписом (внехромосомных генетических конструк- ций ( см. Главу X), что ведет к значительному усилению сиг- налов экспрессии введенных генов (трансгенов). Перенос генов
(трансгеноз) может быть осуществлен и на уровне целого орга- низма, в частности, зиготы. Полученные в результате подобных манипуляций трансгенные животные могут быть также использо- ваны в качестве модельной системы для анализа механизмов тканеспецифической активации генов in vivo.
Матричная РНК является наиболее удобным обьектом для изучения регуляции транскрипции генов и посттранскрипционных модификаций РНК. Тотальная клеточная РНК сотоит на 90 - 95% из рибосомальных и транспортных РНК, тогда как доля трансли- руемых или poly(A)+ РНК не превышает 5% (Льюин, 1987). При этом, концентрация РНК-транскриптов индивидуальных генов среди всех молекул мРНК, в среднем, колеблется в пределах от
0.01% до 0.001% (Гайцхоки, 1978). Поэтому для обнаружения индивидуальных типов мРНК должны использоваться высоко- чувствительные методы. Обычным методом идентификации мРНК на тканевом и клеточном уровнях является гибридизация in situ
РНК- или ДНК-зондов с молекулами мРНК на гистологических срезах (Хаффнер, Уиллисон,1990). В качестве ДНК-зондов используют клонированные последовательности кДНК и синтети- ческие олигонуклеотиды. После инкубации меченых зондов на цитологических препаратах с последующей тщательной отмывкой несвязавшихся молекул положение комплементарных РНК-последо- вательностей в клетках определяют радиоавтографическими, ли- бо в случае биотинового мечения - иммуногистохимическими ме- тодами. Оптимальные условия гибридизации дают возможность не только выявлять присутствие специфических мРНК, но и опреде- лить их внутриклеточную локализацию (Манк, 1990; Хаффнер,
Уиллисон, 1990; Boehringer, Mannual, 1994).
Анализ индивидуальных РНК включает изоляцию из тканей пула неповрежденных биологически активных мРНК и идентифика- цию среди них специфических молекул путем использования раз- личных вариантов ДНК-РНК гибридизации. Для генов с высоким уровнем транскрипции могут быть пригодны дот или слот блоты
(см.Главу I). Когда источником РНК служат клетки, которые не могут быть получены в большом количестве, используют цитоп- лазматический дот-блот. При этом целые клетки лизируют, и фиксируют непосредственно на тех мембранах, на которых про- водят гибридизацию. Значительно большой чувствительностью обладает, так называемый Northern blot (нозерн-блот) - гиб- ридизация с ДНК- зондами на фильтрах предварительно скон- центрированных и фракционированных путем электрофореза моле- кул РНК (Sambrook et al., 1987). Электрофорез проводят в агарозе с добавлением формальдегида, денатурирующего РНК. В этих условиях скорость продвижения молекул РНК через гель находится в логарифмической зависимости от длины последова- тельности, что позволяет точно определить размер РНК транскрипта. Основная масса РНК на геле представлена в виде двух доминирующих бэндов, соответствующих двум типам рибосо- мальной РНК - 28S и 18S. Все молекулы мРНК сконцентрированы в плохо различимой, слабо окрашенной области геля, в которой отдельные типы мРНК могут быть выявлены только путем гибри- дизации с соответствующими ДНК-зондами. Нозерн-блот имеет то преимущество, что при электрофорезе могут быть разделены мо- лекулы РНК, дающие перекрестную гибридизацию с ДНК-зондом.
Кроме того, характер электрофоретического разделения позво- ляет визуально оценить качество изолированной РНК. При очень низких концентрациях специфических мРНК или в тех случаях, когда ДНК-зонды дают перекрестную гибридизацию с другими компонентами (не мРНК), проводят обогащение изолированной тотальной РНК транслируемыми мРНК путем отбора на колонках фракций, содержащих поли-A "хвосты". Для этого выделенную
РНК пропускают через короткую колонку с пришитыми поли-T олигонуклеотидными последовательностями и высокой концентра- цией солей в буферном растворе, так чтобы молекулы мРНК, со- держащие поли -A "хвосты", задерживались на колонке. При снижении концентрации солей в буфере происходит расплавление
A-T дуплексов и высвобождение молекул мРНК. Таким способом доля этих молекул в определенных солевых фракциях может быть увеличена на два порядка. Конечно, поли-A селекция применима в тех случаях, когда имеется достаточно большое количество тотальной РНК. Другим методом для исследования структуры РНК транскриптов является S1-анализ. В этом случае ДНК-РНК гиб- ридизацию ведут в растворе, куда и добавляют S1 нуклеазу для переваривания однонитевых несвязавшихся молекул как ДНК, так и РНК, после чего проводят электрофоретическую очистку дуп- лексов, которые затем элюируют из геля для последующего ана- лиза (Sambrook et al.,1989). Этот метод очень удобен для анализа стартовых сайтов и 3'-концов генов, для определения направления транскрипции и картирования интронов.
Уровень мРНК в клетке определяется несколькими кинети- ческими параметрами - скоростью первичного синтеза, эффек- тивностью процессинга РНК-транскриптов и периодом полураспа- да зрелых молекул мРНК. Последний параметр определяют по ди- намике исчезновения мРНК после добавления к клеткам актино- мицина D, специфическим образом супрессирующего транскрип- цию.
Исследование механизмов транскрипции и процессинга пер- вичных РНК-транскриптов проводят in vitro с использованием искусственным образом сконструированных транскрипционных систем (Manley et al., 1986; Dignam et al., 1983;
Gutierrez-Hartmann et al., 1987; Хэймс,Хиггинс, 1987). Для этого могут быть выбраны два различных подхода. В первом случае изолируют ядра и в качестве транскрипционной матрицы используют неповрежденный хроматин. Синтез РНК проводят с добавлением всех необходимых реагентов и, в частности, три- фосфатов, в один из которых (обычно в урацил) вводят ради- оактивную метку. При этом вновь синтезированные молекулы РНК оказываются мечеными. Выбор специфических молекул РНК прово- дят путем ДНК-РНК гибридизации, однако, в отличие от ранее описанных методов анализа мРНК, используют немеченые кДНК-зонды, предварительно нанесенные на фильтры. Большим достоинством этой транскрипционной системы является ее максимальная приближенность к естественным процессам. При втором подходе транскрипция ведется с клонированных фрагмен- тов ДНК, а ядерные экстракты служат источником ферментов и регуляторных белков.
Раздел 6.3 Анализ трансляции, ДНК-экспрессионные систе- мы.
Традиционные методы анализа регуляции трансляции и посттрансляционных модификаций белков основаны на использо- вании модельных систем, представляющих собой цитоплазмати- ческие свободные от мРНК безядерные экстракты клеток, содер- жащие рибосомальный аппарат, транспортные РНК, набор амино- кислот и ферментов, необходимых для трансляции и процессинга белков (Хэймс, Хиггинс, 1987; Клеменс, 1987 ). После добав- ления к такой системе специфической мРНК происходит синтез соответствующей полипептидной цепи in vitro. При введении меченых аминокислот в систему вновь синтезированные белки после электрофоретической очистки могут быть идентифицирова- ны путем радиоавтографии либо иммунологическими методами, при наличии соответствующих антител (Клеменс, 1987). Однако, для значительного числа моногенных наследственных заболева- ний первичный биохимический дефект неизвестен, а следова- тельно, не идентифицированы и мРНК транскрипты. Биохими- ческое изучение многих белков затруднено из-за их минорного содержания и отсутствия эффективных методов выделения и очистки. Последнее обстоятельство в значительной мере от- носится к нерасворимым белкам, ассоциированным с мембранными структурами клеток.
ДНК-экспрессионные системы, то есть клеточные культу- ры, синтезирующие чужеродные белки, являются очень мощным средством анализа структуры, функции и синтеза белков
(Sambrook et al., 1989). Такие системы конструируют на осно- ве экспрессионных векторов, содержащих в своем составе силь- ные промоторы и регуляторные последовательности, обеспечива- ющие высокий, но в то же время регулируемый уровень экспрессии. Кодирующие последовательности чужеродных генов инсертируют (вставляют) с помощью соответствующих генно-ин- женерных приемов в область действия этих промоторов. Конеч- но, такие системы должны содержать и трансляционные сигналы, в частности, сайты связывания рибосом, обеспечивающие работу рибосомального аппарата клеток хозяина. В некоторых случаях экспрессионные векторы вводят в мутантные по протеазным ге- нам клеточные культуры, с тем чтобы предотвратить деградацию чужеродных белков в клетках.
Существует три типа экспрессионных систем - бактериаль- ные, сконструированные обычно на основе E.coli, дрожжевые и экспрессионные культуры клеток млекопитающих. Каждая из этих систем имеет свои преимущества и недостатки. Бактериальные системы наиболее удобны для клонирования, обладают высоким уровнем экспрессии (до 1-2 грамм белка на литр культуры) и их используют, обычно, для производства большого количества чистого белка, необходимого для получения антител или для фармацевтических целей. Удобны также эти системы для введе- ния изменений в различные районы полипептидной цепи путем сайт-направленного мутагенеза в нуклеотидной последователь- ности чужеродной ДНК. Получение и исследование таких "му- тантных" белков очень важно для оценки функциональной значи- мости различных участков белка.
Уровень экспрессии чужеродных белков в дрожжевых клет- ках вдвое, а в клетках млекопитающих в десятки раз ниже, чем в бактериальных. Однако, в бактериальных клетках отсутствуют ферментативные системы, обеспечивающие процессинг эукариоти- ческих белков. Поэтому эукариотические системы удобнее использовать для изучения посттрансляционных модификаций белка - гликозилирования, то есть присоединения к полипеп- тидной цепи углеводных остатков; скручивания белка с образо- ванием третичной структуры, часто, за счет возникновения дисульфидных связей; и N-концевых модификаций, стабилизирую- щих структуру белка. В ДНК-экспрессионных системах может быть синтезировано достаточно много белка, чтобы получить его в кристаллической форме и исследовать пространственную структуру и функциональное назначение отдельных доменов
(Хэймс, Хиггинс, 1987).
Использование экспрессионных библиотек для изоляции ко- дирующих последовательностей гена рассматривалось ранее (см.
Глава II). После секвенирования кДНК можно, исходя из гене- тического кода, прогрозировать аминокислотный состав белка и произвести компьюторный поиск в банке данных гомологичных последовательностей в составе белков с уже известной струк- турой и функциями. Выявление родственных белков, близких по своему полипептидному составу, значительно ускоряет и облег чает дальнейший молекулярный анализ функционирования иссле- дуемого белка в клетке. Аминокислотная последовательность белка позволяет прогнозировать его третичную структуру, идентифицировать домены, оценивать функциональную значимость целого белка и отдельных его компонентов. Не менее важным практическим следствием этих данных является также возмож- ность получения антител к строго специфичным участкам бел- ка. Для этого могут быть использованы два подхода - биохими- ческий и молекулярно-генетический. В первом случае для имму- низации используют искусственно синтезированные полипептиды, которые пришивают к белковой молекуле-носителю (гаптену).
Размеры таких полипептидов, обычно, не превышают 30 амино- кислот - они не могут быть очень большими из-за высокой сто- имости и трудоемкости синтеза длинных молекул. При втором подходе экзонные участки гена инсертируют в экспрессионный вектор в область, кодирующиую селектируемый белок. В резуль- тате экспрессии такой конструкции получают слитый белок, в котором наряду с аминокислотной последовательностью селекти- руемого маркера содержится определенный фрагмент исследуемо- го белка. Эту химерную молекулу и используют для иммунизации животных и получения моновалентных или моноклональных анти- тел. При наличии антител могут быть применены различные им- мунологические подхооды для анализа тканеспецифического и внутриклеточного распределения белка, исследования его моди- фикаций, а также для получения нативного белка в препаратив- ных количествах.
Cледующим шагом на пути анализа молекулярных механизмов регуляции экспрессии гена является идентификация тех наруше- ний в структуре, локализации и активности молекул мРНК и белка, которые возникают вследствие генетических мутаций. Мы уже упоминали об огромном значении культур мутантных клеток для подобных исследований. Однако, многие патологические процессы, протекающие в организме больного, не могут быть исследованы in vitro. С другой стороны, возможности получе- ния необходимого количества клеток и тканей пациента и испы- тания in vivo различных схем лечения значительно ограничены.
Поэтому для многих наследственных болезней эффективность изучения основ патогенеза существенным образом зависит от наличия адекватных биологических моделей. Способы конструи- рования таких моделей подробно изложены в Главе YIII.
ГЛАВА II.
ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, СТРУКТУРА ГЕНОВ.
Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен- тов.
Термин геном используется для обозначения полной гене- тической системы клетки, определяющей характер онтогенети- ческого развития организма и наследственную передачу в ряду поколений всех его структурных и функциональных признаков.
Понятие генома может быть применено к таксономической груп- пе, виду, отдельной особи, клетке, микроорганизму или ви- русу. Так, можно говорить о структуре генома эукариот и про- кариот, сравнивать геномы разных видов, изучать особенности строения генома у конкретных индивидуумов или следить за из- менениями, происходящими в геноме специфических клеток в процессе их онтогенетической дифференцировки. Часто геном определяется как генетическая информация, заключенная в мо- лекулах ДНК одной клетки. Однако, такие факты, как отсутствие связи между количеством ДНК в расчете на гаплоид- ный геном и таксономическим статусом видов, а также много- численные примеры существования огромных различий в содержа- нии ДНК между близкородственными видами (так называемый
"С-парадокс") свидетельствуют о том, что далеко не все участки ДНК связаны с информационными функциями. Понятия ге- нома и ДНК в значительной степени тождественны, так как основные принципы организации и функционирования генома це- ликом определяются свойствами ДНК. Присущие этим молекулам потенциальные возможности практически неограниченного струк- турного разнообразия определяют все многообразие мира живых существ, как на уровне межвидовых, так и индивидуальных раз- личий в пределах одного вида (Баев и др.,1990; Ратнер,1985).
Процесс эволюции и дифференцировки отдельных видов, как правило, сопровождался накоплением изменений в структуре ге- нома. Это касается, прежде всего, таких параметров, как ло- кализация и характер упаковки ДНК в клетках; количество ДНК, приходящееся на гаплоидный геном; типы, соотношение и функ- ции кодирующих и некодирующих нуклеотидных последователь- ностей; регуляция экспрессии генов; межпопуляционная вариа- бильность и филогенетический консерватизм первичной структу- ры генома. В пределах одного вида основные параметры генома достаточно постоянны, а внутривидовое разнообразие обеспечи- вается за счет мутационной изменчивости, то есть выпадения, вставки или замены нуклеотидов на сравнительно небольших участках ДНК. Чаще всего такие изменения касаются не- экспрессируемых элементов генома (интронов, псевдогенов, межгенных спэйсерных участков ДНК и т.д.).
Геномы эукариот, по-существу, можно рассматривать как мультигеномные симбиотческие конструкции, состоящие из обли- гатных и факультативных элементов (Golubovsky, 1995). Основу облигатных элементов составляют структурные локусы, коли- чество и расположение которых в геноме достаточно постоянно.
Присутствие в хромосомах некоторых видов повторяющихся ДНК, амплифицированных участков, ретровирусных последователь- ностей, псевдогенов, также как наличие в клетке эписом, рет- ротранскриптов, ампликонов, дополнительных B-хромосом и раз- личных цитосимбионтов (вирусов, бактерий, простейших) явля- ется не строго обязательным, их количество и положение может значительно варьировать, то есть эти элементы являются фа- культативными. В то же время участие факультативных элемен- тов в наследственной передаче признаков, в формировании му- тационной изменчивости и в эволюционных преобразованиях ви- дов несомненно доказано. Кроме того, существует непрерывный переход от одних состояний к другим за счет инсерции экстрахромосомных ДНК в хромосомы и выстраивания транспозо- ноподобных мобильных элементов из хромосом. Следовательно, несмотря на значительные отличия факультативных последова- тельностей от облигатных по характеру основных информацион- ных процессов (репликации, транскрипции, трансляции и сегре- гации), они также должны рассматриваться, как важнейшие эле- менты генома.
Остановимся теперь более детально на основных принципах организации генома человека. В каждой диплоидной клетке с 46 хромосомами содержится около 6 пикограмм ДНК, а общая длина гаплоидного набора из 23 хромосом составляет 3.5 * 10!9 пар нуклеотидов (Kao, 1985). Этого количества ДНК достаточно для кодирования нескольких миллионов генов. Однако, по многим независимым оценкам истиное число структурных генов нахо- дится в пределах от 50 000 до 100 000. В разделе 2.4 изложе- ны современные подходы, используемые для подсчета общего ко- личества генов, из которых следует, что наиболее вероятная оценка их числа составляет около 80 000. Сопоставляя это значение со средними размерами гена и соотношением между ве- личиной их экзонных и интронных областей, можно заклю- чить,что кодирующие последовательности ДНК занимают не более
10-15% всего генома (McKusick, Ruddle, 1977). Таким образом, основная часть молекул ДНК не несет информации об амино- кислотной последовательности белков, составляющих основу лю- бого живого организма, и не кодирует структуру рибосомаль- ных, транспортных, ядерных и других типов РНК. Функции этой
"избыточной" (junk) ДНК не ясны, хотя ее структура изучена достаточно подробно. Предполагается, что эта ДНК может участвовать в регуляции экспрессии генов и в процессинге
РНК, выполнять структурные функции, повышать точность гомо- логичного спаривания и рекомбинации, способствовать успешной репликации ДНК и, возможно, является носителем принципиально иного генетического кода с неизвестной функцией.
Наиболее общая характеристика генома может быть получена с помощью анализа кинетики реассоциации молекул ДНК. Динами- ка плавления геномной ДНК обнаруживает присутствие по край- ней мере трех различающихся по химической сложности фракций
(Льюин, 1987; Газарян, Тарантул, 1983). Быстро ренатурирую- щая фракция ДНК состоит из относительно коротких высокопов- торяющихся последовательностей; в промежуточную фракцию вхо- дит множество умеренно повторяющихся ДНК - более протяжен- ных, но представленных меньшим числом копий; медленно рена- турирующая фракция объединяет в себе уникальные последова- тельности ДНК, встречающиеся в геноме не более 1-2 раз.
С помощью молекулярного анализа проведена идентификация основных классов повторяющихся последовательностей ДНК, составляющих более 35% всего генома человека и включающих сателлитную ДНК, инвертированные повторы, умеренные и низко- копийные повторы, а также мини- и микросателлитные последо- вательности ДНК. Классификация этих типов повторов достаточ- но условна и основана, главным образом, на двух характе- ристиках: длине повторяющихся коровых единиц, которая может варьировать от 1-2 до более, чем 2000 п.о., и числе их ко- пий, также меняющихся в очень широких пределах - от десятка до миллиона на гаплоидный геном. Не менее важными характе- ристиками различных классов повторяющихся ДНК являются нук- леотидная последовательность "коровых" единиц повтора, спе- цифичность их организации, хромосомная локализация, внутри- и межвидовая стабильность, а также возможные функции этих типов ДНК.
Раздел 2.2. Повторяющиеся последовательности ДНК.
Сателлитная ДНК это класс высокоповторяющихся последо- вательностей, составляющих около 10% всего генома человека
(Kao, 1985). При центрифугировании геномной ДНК в градиенте плотности CsCl эти последовательности образуют четыре от- дельных сателлитных пика с различными средними значениями плавучей плотности. Методом гибридизации in situ показано присутствие сателлитной ДНК преимущественно в центромерных, теломерных и гетерохроматиновых районах большинства хро- мосом, при этом характер гибридизации сходен для всех четы- рех групп и не зависит от принадлежности ДНК-зондов к се- мействам повторов, образующих различные сателлитные пики. В каждой из этих групп, однако, присутствует небольшое коли- чество последовательностей, имеющих специфическую хромосом- ную локализацию. Так например, около 40% длинного плеча Y хромосомы составляет семейство последовательностей, тандемно повторяющихся более 3000 раз и не найденных в других хро- мосомах.
Выделяют три основных типа сателлитной ДНК: (1) короткие
- от 2 до 20 п.о., стабильные тандемные повторы с кратностью в несколько десятков тысяч раз, которые иногда перемежаются с неповторяющимися последовательностями; (2) кластеры более протяженных повторов, слегка различающихся по нуклеотидной последовательности; (3) сложные, достигающие нескольких со- тен пар нуклеотидов, повторяющиеся последовательности раз- личной степени гомологии (Газарян,Тарантул,1983). К послед- нему типу относятся альфа-сателлитные или альфоидные ДНК, среди которых найдено много хромосом-специфических последо- вательностей. Размеры повтрояющихся "коровых" единиц альфо- идной ДНК составляют около 170-200 п.о. В геноме человека и других приматов эти мономеры организованы в кластеры по 20 и более "коровых" единиц. После расщепления рестриктазой BamHI в альфоидной ДНК выявляется серия фрагментов, длиной около 2
000 п.о., в составе которых обнаруживаются альфоидные после- довательности, специфичные для гетерохроматиновых районов разных хромосом человека (1, 3, 4, 5, 9, 6, 7, 11, 17, 19,
Х). В некоторых случаях эти повторы гомологичны двум разным хромосомам (9 и 15, 13 и 21, 18 и Х) ( Willard,Waye, 1987).
Хромосом-специфические последовательности сателлитной альфо- идной ДНК нашли широкое применение в молекулярной цитогене- тике в качестве ДНК-зондов, удобных для маркирования индиви- дуальных хромосом в метафазных и интерфазных клетках челове- ка (Юров, 1987). Предполагается, что сателлитные ДНК играют важную роль в поддержании структур хромосом и, возможно, в их спаривании в процессе мейоза (Charlesworth et al., 1994).
Особое место среди сателлитных ДНК занимают микро- и минисателлитные последовательности, представляющие собой многочисленную группу рассеянных по всему геному относитель- но коротких тандемных повторов. Микросателлиты - это класс динуклеотидных повторов. Размер повторяющихся единиц в ми- нисателитных последовательностях может меняться от 3 - 4 до
10 - 15 нуклеотидов. Отличительной особенностью микро- и ми- нисателлитов является наличие среди них большого количества участков, вариабильных по числу копий в кластере.
Инвертированные или обращенные повторы составляют до 5% генома. Они состоят из двух тождественных копий длиной около
300 п.о., ориентированных в противоположных направлениях на одной нити ДНК и лежащих на расстоянии от нуля до десятка тысяч пар нуклеотидов друг от друга (в среднем - 1,6 кб).
Около 1/3 обращенных повторов не разделены промежуточными последовательностями и носят название палиндромов. Среднее расстояние между двумя различными парами инвертированных повторов около 12 кб, и их распределение по геному носит случайный характер. Комплементарные пары легко ассоциируют при отжиге, образуя шпилечные структуры с дуплексной ножкой и однонитевой петлей, длина которой соответствует расстоянию между парой обращенных повторов. Вследствие этого оказыва- ются приблеженными достаточно удаленные друг от друга участ- ки ДНК, что важно для работы ряда ферментов, обеспечивающих процессы репликации и транскрипции. Важно отметить и то, что однонитевой участок ДНК, образующий петлю, становится доступным для действя нуклеазы S1, специфически разрушающей однонитевую ДНК.
Группа умеренно повторяющихся последовательностей очень гетерогенна по длине и числу копий и составляет около 20% генома человека. Как правило, они распределены дисперсно по всем хромосомам, причем относительно короткие последователь- ности ДНК до 500 п.о., так называемые короткие диспергиро- ванные повторы - Sine, повторяются более 100 000 раз, в среднем, через каждые 2.2 кб. Число копий более длинных диспергированных последовательностей - Line, не превышает 10
000. Умеренные повторы найдены во всех структурных компонен- тах генома за исключением кодирующих областей генов. Два главных семейства умеренных повторов, Alu и Kpn1, занимают, по крайней мере, 10% генома и практически столько же занято несколькими сотнями других семейств повторов этого класса.
Основной единицей Alu семейства является короткая последовательность из 300 п.о., повторенная в геноме челове- ка несколько сот тысяч раз, в среднем, через каждые 5 кб или через каждые 2 - 3 диспергированных повтора, принадлежащих другим семействам (Kao, 1985; Льюин, 1987). При этом, кластеры Alu-повторов, как правило, лежат внутри R-дисков метафазных хромосом - Гимза отрицательных (G- дисков). Расп- ределение Alu-повторов по геному весьма неравномерно как между хромосомами, так и по их длине. Так, в хромосомах 14,
16, 21 Alu-последовательности концентрируются в области центромеры, а в хромосомах 4, 19, 20, Х и У выраженные кластеры Alu повторов не найдены. Члены Alu семейства не полностью идентичны друг другу. Однако, все они содержат сайт рестрикции для фермента AluI и имеют димерную структу- ру, то есть состоят из двух прямых повторов длиной около 130 п.о. с богатой аденином вставкой из 31 нуклеотида во втором мономере. Каждая Alu последовательность фланкирована прямыми повторами длиной от 7 до 20 п.о., различными для разных чле- нов семейства и имеющими большую степень гомологии с транспозоноподобными элементами про- и эукариот. Некоторые члены Alu семейства могут транскрибироваться с помощью фер- мента РНК-полимеразы 111. Предпологается, что при определен- ных условиях образующиеся при этом молекулы РНК могут обрат- но транскрибироваться, что в свою очередь, может привести к появлению в клетках Alu-содержащих кДНК, обладающих свойствами ретропазонов, то есть способных инсертироваться в геномную ДНК. В литературе описаны случаи инсерционного му- тагенеза Alu повторов, приводящие к гемофилии В и нейрофиб- роматозу типа 1. Однако, частота таких событий, по-видимому, невелика. Предполагается, что короткие умеренные повторы, подобные Alu семейству, участвуют в регуляции транскрипции, в процессинге РНК и в инициации репликации ДНК. Кроме того, обнаружена высокая степень гомологии Alu последовательностей с одним из видов низкомолекулярной РНК (7 S РНК), участвую- щей в секреции белков.
К числу Line повторов относится Kpn1 семейство, которое состоит из более длинных и значительно более гетерогенных последовательностей, рассеянных по всему геному. В ряде слу- чаев члены Kpn1 семейства группирются в кластеры, образуя более длинные структуры, повторяющиеся несколько тысяч раз.
Для некоторых членов этого семейства также доказана возмож- ность инсерции кДНК-овых копий Kpn1- РНК-транскриптов в ге- номную ДНК и возникновение мутаций. Такое явление было обна- ружено в одном случае гемофилии А. Некоторые Kpn1- последо- вательности не только транскрибируются, но и способны транслироваться (Charlesworth et al.,1994).
Раздел 2.3 Мультигенные семейства, псевдогены, онкоге- ны.
Многие гены человека повторены в геноме от нескольких единиц до нескольких сотен раз и образуют мультигенные се- мейства (Газарян, Тарантул, 1983; Босток, Самнер, 1981; Kao,
1985; Льюин, 1987). Эти гены обычно сгруппированы в кластеры в определенных районах одной, либо нескольких хромосом. Во многих мультигенных семействах наряду с функционально актив- ными генами содержатся псевдогены - мутационно измененные последовательности, не способные транскрибироваться или про- дуцирующие функционально неактивный генный продукт. Примера- ми мультигенных семейств могут служить гены рибосомальных, транспортных и ядерных РНК, гены альфа- и бета-глобинов, ту- булинов, миоглобина, актина, интерферона и многих других. В ряде случаев, возможна избирательная амплификация некоторых семейств генов в процессе их экспрессии, как, например, ге- нов рибосомальных РНК. При этом число способных транскриби- роваться копий генов увеличивается за счет их избирательной амплификации в сотни и даже тысячи раз, что сопровождается лавинообразным нарастанием доли соответствующего генопродук- та в клетках. Особое место среди мультигенных семейств зани- мают супергены - очень большие кластеры из сотен функцио- нально и структурно родственных генов, расположенных в сег- ментах отдельных хромосом. Классическим примером супергена может служить HLA комплекс, контролируюший главные антигены гистосовместимости. Он занимает район более 6000 кб на ко- ротком плече хромосомы 6р21 и состоит из серии тесно сцеп- ленных генов, ответственных за синтез множества белков, включающих клеточные поверхностные антигены, молекулы иммун- ного ответа и некоторые компоненты комплемента. К суперген- ным семействам относятся три комлекса расположенных на раз- ных хромосомах мультигенов, контролирующих синтез тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Интересно, что в процессе диффиренцировки B лимфоцитов, продуцирующих иммуноглобулины, происходит структурная перестройка этих семейств. При этом отдельные последовательности ДНК элиминируются, тогда как другие сливаются, так что структура генов иммуноглобулинов в зрелых B лимфоцитах значительно отличается от исходной, то есть от той, которая наблюдается в зародышевых клетках.
Одной из важных структурных особенностей генома челове- ка является наличие так называемых псевдогенов, уникальных последовательностей, очень сходных по своей структуре с оп- ределенными нормальными генами, но в силу присутствия в ко- дирующих последовательностях целого ряда мутаций не способ- ных транскрибироваться или правильно транслироваться с обра- зованием структурно и функционально активного продукта.
Псевдогены обнаружены для многих генов. Их количество варь- ирует от одной до нескольких десятков копий на геном и в этом случае они, как правило расположены тандемно. Иногда псевдогены тесно сцеплены с нормальными генами, во многих случаях псевдогены и гены локализованы в разных хромосомах.
Для некоторых моногенных заболеваний идентифицированы му- тантные аллели, сходные с мутациями в соответствующих псев- догенах. В этих случаях обсуждаеся возможная роль псевдоге- нов в спнтанном мутационном процессе.
В геноме человека присутствуют также нуклеотидные последовательности, гомологичные генам некоторых вирусов.
Впервые эти последовательности были идентифицированы в гено- ме вирусов, индуцирующих развитие опухолей у животных и че- ловека, и потому они были названы онкогенами. Гомологичные последовательностям в геноме человека носят название прото- онкогенов. В настоящее время уже идентифицировано более 100 протоонкогенов. Белковые продукты протоонкогенов, по-видимо- му, играют важную роль в нормальной пролиферации клеток осо- бенно на ранних стадиях эмбрионального развития, контролируя клеточный цикл и выбор геномной программы развития клетки.
При возникновении специфических мутаций в протоонкогенах, а также при нарушениях регуляции их работы, выражающихся в ги- перпродукции или в зкспрессии в нетипичномном месте или в несвойственный момент жизнедеятельности клетки, они начинают вести себя как онкогены, стимулируя неконтролируемое размно- жение и пролиферацию определенных клеточных клонов, что и может, в конечном счете, привести к формированию опухоли.
Раздел 2.4 Современное определение понятия "ген", транскрипция, регуляторные элементы генов.
Около 10-15% генома человека представлено уникальными транскрибируемыми последовательностями, составляющими основу структурных генов (Льюин, 1987). В настоящее время в понятие
"ген" включается не только его транскрибируемая область - экзоны + интроны, но также фланкирующие последовательности - лидерная, предшествующая началу гена, и хвостовая нетрансли- руемая область, раположенная на 3' конце гена (Рис.2.1 ). В отличие от генов прокариот гены человека редко представлены одной непрерывной последовательностью и в подавляющем боль- шинстве имеют прерывистую структуру. Относительно короткие кодирующие участки - зкзоны, чередуются с длинными интрона- ми, которые транскрибируются и входят в состав первичного
РНК-продукта, но затем при процессинге первичного РНК
-транскрипта они вырезаются и не участвуют в трансляции.
Процесс вырезания интронов из первичных транскриптов получил название сплайсинга. Таким образом, в зрелой мРНК интронные области отсутствуют, а экзоны составляют непрерывную кодиру- ющую последовательность. Размеры зрелых мРНК нередко в десятки раз меньше первичных РНК-транскрипов и, соот- ветственно, размеров самого гена.
Согласно классическим представлениям ген - это локус, на хромосоме, мутации в котором реализуются на уровне фено- типа. В молекулярной биологии ген трактуется как ассоцииро- ванный с регуляторными последовательностями фрагмент ДНК, соответствующий определенной единице транскрипции. Следова- тельно, представления о гене формальных генетиков далеко не полностью тождественны его физической единице и соотношения между этими двумя понятиями достаточно запутанные. Отметим некоторые причины этих противоречий. Известно, что мутации одного гена могут приводить к совершенно разным и даже в ря- де случаев к комплементарным фенотипам. Результаты прямого секвенирования генома свидетельствуют о присутствии в нем значительного большего числа генов, чем можно ожидать от ре- зультатов мутационного анализа. Одна и та же последователь- ность ДНК в геноме может кодировать несколько различных бел- ков, что достигается за счет так называемого альтернативного сплайсинга (образование разных мРНК из одного первичного
РНК-транскрипта). В крупных интронах ряда генов обнаружены смысловые последовательности других генов ("ген в гене"), считываемые в противоположном направлении. Транскрипционные единицы генома могут перекрываться за счет наличия разных промоторов. Наконец, благодаря соматической рекомбинации структура транскрибируемых последовательнстей некоторых ге- нов может быть различной в разных клонах клеток одного орга- низма (Т-клеточные рецепторы). Ситуация с определением поня- тия "ген" еще больше осложняется, если в это понятие вклю- чать многочисленные регуляторные последовательности. Возни- кает вопрос: "Как далеко от гена могут располагаться эти последовательности, чтобы их можно было включать в структуру гена?". Для многих целей оказывается удобным введенное в последнее время понятие "считаемый ген"- counting gene.
Последний рассматривается как отдельная транскрибируемая единица ДНК или её часть, которая может транслироваться в одну или несколько взаимосвязанных аминокислотных последова- тельностей. Поэтому последовательность, дающая две транскрипционные единицы за счет альтернативного сплайсинга и, как следствие, два разных белка учитывается как один ген.
Однако, если степень гомологии двух генопродуктов, имеющих общий транскрибируемый участок, невелика, то эти последова- тельности расцениваются как два разных гена (Fields et al.,1994).
По своему функциональному назначению гены могут быть разделены на две группы. Группа I представлена генами, коди- рующими собственно белки; группа II - генами, контролирующи- ми синтез рибосомальных, транспортных и ядерных РНК. По ха- рактеру экспрессии гены также могут быть подразделены на две группы - гены "домашнего хозяйства" (housekeeping genes), продукты которых необходимы для обеспечения жизнедеятель- ности любого типа клеток, и тканеспецифические гены, обеспе- чивающие специализированные функции клеток, то есть гены, функционально активные только в определенных типах клеток
(тканей) и только на определенных стадиях онтогенеза, так называемые гены терминальной дифференцировки.
Считается, что средние размеры гена человека составля- ют, примерно, от 10 до 30 кб. Однако, эта величина может ко- лебаться от нескольких десятков до миллионов пар нуклеоти- дов. Согласно последним данным, самый маленький из известных генов- МСС-7, имеет размеры всего 21 п.о. (Gonzales-Pastor et al.,1994), а самый болшой - ген дистрофина -2.2 мегабаз.
Гены отделены друг от друга протяженными промежутками - спейсерами, содержащими в своем составе большое количество повторяющихся последовательностей ДНК и нетранскрибируемые уникальные последовательности.
Рассмотрим более подробно современные данные о числе генов в геноме человека. Полученные разными методами оценки этой величены приведены в Табл.2.1. Исходя из размера генома
(около 3 000 миллионов п.о.), и среднего размера одного гена порядка 10 - 30 тыс.п.о. (Gilbert, 1992), общее число генов должно быть порядка 100 000. При этом, как уже указывалось, распределение генов на хромосомах крайне неравномерно. Уста- новлено, что более 90% генов находится в Гимза -отрицатель- ных районах метафазных хромосом, в так называемых R-бэндах
(Antequera,Bird ,1993). Проведенные недавно прямые исследо- вания методом секвенирования показывают, что в R-бэндах их число достигает 43-50 на один бэнд, а в Гимза- положительных районах хромосом (G бэндах), - только 1-2 на 75-80 килобаз, то есть всего в геноме можно ожидать около 70 000 генов.
Оценка числа генов по доле транскрибируемой части генома
(всего 12%) дает совсем маленькую величину - 20 000 генов
(Wagner et al.,1993). Методом исследования кинетики реассо- циации РНК в культуре клеток число генов оценивается между
20 - 40 000 (Lewin, 1990). В то же время в клетках мозга число различных мРНК по некоторым данным достигает 97 000
(Wagner et al.,1993). Наиболее точные подсчеты числа генов человека проведены в последнее время и основаны на оценке числа CpG островков (Табл.2.1). Известно, что в промоторной области всех генов "домашнего хозяйства" и примерно у 40 % генов терминальной дифференцировки, обеспечивающих специали- зированные функции дифференцированных клеток, находятся об- ласти коротких динуклеотидных CpG повторов. Разработаны мо- лекулярные методы точной регистрации этих участков, которые показали, что их число в геноме около 45 000, отсюда число структурных генов оценивается в 67-70 000 ( Antequera, Bird,
1993). Практически такое же число генов (64 000) определено недавно методом учета маркерных экспрессирующихся последова- тельностей (expressed sequence tags) (Fields et al., 1994).
Таким образом, суммируя вышеизложенное, можно сделать вывод, что в геноме человека содержится, в среднем, около 70-80 000 отдельных транскрибируемых ДНК последовательностей, то есть генов.
Транскрипция гена начинается с 5' конца первого экзона, где расположен сайт инициации транскрипциии. Определенной гомологии между стартовыми сайтами разных генов не наблюда- ется, но чаще всего они начинаются с нуклеотида А, окружен- ного пиримидиновыми основаниями. На границах между экзонами и интронами имеются консервативные канонические последова- тельности, играющие существенную роль в обеспечении точности вырезания интронов во время сплайсинга РНК. Все интронные последовательности начинаются с динуклеотида GT и заканчива- ются динуклеотидом AG, называемыми, соответственно, донорны- ми и акцепторными сайтами сплайсинга. На 3' конце многих структурных генов идентифицирована поли(А)-сигнальная после- довательность (AATAAA), участвующая в процессе модификации первичного РНК транскрипта и ответственная за альтернативный сплайсинг мРНК, обеспечивающий синтез разных зрелых мРНК с одного и того же первичного РНК транскрипта.
Транскрипция генов осуществляется с помощью фермента
РНК-полимеразы. Около 50-70% клеточного синтеза РНК обеспе- чивается РНК-полимеразой I, локализованной в ядрышках и от- ветственной за синтез генов рибосомальной РНК. РНК-полимера- за II обеспечивает транскрипцию генов, кодирующих собственно структурные белки. Этот фермент локализован в ядре (но не в ядрышках). На его долю приходится 20 - 40% синтеза РНК.
РНК-полимераза III контролирует синтез ядерных и транспорт- ных РНК (Льюин, 1987). На 1-м этапе РНК-полимераза связыва- ется с двухнитевым участком ДНК и, расплетая его, делает доступным спаривание смысловой нити ДНК с рибонуклеотидами
(Рис. 2.2). После того как первый нуклеотид РНК инкорпориру- ется в сайт инициации транскрипции, полимераза начинает продвигаться по нити ДНК в направлении 5'- 3', расплетая двойные нити ДНК впереди себя и заплетая их позади. Этот процесс продолжается до достижения терминирующего сигнала, представляющего собой один или несколько терминирующих кодо- нов. Затем молекулы РНК и фермента высвобождаются и двойная спираль (дуплекс) ДНК полностью восстанавливается.
Для правильного начала синтеза РНК необходимо точное взаимодействие РНК-полимеразы с молекулой ДНК. Этот процесс контролируется промотором - специальной регуляторной после- довательностью ДНК размерами около 75 п.о., локализованной, как правило, в 5'-фланкирующей области гена. Иногда под контролем одного промотора считывается несколько генов c об- разованием единого первичного РНК-транскрипта. Промоторные области различных генов довольно разнообразны по своему нук- леотидному составу. Однако, почти для всех промоторов харак- терно наличие консервативной последовательности из 7 основа- ний на расстоянии 19-27 нуклеотидов слева от сайта инициации транскрипции. Это, так называемый, TATA -бокс (блок Хог- несса), обеспечивающий корректное расположение РНК полимера- зы по отношению к стартовому сайту. На расстоянии 70 - 80 п.о. в направлении 5'-конца от начала транскрипции часто расположена другая консервативная последовательность из 9 п.о. - CAAT- бокс, контролирующий начальное связывание
РНК-полимеразы. Мутации в TATA- или в CAAT-боксах могут су- щественно влиять на скорость синтеза РНК. В 5'-фланкирующей области гена на расстоянии до тысячи пар оснований от начала его кодирующей части располагаются другие регуляторные последовательности, так называемые инхансеры (усилители), способные резко увеличивать продукцию гена за счет увеличе- ния скорости транскрипции. Эти контролирующие элементы могут работать независимо от их ориентации по отношению к сайту инициации. Для некоторых генов найдены участки ДНК, подавля- ющие транскрипцию, а также так называемые аттенюаторы (осла- бители) - последовательности, лежащие между сайтом инициации транскрипции и собственно геном. Они могут блокировать прод- вижение РНК-полимеразы. Благодаря такому сложному механизму контроля, достигается очень тонкая и эффективная регуляция экспрессии генов практически на всех этапах транскрипции, трансляции и образования функционально зрелого белка. Эти механизмы более детально рассмотрены в других разделах.
Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест- рикции, ПДРФ-анализ.
Кодирующие и регуляторные области структурных генов на- иболее консервативны в процессе эволюции, так как мутации в них подвержены давлению жесткого естественного отбора.
Действительно, небольшие изменения в этих последователь- ностях, даже замена одного основания, делеция или инсерция нескольких нуклеотидов, могут привести к прекращению синтеза белка или к потере его функции, что, как правило, драмати- ческим образом сказывается на жизнеспособности особей, несу- щих подобные мутации. Однако, около 90% генома человека состоит из некодирующих последовательностей, подобных сател- литным ДНК, умеренным повторам, интронам и спейсерным проме- жуткам между генами. Эти участки значительно более изменчивы и содержат множество, так называемых нейтральных мутаций или полиморфизмов, не имеющих фенотипического выражения и не оказывающих заметного влияния на жизнеспособность или репро- дуктивные свойства особей и, таким образом, не подверженных прямому давлению естественного отбора. Полиморфные локусы являются удобными генетическими маркерами. На основе анализа родословных можно проследить их наследование в ряду поколе- ний, проанализировать сцепление друг с другом, с известными генами и с анонимными последовательностями ДНК, то есть использовать в качестве обычных менделевских признаков в классическом генетическом анализе. Информативность полиморф- ных локусов определяется уровнем их генетической изменчи- вости в различных популяциях.
Экспериментально легко выявляются два варианта геномно- го полиморфизма. Количественые изменения в области локализа- ции мини- и микросателлитных последовательностей ДНК и ка- чественные замены отдельных нуклеотидов, приводящие к появ- лению полиморфных сайтов рестрикции. В первом случае измен- чивость по числу повторенных "коровых " единиц создает серию аллелей, характер и частота которых уникальны для каждого вариабильного локуса. Полиморфизм в сайтах рестрикции связан с присутствием точковых нейтральных мутаций, локализованых, как правило, в уникальных последовательностях некодирующих участков ДНК. Подобные мутации в силу вырожденности генети- ческого кода (см.Глава 1) могут возникать и в кодирующих последовательностях генов. Спонтанные мутации, возникающие в сайтах узнавания для определенных рестриктаз, делают их ре- зистентными к действию этих ферментов. Аналогичным образом, при таких заменах могут создаваться новые сайты рестрикции.
Показано, что полиморфные локусы встречаются во всех хро- мосомах с частотой приблизительно один полиморфный сайт на
300-500 п.о. Этот тип изменчивости ДНК был выявлен и исполь- зован для молекулярной маркировки специфических участков ге- нома исторически раньше по сравнению с вариабильными сател- литными повторами (Botstein et al.,1980).
Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагмен- тов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. Ана- лиз полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так назы- ваемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism
-RFLP analysis), включает следующие этапы: выделение геном- ной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекро- форетическое разделение образующихся фрагментов ДНК и иден- тификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рест- рикции, путем блот-гибридизации по Саузерну (см.Главу 1).
При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофо- реграммах или радиоавтографах (в зависимости от типа мечения
ДНК-зонда) будет выявляться один крупный фрагмент, соот- ветствующий по длине последовательности ДНК между двумя соседними константными сайтами рестрикции для той же эндо- нуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном локусе на электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам фрагмент, равный расстоянию между полиморфным сайтом рест- рикции и одним из ближайших константных сайтов рестрикции. С каким именно из двух фрагментов, прилегающих к полиморфному локусу, будет происходить гибридизация зависит от локализа- ции используемого для анализа ДНК-зонда. В частном случае возможна гибридизация одновременно с двумя соседними рест- рикционными фрагментами, если выбранный ДНК-зонд комплемен- тарен последовательности, содержащей полиморфный сайт рест- рикци. Однако, такие зонды очень редко используются на прак- тике, так как длина рестрикционных фрагментов обычно в десятки раз больше длины ДНК-зондов и далеко не всегда уда- ется выделить и проклонировать фрагмент ДНК, содержащий по- лиморфный сайт рестрикции. Поэтому в дальнейшем для простоты изложения мы будем рассматривать только более общую ситуацию и считать, что при отсутствии рестрикции в полиморфном сайте
ДНК-зонд гибридизуется с одним длинным фрагментом, а при на- личии рестрикции гибридизующийся фрагмент имеет меньшую дли- ну. Таким образом, при анализе ДНК особей, в обеих хромосо- мах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной об- ласти, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в нижней области геля, соответствующий более короткому фраг- менту ДНК. У особей, гомозиготных по мутации, изменяющей по- лиморфный сайт рестрикции, будет наблюдаться один бэнд в верхней части геля, соответствующий фрагменту большей длины, тогда как у гетерозигот проявятся оба эти бэнда (Рис. 2.3а).
ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае, если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содер- жащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния этого локуса возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амп- лифицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеа- зой, тогда как при полном соответствии полиморфной области сайту рестрикции образуются два фрагмента меньшей длины
(Рис.2.3б). У гетерозигот будут присутствовать 3 фрагмента, один из которых по длине будет соответствовать размеру амп- лификата до рестрикции, плюс 2 маленьких фрагмента с той же суммарной длиной. Таким образом, как и в случае использова- ния для анализа блот гибридизации по Саузерну, трем возмож- ным вариантам генотипа будут соответствовать три различных варианта электрофореграмм.
Необходимо подчеркнуть, что первичная идентификация по- лиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с определенными ге- нами, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зон- дов. Дальнейшая тактика заключается в поиске рестрикционной нуклеазы, выявляющей полиморфизм. С этой целью используют широкий набор эндонуклеаз для рестрикции геномной ДНК, выде- ленной из группы неродственных индивидуумов, представляющих собой репрезентативную выборку популяции. Затем проводят
ПДРФ-анализ отдельно для каждой из рестриктаз с набором име- ющихся ДНК-зондов. После обнаружения полиморфизма в одной из популяций аналогичные исследования проводят в других популя- циях.
Следует учитывать, что полиморфные сайты рестрикции всегда представляют собой двухаллельную систему, поэтому да- же при самой высокой вариабильности такого сайта, число ге- терозиготных по данному локусу особей в популяции не будет превышать 50% Между тем, только при наличии полиморфного сайта в гетерозиготном состоянии можно отличить мутантный аллель от нормального, то есть осуществить его молекулярную маркировку. Следовательно, информационная емкость такого по- лиморфизма относительно невелика ( см. Главы Y и VII).
Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные ДНК.
Гипервариабильные сателлитные повторы являются гораздо более информтивными маркерами по сравнению с полиморфными сайтами рестрикции, так как представляют собой мультиаллель- ные системы с уровнем гетерозиготности, достигающим 70 -
90%. Кроме того, оказалось, что количество высокоизменчивых микрои минисателлитных последовательностей в геноме челове- ка, по-видимому, превышает несколько десятков тысяч, они достаточно плотно и равномерно расположены в каждой из хро- мосом. Так более 90% из 5000 идентифицированных (C-A)-повто- ров являются полиморфными, причем в большинстве из них уро- вень гетерозиготности значительно превышает 50% (Weissenbach et al, 1992). Среди гипервариабильных мини-сателлитных последовательностей различают варьирующие по числу тандемные повторы - VNTR, три-, тетра- и пентануклеотидные повторы, а также некоторые другие классы повторов. Общее число высоко- полиморфных минисателлитных последовательностей в геноме превышает 1500 (Armour et al., 1990; Charlesworth et al.,
1994). VNTR (variable number tandem repeats - варьирующие по числу тандемные повторы) -характеризуются наличием 10 - 15 - ти нуклеотидных "коровых" последовательностей, сходных с контролирующими элементами рекомбинации E.coli (Jeffreys et al., 1985). С помощью ДНК-зондов, сконструированных на осно- ве тандемно повторяющихся "коровых" последовательностей, можно анализировать индивидуальную изменчивость в единичных или множественных высокополиморфных локусах, несущих одно- типную коровую последовательность. Примером может служить
VNTR, обнаруженная в интроне миоглобинового гена, включающая четыре тандемных повтора из 33 п.о., фланкированных прямыми повторами из 9 п.о. Полученные из этого района ДНК-зонды с успехом используются для идентификации личности методом
ДНК-фингерпринта, так как вероятность совпадения аллелей у двух неродственных индивидуумов по всем гипервариабильным локусам, гибридизующихися с этим ДНК-зондом, значительно меньше 10!-7 (Jeffreys et al.,1991). Высокополиморфные VNTR найдены также в гене инсулина, в области глобинового псевдо- гена и в Х-хромосоме, содержащей последовательности, гомоло- гичные ДНК вируса гепатита В (Nakamura et al., 1985). В последнее время многочисленные VNTR- последовательности об- наружены в хромосомах 1, 2q, 14, 16, 17, 19 (O'Brien,1992).
Поиск новых гипервариабильных локусов основан на системати- ческом скрининге клонированных последовательностей ДНК с по- мощью искусственно синтезированных "коровых" зондов. Особен- но удобны для такого скрининга геномные библиотеки, сконструированные на основе предварительно фракционированных по величине Mbo1 или Sau3A1 фрагментов ДНК, так как большие фрагменты обогащены длинными и более вариабильными минисате- литными последовательностями (Armour, et al., 1990). Хорошие результаты были получены также при скринировании космидных библиотек с помощью G-богатых синтетических ДНК-зондов и использование хемолюминесцентного метода в сочетании с ПЦР
(Decorte, Cassiman, 1990). В некоторых случаях с этой целью применяют также последовательности ДНК, выделенные из фага
М13, имеющего в своем составе сходные структуры (Armour etal., 1990).
Одним из вариантов минисателлитных последовательностей являются тримерные и тетрамерные короткие тандемные повторы
-STR (short tandem repeats), которые стабильно наследуются и также обладают высоким уровнем полиморфизма по числу коровых единиц (Edwards et al., 1991). В X хромосоме такие повторы обнаружены через каждые 300 - 500 кб, тогда как в других частях генома они встречаются на расстоянии 10 кб друг от друга. По некоторым оценкам их частота может достигать 1/20 кб (Charlesworth et al.,1994). Возможно, истиное число три- и тетрамерных повторов в геноме человека еще больше, так как они обнаружены во многих генах. Подобно другим повторам STR обычно встречаются в некодирующих частях генов. В последнее время, однако, обнаружена группа структурных генов, несущих тримерные повторы в регуляторных и даже в транслируемых частях генов. Изменения числа этих внутригенных повторов в сторону их увеличения может приводить к нарушению функции этих генов вплоть до полного блока экспрессии и быть причи- ной ряда тяжелых наследственных заболеваний - болезни экспансии (см.Главу X). В качестве зондов для выявления ко- ротких тандемных повторов используют синтетические олигонук- леотиды, построенные из простых повторов трех или четырех нуклеотидов.
В последнее время для обнаружения различных классов микросателлитных последовательностей и STR-повторов применя- ют эффективные методы, основанные на использовании ПЦР
(Edwards et al., 1991). Для этих локусов характерно большое число аллелей, которые различаются по числу коровых единиц.
Продукты амплификации этих сайтов могут отличаться друг от друга числом ди- три- или тетрануклеотидных повторов. Для удобства идентификации различных аллелей полимеразную цепную реакцию проводят в присутствии меченых нуклеотидов, а для электрофоретического разделения продуктов амплификации используют специальные секвенирующие гели. Многие STR-локусы настолько полиморфны, что нашли применение в судебной меди- цине для идентификации личности. Для повышения достоверности результатов с этой целью используют мультиплексные варианты
ПЦР, позволяющие устанавливать генотип индивидуума одновре- менно по нескольким STR-сайтам (Weber,May, 1994; Асеев и др.,1995). Возможность точного генотипирования личности с использованием полимеразной цепной реакции, то есть на мини- мальном количестве ДНК, является важным методическим преиму- ществом STR перед ранее рассмотренными VNTR, для анализа ко- торых чаще используют блот-гибридизацию по Саузерну.
Высокая частота коротких тандемных повторов, уникаль- ность комбинаций числа тетра-, три- и димеров в разных сай- тах в сочетании с их большой вариабильностью и сравнительной легкостью идентификации аллелей позволяет широко использо- вать эти повторы для генетического и физического картирова- ния в качестве наиболее удобных индексных маркеров геномных
ДНК-последовательностей (см.Главу III). Такие маркерные сай- ты получили название STS (sequence tagged sites). В настоя- щее время в геноме человека уже идентифицировано около 10
000 STS, подавляющее большинство которых представляет собой тандемные повторы 2 - 4 нуклеотидов. Благодаря выраженной индивидуальной специфичности и достаточно стабильному менде- левскому типу наследования STS-сайты нашли широкое примене- ние и в молекулярной диагностике генных болезней, прежде всего в качестве молекулярных маркеров для идентификации му- тантных хромосом в семьях высокого риска (см. Главу VII).
Наличие большого числа гипервариабильных микро- и минисател- литных последовательностей ДНК является характерной особен- ностью генома человека. Аналогичные последовательности, об- наруженные в геноме приматов, значительно более однородны, что доказывает возможность существенного увеличения вариа- бильности этих участков ДНК за сравнительно короткий эволю- ционный промежуток (Юров,1988; Gray et al., 1991).
Сведения о мутабильности высокополиморфных последова- тельностей в геноме человека весьма противоречивы. Показано, однако, что в наиболее вариабильных минисателлитных локусах частота мутаций может достигать 5% на гамету (Jeffreys et al., 1988). Предполагается, что одной из главных функций ги- первариабильных микро- и минисателлитных последовательностей
ДНК может быть контроль гомологичной рекомбинации в мейозе.
На культурах клеток показано стимулирующее влияние миниса- теллитных последовательностей ДНК на гомологичную рекомбина- цию. Так, инсерция синтезированной последовательности, составленной на основе гипервариабильных минисателлитов в геномную ДНК приводит к более, чем 10-кратному увеличению числа реципрокных обменов, причем степень этого влияния об- ратно пропорциональна расстоянию между STR и сайтом рекомби- нации (Wahls et al., 1990). Вместе с тем, многие авторы об- ращают внимание на достаточно высокую стабильность миниса- теллитных аллелей, что позволяет их широко использовать как для генетического маркирования, так и для популяционных исследований и идентификации личности методом ДНК-фингерп- ринта (Decorte,Cassiman 1993; Edwards et al.,1991; Ива- нов,1989).
Для многих мутаций, локализованных в некодирующих частях генома, характерны высокие уровни популяционного по- лиморфизма. Необходимо, однако, подчеркнуть, что эта измен- чивость не затрагивает общей структуры генома, определяющей различия между видами. Более того, сопосталение первичных нуклеотидных последовательностей сравнительно протяженных секвенированных участков ДНК (области Т-рецепторных генов длиной около 100 кб) обнаружило сохранение высокой степени гомологии не только в кодирующих, но и, что особенно удиви- тельно, в некодирующих частях этих последовательностей. Если учесть, что эволюционно человек и мышь разделены почти 80 миллионами лет эволюции, эти данные рассматриваются как сви- детельство функциональной значимости некодирующих частей этих генов По-видимому, далеко не всякие мутации в некодиру- ющих районах ДНК являются нейтральными и в определенных слу- чаях они могут отрицательно влиять на жизнеспособность. К сожалению, в настоящее время ничего или почти ничего неиз- вестно о функциях некодирующих ДНК-последовательностей.
Высказывалось даже предположение, что их единственной функ- цией является репликация. Отсюда возникло представление об
"эгоистической" или "паразитической" ДНК. Конечно, полностью исключить наличие подобных паразитических последователь- ностей ДНК в любом геноме нельзя. Тем ни менее, представля- ется маловероятным, что значительная часть генома человека, также как и других видов, относится к эгоистической ДНК.
По-видимому, наши знания о роли некодирующей или, как еще говорят, "избыточной" ДНК все еще явно недостаточны. Ста- бильность структурной организации генома в пределах вида свидетельствует скорее о важной эволюционной роли некодирую- щих ДНК-последовательностей и об их участии в процессах он- тогенеза. Можно предполагать, что ответ на этот интригующий вопрос в какой-то мере будет получен при расшифровке и срав- нении полной первичной нуклеотидной последовательности гено- мов у животных разных видов и, прежде всего, у человека и мыши, где прогресс в секвенировании геномной ДНК особенно значителен (см.Главу III). Уместно заметить, что проведенный недавно компьютерный анализ генома человека позволяет пред- полагать наличие в его некодирующей части особого, пока еще непонятного генетического кода, смысл и значение которого остаются загадочными ( ?).
Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факульта- тивные элементы генома.
До сих пор мы рассматривали основные структурные эле- менты генома человека, положение которых в соответствии с представлениями классической генетики достаточно постоянно.
Начиная с 50-х годов стали накапливаться данные о существо- вании большого числа мобильных генетических элементов, присутствие которых в геноме не является обязательным, а их топография и количество может варьировать в различных клет- ках, тканях и у разных индивидуумов (McClintock, 1984; Berg,
Howe, 1989). У прокариот такие элементы получили название транспозонов. Их структура и функции достаточно хорошо изу- чены. Отличительной особенностью мобильных элементов явля- ется способность существовать как в интегрированном с хро- мосомой виде, так и в виде отдельных макромолекул - эписом, плазмид, вирусных частиц. Почти 50 различных семейств мо- бильных элементов описано у дрозофилы . Вместе эти последо- вательности составляют около 12% гаплоидного набора
(Golubovsky, 1995). В геноме млекопитающих содержится до 50
000 диспергированных копий ретропозона LINE размером около
6500 пар основанийю. Семейство Alu- повторов, содержащее от
300 до 500 тысяч копий, также относится к числу мобильных элементов генома (Сharlesworth et al.,1994). Явление лизоге- нии, то есть присутствие вирусных последовательностей в составе ДНК человека и наличие фрагментов генов человека в вирусных геномах, служит одним из примеров мобильности ДНК и возможности "горизонтальной" передачи наследственно закреп- ленных признаков между видами. Мобильные ДНК, как правило, относятся к факультативным элементам. Как уже отмечалось, не существует четких границ между облигатными и факультативными элементами генома, так как возможен взаимный переход от од- ного состояния к другому. Структурные локусы или сегменты хромосом могут трансформироваться в факультативные элементы за счет амплификации, интеграции в мобильные элементы или путем образования цитоплазматических ретротранскриптов. Об- ратный переход от факультативных элементов к облигатным осу- ществляется посредством инсерций, транспозон-индуцированных перестроек и обратной транскрипции.
Факультативные элементы существуют в геноме как популя- ции информативных макромолекул. Изменения, возникающие в них под воздействием внешних факторов, носят совершенно иной ха- рактер по сравнению с классическими мутациями в структурных локусах. Для описания изменений в факультативных элементах предложен термин " вариации" (Голубовский, 1985). Этот тер- мин впервые использован Жакобом и Воллманом для описания по- ведения эписом (Jacob, Wollman, 1961). Вариации могут приво- дить к изменениям на генотипическом уровне, то есть к мута- циям, вследствие простого перемещения факультативных элемен- тов или сдвига в соотношении между факультативными и обли- гатными элементами. В этих случаях мутации встречаются од- новременно у многих индивидуумов. Подобные изменения упоря- дочены, могут происходить сразу во многих локусах и отлича- ются высокой сайт-специфичностью. Локализация структурных перестроек, возникающих в результате вариаций, предопределе- на первоначальной топографией факультативных элементов на хромосомах. И наконец, сами вариации могут быть индуцированы обычными "не-мутагенными" факторами, такими как температура или межлинейные кроссы (Golubovsky, 1995). Факультативные элементы могут рассматриваться как оперативная память гено- ма, так как во многих случаях спонтанное возникновение мута- ций в облигатных элементах опосредовано их активацией. Счи- тается, в частности, что инсерционный мутагенез является причиной спонтанного возникновения 70% видимых мутаций в природных популяциях дрозофилы. Однако, у человека пока за- регистрированы лишь единичные случаи возникновения мутаций вследствие перемещения мобильных элементов генома (Vidaud et al.,1993).
Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные сайты.
Перечисленные выше компоненты генома не случайным обра- зом связаны с последовательностями нуклеотидов. И в этом смысле можно говорить о существовании в геноме человека структур более высокого иерархического порядка. Примером служат изохоры - длинные, в среднем, свыше 300 кб сегменты
ДНК, гомогенные по композиции оснований или по GC-уровням.
62% генома состоит из GC-бедных изохор и в них локализовано около 34% генов, 31% генома представлен GC-богатыми изохора- ми, содержащими 38% генов, и в 3% изохор, обогащенных
GC-последовательностями (так называемых H3 изохор), нахо- дится 28% генов (Mouchiroud et al., 1991; Saссone et al.,
1993). Таким образом, существуют относительно небольшие участки ДНК, в которых плотность генов в 10 -20 раз выше, чем в остальных последовательностях.
Другой общей чертой генома человека является то, что in vivo значительная доля цитозиновых остатков в молекуле ДНК метилирована, то-есть находится в форме 5-метилдезоксицити- дина. Экспериментальное изучение характера метилирования основано на сопоставлении рестрикционных фрагметов, образую- щихся после обработки ДНК эндонуклеазами, для которых сайты узнавания одинаковы и содержат в своем составе цитозин, но действуют эти ферменты по-разному, в зависимости от того, находится ли это основание в метилированном состоянии или нет. В частности, рестриктазы - Msp1 и Hpa11, узнают после- довательность CCGG, но в отличие от Msp1, Hpa11 не расщепля- ет ДНК в тех сайтах, где внутренний CpG динуклеотид метили- рован. Некоторые сегменты генома, особенно это относится к повторяющимся последовательностям, полностью метилированы в местах 5'-CCGG-3' и частично метилированы в 5'-GCGC-3' - сайтах рестрикции для Hha1. В других сегментах наблюдается характерный рисунок частичного метилирования в 5'-CCGG-3' последовательностях (Behn-Krappa et al., 1991). Различные индивидуумы, независимо от их этнического происхождения, практически не различаются по характеру метилирования ДНК в одних и тех же типах тканей, тогда как в процессе онтогене- тической дифференцировки происходят значительные изменения рисунков метилирования. В перевиваемых культурах клеток опу- холевого происхождения число метилированных сайтов резко уменьшено.
Высказано предположение о наличии прямой связи между метилированием ДНК и состоянием генетической активности в клетках. Существует класс белков, которые специфическим об- разом связываются с метилированными участками ДНК, делая их недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, воз- можно, и для полимераз. Получено много прямых эксперимен- тальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации эукариотических промоторов, а, значит, и в регуляции актив- ности генов. Напротив, гипометилирование промоторной области генов, в особенности CpG островков, как правило, свиде- тельствует о функциональной активности генов. Показано, что необычные структуры в молекуле ДНК, также как экзогенная
ДНК, инкорпорированная в процессе генетической трансформа- ции, нередко подвергаются метилированию. Известно, что мети- лирование играет важную роль в инактивации X хромосомы у са- мок, в регуляции экспрессии генов в процессе развития, а также непосредственно вовлечено в феномен хромосомного (ге- номного) импринтинга, связанного с различиями пенетрантности некоторых аллелей в зависимости от их происхождения, то есть прохождения через материнский или отцовский гаметогенез (Ба- ранов, 1991).
В GC-богатых изохорах локализовано большое количество
CpG островков - последовательностей от 500 до 2000 п.о., ха- рактеризующихся очень высоким содержанием гуанина и цитозина
(G+C > 60%), представленных в виде кластеров неметилирован- ных CpG дуплетов и, так называемых, G/C боксов - локусов, родственных сайту узнавания для одного из транскрипционных факторов Sp1 - (G)4C(G)4C (Lindsay, Bird, 1987; Bird, 1986;
Aissani, Bernardi, 1991). CpG острова содержат много сайтов узнавания для чувствительной к метилированию эндонуклеазы
HpaII, а также сайты для редкощепящих рестриктаз, узнающих неметилированные CpG дуплеты. В частности, более 80%
Nor1-сайтов связано с CpG-богатыми островками. Как правило,
CpG островки локализованы в 5'- фланкирующих последователь- ностях, 5'-зкзонах и 5'-интронах всех изученных хаузки- пинг-генов и 40% тканеспецифических генов. CpG островки яв- ляются характерной особенностью транскрибируемых участков генома. Их идентификация в клонированных последовательностях геномных библиотек существенно облегчает поиск конкретных структурных генов (см.раздел 2.4) . Наибольшая плотность CpG островков наблюдается в теломерных участках хромосом 1, 9,
15, 16, 17, 19, 20, 22 (Antonarakis,1994). Точные молекуляр- ные методы регистрации СрG островков показали, что их число в геноме человека приближается к 45000 (
Antequera,Bird,1993).
Можно также отметить существование в геноме человека сайтов, гиперчувствительных к действию ДНК-азы 1 и структур- но отличающихся от основной массы хроматина. Присутствие та- ких сайтов показано для многих генов млекопитающих и, по-ви- димому, это необходимое, но не достаточное условие их экспрессии. Локализация гиперчувствительных сайтов может ме- няться в процессе развития и под действием гормонов. В неко- торых случаях эти участки маркируют положение транскрипцион- ных регуляторных элементов генома, действующих как в положи- тельном, так и в отрицательном направлениях. В других случа- ях это области функционально активных генов, находящихся в деспирализованном состоянии и имеющих однонитевую структуру.
Именно такие однонитевые участки ДНК особенно выско чувстви- тельны к ДНК-азе 1. На этом их свойстве основан метод ник-трансляции in situ, позволяющий непосредственно на хро- мосомных препаратах визуализировать функционально активные районы хромосом. С этой целью хромосомные препараты обраба- тывают ДНК-азой 1, после чего непосредственно на них с по- мощью ДНК-полимеразы проводят синтез ДНК в присутствии мече- ных нуклеотидов. При этом метка включается преимущественно только в те участки хромосом,где находятся функционально ак- тивные гены (Verma, Babu, 1989).
ГЛАВА II.
ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, СТРУКТУРА ГЕНОВ.
Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен- тов.
Термин геном используется для обозначения полной гене- тической системы клетки, определяющей характер онтогенети- ческого развития организма и наследственную передачу в ряду поколений всех его структурных и функциональных признаков.
Понятие генома может быть применено к таксономической груп- пе, виду, отдельной особи, клетке, микроорганизму или ви- русу. Так, можно говорить о структуре генома эукариот и про- кариот, сравнивать геномы разных видов, изучать особенности строения генома у конкретных индивидуумов или следить за из- менениями, происходящими в геноме специфических клеток в процессе их онтогенетической дифференцировки. Часто геном определяется как генетическая информация, заключенная в мо- лекулах ДНК одной клетки. Однако, такие факты, как отсутствие связи между количеством ДНК в расчете на гаплоид- ный геном и таксономическим статусом видов, а также много- численные примеры существования огромных различий в содержа- нии ДНК между близкородственными видами (так называемый
"С-парадокс") свидетельствуют о том, что далеко не все участки ДНК связаны с информационными функциями. Понятия ге- нома и ДНК в значительной степени тождественны, так как основные принципы организации и функционирования генома це- ликом определяются свойствами ДНК. Присущие этим молекулам потенциальные возможности практически неограниченного струк- турного разнообразия определяют все многообразие мира живых существ, как на уровне межвидовых, так и индивидуальных раз- личий в пределах одного вида (Баев и др.,1990; Ратнер,1985).
Процесс эволюции и дифференцировки отдельных видов, как правило, сопровождался накоплением изменений в структуре ге- нома. Это касается, прежде всего, таких параметров, как ло- кализация и характер упаковки ДНК в клетках; количество ДНК, приходящееся на гаплоидный геном; типы, соотношение и функ- ции кодирующих и некодирующих нуклеотидных последователь- ностей; регуляция экспрессии генов; межпопуляционная вариа- бильность и филогенетический консерватизм первичной структу- ры генома. В пределах одного вида основные параметры генома достаточно постоянны, а внутривидовое разнообразие обеспечи- вается за счет мутационной изменчивости, то есть выпадения, вставки или замены нуклеотидов на сравнительно небольших участках ДНК. Чаще всего такие изменения касаются не- экспрессируемых элементов генома (интронов, псевдогенов, межгенных спэйсерных участков ДНК и т.д.).
Геномы эукариот, по-существу, можно рассматривать как мультигеномные симбиотческие конструкции, состоящие из обли- гатных и факультативных элементов (Golubovsky, 1995). Основу облигатных элементов составляют структурные локусы, коли- чество и расположение которых в геноме достаточно постоянно.
Присутствие в хромосомах некоторых видов повторяющихся ДНК, амплифицированных участков, ретровирусных последователь- ностей, псевдогенов, также как наличие в клетке эписом, рет- ротранскриптов, ампликонов, дополнительных B-хромосом и раз- личных цитосимбионтов (вирусов, бактерий, простейших) явля- ется не строго обязательным, их количество и положение может значительно варьировать, то есть эти элементы являются фа- культативными. В то же время участие факультативных элемен- тов в наследственной передаче признаков, в формировании му- тационной изменчивости и в эволюционных преобразованиях ви- дов несомненно доказано. Кроме того, существует непрерывный переход от одних состояний к другим за счет инсерции экстрахромосомных ДНК в хромосомы и выстраивания транспозо- ноподобных мобильных элементов из хромосом. Следовательно, несмотря на значительные отличия факультативных последова- тельностей от облигатных по характеру основных информацион- ных процессов (репликации, транскрипции, трансляции и сегре- гации), они также должны рассматриваться, как важнейшие эле- менты генома.
Остановимся теперь более детально на основных принципах организации генома человека. В каждой диплоидной клетке с 46 хромосомами содержится около 6 пикограмм ДНК, а общая длина гаплоидного набора из 23 хромосом составляет 3.5 * 10!9 пар нуклеотидов (Kao, 1985). Этого количества ДНК достаточно для кодирования нескольких миллионов генов. Однако, по многим независимым оценкам истиное число структурных генов нахо- дится в пределах от 50 000 до 100 000. В разделе 2.4 изложе- ны современные подходы, используемые для подсчета общего ко- личества генов, из которых следует, что наиболее вероятная оценка их числа составляет около 80 000. Сопоставляя это значение со средними размерами гена и соотношением между ве- личиной их экзонных и интронных областей, можно заклю- чить,что кодирующие последовательности ДНК занимают не более
10-15% всего генома (McKusick, Ruddle, 1977). Таким образом, основная часть молекул ДНК не несет информации об амино- кислотной последовательности белков, составляющих основу лю- бого живого организма, и не кодирует структуру рибосомаль- ных, транспортных, ядерных и других типов РНК. Функции этой
"избыточной" (junk) ДНК не ясны, хотя ее структура изучена достаточно подробно. Предполагается, что эта ДНК может участвовать в регуляции экспрессии генов и в процессинге
РНК, выполнять структурные функции, повышать точность гомо- логичного спаривания и рекомбинации, способствовать успешной репликации ДНК и, возможно, является носителем принципиально иного генетического кода с неизвестной функцией.
Наиболее общая характеристика генома может быть получена с помощью анализа кинетики реассоциации молекул ДНК. Динами- ка плавления геномной ДНК обнаруживает присутствие по край- ней мере трех различающихся по химической сложности фракций
(Льюин, 1987; Газарян, Тарантул, 1983). Быстро ренатурирую- щая фракция ДНК состоит из относительно коротких высокопов- торяющихся последовательностей; в промежуточную фракцию вхо- дит множество умеренно повторяющихся ДНК - более протяжен- ных, но представленных меньшим числом копий; медленно рена- турирующая фракция объединяет в себе уникальные последова- тельности ДНК, встречающиеся в геноме не более 1-2 раз.
С помощью молекулярного анализа проведена идентификация основных классов повторяющихся последовательностей ДНК, составляющих более 35% всего генома человека и включающих сателлитную ДНК, инвертированные повторы, умеренные и низко- копийные повторы, а также мини- и микросателлитные последо- вательности ДНК. Классификация этих типов повторов достаточ- но условна и основана, главным образом, на двух характе- ристиках: длине повторяющихся коровых единиц, которая может варьировать от 1-2 до более, чем 2000 п.о., и числе их ко- пий, также меняющихся в очень широких пределах - от десятка до миллиона на гаплоидный геном. Не менее важными характе- ристиками различных классов повторяющихся ДНК являются нук- леотидная последовательность "коровых" единиц повтора, спе- цифичность их организации, хромосомная локализация, внутри- и межвидовая стабильность, а также возможные функции этих типов ДНК.
Раздел 2.2. Повторяющиеся последовательности ДНК.
Сателлитная ДНК это класс высокоповторяющихся последо- вательностей, составляющих около 10% всего генома человека
(Kao, 1985). При центрифугировании геномной ДНК в градиенте плотности CsCl эти последовательности образуют четыре от- дельных сателлитных пика с различными средними значениями плавучей плотности. Методом гибридизации in situ показано присутствие сателлитной ДНК преимущественно в центромерных, теломерных и гетерохроматиновых районах большинства хро- мосом, при этом характер гибридизации сходен для всех четы- рех групп и не зависит от принадлежности ДНК-зондов к се- мействам повторов, образующих различные сателлитные пики. В каждой из этих групп, однако, присутствует небольшое коли- чество последовательностей, имеющих специфическую хромосом- ную локализацию. Так например, около 40% длинного плеча Y хромосомы составляет семейство последовательностей, тандемно повторяющихся более 3000 раз и не найденных в других хро- мосомах.
Выделяют три основных типа сателлитной ДНК: (1) короткие
- от 2 до 20 п.о., стабильные тандемные повторы с кратностью в несколько десятков тысяч раз, которые иногда перемежаются с неповторяющимися последовательностями; (2) кластеры более протяженных повторов, слегка различающихся по нуклеотидной последовательности; (3) сложные, достигающие нескольких со- тен пар нуклеотидов, повторяющиеся последовательности раз- личной степени гомологии (Газарян,Тарантул,1983). К послед- нему типу относятся альфа-сателлитные или альфоидные ДНК, среди которых найдено много хромосом-специфических последо- вательностей. Размеры повтрояющихся "коровых" единиц альфо- идной ДНК составляют около 170-200 п.о. В геноме человека и других приматов эти мономеры организованы в кластеры по 20 и более "коровых" единиц. После расщепления рестриктазой BamHI в альфоидной ДНК выявляется серия фрагментов, длиной около 2
000 п.о., в составе которых обнаруживаются альфоидные после- довательности, специфичные для гетерохроматиновых районов разных хромосом человека (1, 3, 4, 5, 9, 6, 7, 11, 17, 19,
Х). В некоторых случаях эти повторы гомологичны двум разным хромосомам (9 и 15, 13 и 21, 18 и Х) ( Willard,Waye, 1987).
Хромосом-специфические последовательности сателлитной альфо- идной ДНК нашли широкое применение в молекулярной цитогене- тике в качестве ДНК-зондов, удобных для маркирования индиви- дуальных хромосом в метафазных и интерфазных клетках челове- ка (Юров, 1987). Предполагается, что сателлитные ДНК играют важную роль в поддержании структур хромосом и, возможно, в их спаривании в процессе мейоза (Charlesworth et al., 1994).
Особое место среди сателлитных ДНК занимают микро- и минисателлитные последовательности, представляющие собой многочисленную группу рассеянных по всему геному относитель- но коротких тандемных повторов. Микросателлиты - это класс динуклеотидных повторов. Размер повторяющихся единиц в ми- нисателитных последовательностях может меняться от 3 - 4 до
10 - 15 нуклеотидов. Отличительной особенностью микро- и ми- нисателлитов является наличие среди них большого количества участков, вариабильных по числу копий в кластере.
Инвертированные или обращенные повторы составляют до 5% генома. Они состоят из двух тождественных копий длиной около
300 п.о., ориентированных в противоположных направлениях на одной нити ДНК и лежащих на расстоянии от нуля до десятка тысяч пар нуклеотидов друг от друга (в среднем - 1,6 кб).
Около 1/3 обращенных повторов не разделены промежуточными последовательностями и носят название палиндромов. Среднее расстояние между двумя различными парами инвертированных повторов около 12 кб, и их распределение по геному носит случайный характер. Комплементарные пары легко ассоциируют при отжиге, образуя шпилечные структуры с дуплексной ножкой и однонитевой петлей, длина которой соответствует расстоянию между парой обращенных повторов. Вследствие этого оказыва- ются приблеженными достаточно удаленные друг от друга участ- ки ДНК, что важно для работы ряда ферментов, обеспечивающих процессы репликации и транскрипции. Важно отметить и то, что однонитевой участок ДНК, образующий петлю, становится доступным для действя нуклеазы S1, специфически разрушающей однонитевую ДНК.
Группа умеренно повторяющихся последовательностей очень гетерогенна по длине и числу копий и составляет около 20% генома человека. Как правило, они распределены дисперсно по всем хромосомам, причем относительно короткие последователь- ности ДНК до 500 п.о., так называемые короткие диспергиро- ванные повторы - Sine, повторяются более 100 000 раз, в среднем, через каждые 2.2 кб. Число копий более длинных диспергированных последовательностей - Line, не превышает 10
000. Умеренные повторы найдены во всех структурных компонен- тах генома за исключением кодирующих областей генов. Два главных семейства умеренных повторов, Alu и Kpn1, занимают, по крайней мере, 10% генома и практически столько же занято несколькими сотнями других семейств повторов этого класса.
Основной единицей Alu семейства является короткая последовательность из 300 п.о., повторенная в геноме челове- ка несколько сот тысяч раз, в среднем, через каждые 5 кб или через каждые 2 - 3 диспергированных повтора, принадлежащих другим семействам (Kao, 1985; Льюин, 1987). При этом, кластеры Alu-повторов, как правило, лежат внутри R-дисков метафазных хромосом - Гимза отрицательных (G- дисков). Расп- ределение Alu-повторов по геному весьма неравномерно как между хромосомами, так и по их длине. Так, в хромосомах 14,
16, 21 Alu-последовательности концентрируются в области центромеры, а в хромосомах 4, 19, 20, Х и У выраженные кластеры Alu повторов не найдены. Члены Alu семейства не полностью идентичны друг другу. Однако, все они содержат сайт рестрикции для фермента AluI и имеют димерную структу- ру, то есть состоят из двух прямых повторов длиной около 130 п.о. с богатой аденином вставкой из 31 нуклеотида во втором мономере. Каждая Alu последовательность фланкирована прямыми повторами длиной от 7 до 20 п.о., различными для разных чле- нов семейства и имеющими большую степень гомологии с транспозоноподобными элементами про- и эукариот. Некоторые члены Alu семейства могут транскрибироваться с помощью фер- мента РНК-полимеразы 111. Предпологается, что при определен- ных условиях образующиеся при этом молекулы РНК могут обрат- но транскрибироваться, что в свою очередь, может привести к появлению в клетках Alu-содержащих кДНК, обладающих свойствами ретропазонов, то есть способных инсертироваться в геномную ДНК. В литературе описаны случаи инсерционного му- тагенеза Alu повторов, приводящие к гемофилии В и нейрофиб- роматозу типа 1. Однако, частота таких событий, по-видимому, невелика. Предполагается, что короткие умеренные повторы, подобные Alu семейству, участвуют в регуляции транскрипции, в процессинге РНК и в инициации репликации ДНК. Кроме того, обнаружена высокая степень гомологии Alu последовательностей с одним из видов низкомолекулярной РНК (7 S РНК), участвую- щей в секреции белков.
К числу Line повторов относится Kpn1 семейство, которое состоит из более длинных и значительно более гетерогенных последовательностей, рассеянных по всему геному. В ряде слу- чаев члены Kpn1 семейства группирются в кластеры, образуя более длинные структуры, повторяющиеся несколько тысяч раз.
Для некоторых членов этого семейства также доказана возмож- ность инсерции кДНК-овых копий Kpn1- РНК-транскриптов в ге- номную ДНК и возникновение мутаций. Такое явление было обна- ружено в одном случае гемофилии А. Некоторые Kpn1- последо- вательности не только транскрибируются, но и способны транслироваться (Charlesworth et al.,1994).
Раздел 2.3 Мультигенные семейства, псевдогены, онкоге- ны.
Многие гены человека повторены в геноме от нескольких единиц до нескольких сотен раз и образуют мультигенные се- мейства (Газарян, Тарантул, 1983; Босток, Самнер, 1981; Kao,
1985; Льюин, 1987). Эти гены обычно сгруппированы в кластеры в определенных районах одной, либо нескольких хромосом. Во многих мультигенных семействах наряду с функционально актив- ными генами содержатся псевдогены - мутационно измененные последовательности, не способные транскрибироваться или про- дуцирующие функционально неактивный генный продукт. Примера- ми мультигенных семейств могут служить гены рибосомальных, транспортных и ядерных РНК, гены альфа- и бета-глобинов, ту- булинов, миоглобина, актина, интерферона и многих других. В ряде случаев, возможна избирательная амплификация некоторых семейств генов в процессе их экспрессии, как, например, ге- нов рибосомальных РНК. При этом число способных транскриби- роваться копий генов увеличивается за счет их избирательной амплификации в сотни и даже тысячи раз, что сопровождается лавинообразным нарастанием доли соответствующего генопродук- та в клетках. Особое место среди мультигенных семейств зани- мают супергены - очень большие кластеры из сотен функцио- нально и структурно родственных генов, расположенных в сег- ментах отдельных хромосом. Классическим примером супергена может служить HLA комплекс, контролируюший главные антигены гистосовместимости. Он занимает район более 6000 кб на ко- ротком плече хромосомы 6р21 и состоит из серии тесно сцеп- ленных генов, ответственных за синтез множества белков, включающих клеточные поверхностные антигены, молекулы иммун- ного ответа и некоторые компоненты комплемента. К суперген- ным семействам относятся три комлекса расположенных на раз- ных хромосомах мультигенов, контролирующих синтез тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Интересно, что в процессе диффиренцировки B лимфоцитов, продуцирующих иммуноглобулины, происходит структурная перестройка этих семейств. При этом отдельные последовательности ДНК элиминируются, тогда как другие сливаются, так что структура генов иммуноглобулинов в зрелых B лимфоцитах значительно отличается от исходной, то есть от той, которая наблюдается в зародышевых клетках.
Одной из важных структурных особенностей генома челове- ка является наличие так называемых псевдогенов, уникальных последовательностей, очень сходных по своей структуре с оп- ределенными нормальными генами, но в силу присутствия в ко- дирующих последовательностях целого ряда мутаций не способ- ных транскрибироваться или правильно транслироваться с обра- зованием структурно и функционально активного продукта.
Псевдогены обнаружены для многих генов. Их количество варь- ирует от одной до нескольких десятков копий на геном и в этом случае они, как правило расположены тандемно. Иногда псевдогены тесно сцеплены с нормальными генами, во многих случаях псевдогены и гены локализованы в разных хромосомах.
Для некоторых моногенных заболеваний идентифицированы му- тантные аллели, сходные с мутациями в соответствующих псев- догенах. В этих случаях обсуждаеся возможная роль псевдоге- нов в спнтанном мутационном процессе.
В геноме человека присутствуют также нуклеотидные последовательности, гомологичные генам некоторых вирусов.
Впервые эти последовательности были идентифицированы в гено- ме вирусов, индуцирующих развитие опухолей у животных и че- ловека, и потому они были названы онкогенами. Гомологичные последовательностям в геноме человека носят название прото- онкогенов. В настоящее время уже идентифицировано более 100 протоонкогенов. Белковые продукты протоонкогенов, по-видимо- му, играют важную роль в нормальной пролиферации клеток осо- бенно на ранних стадиях эмбрионального развития, контролируя клеточный цикл и выбор геномной программы развития клетки.
При возникновении специфических мутаций в протоонкогенах, а также при нарушениях регуляции их работы, выражающихся в ги- перпродукции или в зкспрессии в нетипичномном месте или в несвойственный момент жизнедеятельности клетки, они начинают вести себя как онкогены, стимулируя неконтролируемое размно- жение и пролиферацию определенных клеточных клонов, что и может, в конечном счете, привести к формированию опухоли.
Раздел 2.4 Современное определение понятия "ген", транскрипция, регуляторные элементы генов.
Около 10-15% генома человека представлено уникальными транскрибируемыми последовательностями, составляющими основу структурных генов (Льюин, 1987). В настоящее время в понятие
"ген" включается не только его транскрибируемая область - экзоны + интроны, но также фланкирующие последовательности - лидерная, предшествующая началу гена, и хвостовая нетрансли- руемая область, раположенная на 3' конце гена (Рис.2.1 ). В отличие от генов прокариот гены человека редко представлены одной непрерывной последовательностью и в подавляющем боль- шинстве имеют прерывистую структуру. Относительно короткие кодирующие участки - зкзоны, чередуются с длинными интрона- ми, которые транскрибируются и входят в состав первичного
РНК-продукта, но затем при процессинге первичного РНК
-транскрипта они вырезаются и не участвуют в трансляции.
Процесс вырезания интронов из первичных транскриптов получил название сплайсинга. Таким образом, в зрелой мРНК интронные области отсутствуют, а экзоны составляют непрерывную кодиру- ющую последовательность. Размеры зрелых мРНК нередко в десятки раз меньше первичных РНК-транскрипов и, соот- ветственно, размеров самого гена.
Согласно классическим представлениям ген - это локус, на хромосоме, мутации в котором реализуются на уровне фено- типа. В молекулярной биологии ген трактуется как ассоцииро- ванный с регуляторными последовательностями фрагмент ДНК, соответствующий определенной единице транскрипции. Следова- тельно, представления о гене формальных генетиков далеко не полностью тождественны его физической единице и соотношения между этими двумя понятиями достаточно запутанные. Отметим некоторые причины этих противоречий. Известно, что мутации одного гена могут приводить к совершенно разным и даже в ря- де случаев к комплементарным фенотипам. Результаты прямого секвенирования генома свидетельствуют о присутствии в нем значительного большего числа генов, чем можно ожидать от ре- зультатов мутационного анализа. Одна и та же последователь- ность ДНК в геноме может кодировать несколько различных бел- ков, что достигается за счет так называемого альтернативного сплайсинга (образование разных мРНК из одного первичного
РНК-транскрипта). В крупных интронах ряда генов обнаружены смысловые последовательности других генов ("ген в гене"), считываемые в противоположном направлении. Транскрипционные единицы генома могут перекрываться за счет наличия разных промоторов. Наконец, благодаря соматической рекомбинации структура транскрибируемых последовательнстей некоторых ге- нов может быть различной в разных клонах клеток одного орга- низма (Т-клеточные рецепторы). Ситуация с определением поня- тия "ген" еще больше осложняется, если в это понятие вклю- чать многочисленные регуляторные последовательности. Возни- кает вопрос: "Как далеко от гена могут располагаться эти последовательности, чтобы их можно было включать в структуру гена?". Для многих целей оказывается удобным введенное в последнее время понятие "считаемый ген"- counting gene.
Последний рассматривается как отдельная транскрибируемая единица ДНК или её часть, которая может транслироваться в одну или несколько взаимосвязанных аминокислотных последова- тельностей. Поэтому последовательность, дающая две транскрипционные единицы за счет альтернативного сплайсинга и, как следствие, два разных белка учитывается как один ген.
Однако, если степень гомологии двух генопродуктов, имеющих общий транскрибируемый участок, невелика, то эти последова- тельности расцениваются как два разных гена (Fields et al.,1994).
По своему функциональному назначению гены могут быть разделены на две группы. Группа I представлена генами, коди- рующими собственно белки; группа II - генами, контролирующи- ми синтез рибосомальных, транспортных и ядерных РНК. По ха- рактеру экспрессии гены также могут быть подразделены на две группы - гены "домашнего хозяйства" (housekeeping genes), продукты которых необходимы для обеспечения жизнедеятель- ности любого типа клеток, и тканеспецифические гены, обеспе- чивающие специализированные функции клеток, то есть гены, функционально активные только в определенных типах клеток
(тканей) и только на определенных стадиях онтогенеза, так называемые гены терминальной дифференцировки.
Считается, что средние размеры гена человека составля- ют, примерно, от 10 до 30 кб. Однако, эта величина может ко- лебаться от нескольких десятков до миллионов пар нуклеоти- дов. Согласно последним данным, самый маленький из известных генов- МСС-7, имеет размеры всего 21 п.о. (Gonzales-Pastor et al.,1994), а самый болшой - ген дистрофина -2.2 мегабаз.
Гены отделены друг от друга протяженными промежутками - спейсерами, содержащими в своем составе большое количество повторяющихся последовательностей ДНК и нетранскрибируемые уникальные последовательности.
Рассмотрим более подробно современные данные о числе генов в геноме человека. Полученные разными методами оценки этой величены приведены в Табл.2.1. Исходя из размера генома
(около 3 000 миллионов п.о.), и среднего размера одного гена порядка 10 - 30 тыс.п.о. (Gilbert, 1992), общее число генов должно быть порядка 100 000. При этом, как уже указывалось, распределение генов на хромосомах крайне неравномерно. Уста- новлено, что более 90% генов находится в Гимза -отрицатель- ных районах метафазных хромосом, в так называемых R-бэндах
(Antequera,Bird ,1993). Проведенные недавно прямые исследо- вания методом секвенирования показывают, что в R-бэндах их число достигает 43-50 на один бэнд, а в Гимза- положительных районах хромосом (G бэндах), - только 1-2 на 75-80 килобаз, то есть всего в геноме можно ожидать около 70 000 генов.
Оценка числа генов по доле транскрибируемой части генома
(всего 12%) дает совсем маленькую величину - 20 000 генов
(Wagner et al.,1993). Методом исследования кинетики реассо- циации РНК в культуре клеток число генов оценивается между
20 - 40 000 (Lewin, 1990). В то же время в клетках мозга число различных мРНК по некоторым данным достигает 97 000
(Wagner et al.,1993). Наиболее точные подсчеты числа генов человека проведены в последнее время и основаны на оценке числа CpG островков (Табл.2.1). Известно, что в промоторной области всех генов "домашнего хозяйства" и примерно у 40 % генов терминальной дифференцировки, обеспечивающих специали- зированные функции дифференцированных клеток, находятся об- ласти коротких динуклеотидных CpG повторов. Разработаны мо- лекулярные методы точной регистрации этих участков, которые показали, что их число в геноме около 45 000, отсюда число структурных генов оценивается в 67-70 000 ( Antequera, Bird,
1993). Практически такое же число генов (64 000) определено недавно методом учета маркерных экспрессирующихся последова- тельностей (expressed sequence tags) (Fields et al., 1994).
Таким образом, суммируя вышеизложенное, можно сделать вывод, что в геноме человека содержится, в среднем, около 70-80 000 отдельных транскрибируемых ДНК последовательностей, то есть генов.
Транскрипция гена начинается с 5' конца первого экзона, где расположен сайт инициации транскрипциии. Определенной гомологии между стартовыми сайтами разных генов не наблюда- ется, но чаще всего они начинаются с нуклеотида А, окружен- ного пиримидиновыми основаниями. На границах между экзонами и интронами имеются консервативные канонические последова- тельности, играющие существенную роль в обеспечении точности вырезания интронов во время сплайсинга РНК. Все интронные последовательности начинаются с динуклеотида GT и заканчива- ются динуклеотидом AG, называемыми, соответственно, донорны- ми и акцепторными сайтами сплайсинга. На 3' конце многих структурных генов идентифицирована поли(А)-сигнальная после- довательность (AATAAA), участвующая в процессе модификации первичного РНК транскрипта и ответственная за альтернативный сплайсинг мРНК, обеспечивающий синтез разных зрелых мРНК с одного и того же первичного РНК транскрипта.
Транскрипция генов осуществляется с помощью фермента
РНК-полимеразы. Около 50-70% клеточного синтеза РНК обеспе- чивается РНК-полимеразой I, локализованной в ядрышках и от- ветственной за синтез генов рибосомальной РНК. РНК-полимера- за II обеспечивает транскрипцию генов, кодирующих собственно структурные белки. Этот фермент локализован в ядре (но не в ядрышках). На его долю приходится 20 - 40% синтеза РНК.
РНК-полимераза III контролирует синтез ядерных и транспорт- ных РНК (Льюин, 1987). На 1-м этапе РНК-полимераза связыва- ется с двухнитевым участком ДНК и, расплетая его, делает доступным спаривание смысловой нити ДНК с рибонуклеотидами
(Рис. 2.2). После того как первый нуклеотид РНК инкорпориру- ется в сайт инициации транскрипции, полимераза начинает продвигаться по нити ДНК в направлении 5'- 3', расплетая двойные нити ДНК впереди себя и заплетая их позади. Этот процесс продолжается до достижения терминирующего сигнала, представляющего собой один или несколько терминирующих кодо- нов. Затем молекулы РНК и фермента высвобождаются и двойная спираль (дуплекс) ДНК полностью восстанавливается.
Для правильного начала синтеза РНК необходимо точное взаимодействие РНК-полимеразы с молекулой ДНК. Этот процесс контролируется промотором - специальной регуляторной после- довательностью ДНК размерами около 75 п.о., локализованной, как правило, в 5'-фланкирующей области гена. Иногда под контролем одного промотора считывается несколько генов c об- разованием единого первичного РНК-транскрипта. Промоторные области различных генов довольно разнообразны по своему нук- леотидному составу. Однако, почти для всех промоторов харак- терно наличие консервативной последовательности из 7 основа- ний на расстоянии 19-27 нуклеотидов слева от сайта инициации транскрипции. Это, так называемый, TATA -бокс (блок Хог- несса), обеспечивающий корректное расположение РНК полимера- зы по отношению к стартовому сайту. На расстоянии 70 - 80 п.о. в направлении 5'-конца от начала транскрипции часто расположена другая консервативная последовательность из 9 п.о. - CAAT- бокс, контролирующий начальное связывание
РНК-полимеразы. Мутации в TATA- или в CAAT-боксах могут су- щественно влиять на скорость синтеза РНК. В 5'-фланкирующей области гена на расстоянии до тысячи пар оснований от начала его кодирующей части располагаются другие регуляторные последовательности, так называемые инхансеры (усилители), способные резко увеличивать продукцию гена за счет увеличе- ния скорости транскрипции. Эти контролирующие элементы могут работать независимо от их ориентации по отношению к сайту инициации. Для некоторых генов найдены участки ДНК, подавля- ющие транскрипцию, а также так называемые аттенюаторы (осла- бители) - последовательности, лежащие между сайтом инициации транскрипции и собственно геном. Они могут блокировать прод- вижение РНК-полимеразы. Благодаря такому сложному механизму контроля, достигается очень тонкая и эффективная регуляция экспрессии генов практически на всех этапах транскрипции, трансляции и образования функционально зрелого белка. Эти механизмы более детально рассмотрены в других разделах.
Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест- рикции, ПДРФ-анализ.
Кодирующие и регуляторные области структурных генов на- иболее консервативны в процессе эволюции, так как мутации в них подвержены давлению жесткого естественного отбора.
Действительно, небольшие изменения в этих последователь- ностях, даже замена одного основания, делеция или инсерция нескольких нуклеотидов, могут привести к прекращению синтеза белка или к потере его функции, что, как правило, драмати- ческим образом сказывается на жизнеспособности особей, несу- щих подобные мутации. Однако, около 90% генома человека состоит из некодирующих последовательностей, подобных сател- литным ДНК, умеренным повторам, интронам и спейсерным проме- жуткам между генами. Эти участки значительно более изменчивы и содержат множество, так называемых нейтральных мутаций или полиморфизмов, не имеющих фенотипического выражения и не оказывающих заметного влияния на жизнеспособность или репро- дуктивные свойства особей и, таким образом, не подверженных прямому давлению естественного отбора. Полиморфные локусы являются удобными генетическими маркерами. На основе анализа родословных можно проследить их наследование в ряду поколе- ний, проанализировать сцепление друг с другом, с известными генами и с анонимными последовательностями ДНК, то есть использовать в качестве обычных менделевских признаков в классическом генетическом анализе. Информативность полиморф- ных локусов определяется уровнем их генетической изменчи- вости в различных популяциях.
Экспериментально легко выявляются два варианта геномно- го полиморфизма. Количественые изменения в области локализа- ции мини- и микросателлитных последовательностей ДНК и ка- чественные замены отдельных нуклеотидов, приводящие к появ- лению полиморфных сайтов рестрикции. В первом случае измен- чивость по числу повторенных "коровых " единиц создает серию аллелей, характер и частота которых уникальны для каждого вариабильного локуса. Полиморфизм в сайтах рестрикции связан с присутствием точковых нейтральных мутаций, локализованых, как правило, в уникальных последовательностях некодирующих участков ДНК. Подобные мутации в силу вырожденности генети- ческого кода (см.Глава 1) могут возникать и в кодирующих последовательностях генов. Спонтанные мутации, возникающие в сайтах узнавания для определенных рестриктаз, делают их ре- зистентными к действию этих ферментов. Аналогичным образом, при таких заменах могут создаваться новые сайты рестрикции.
Показано, что полиморфные локусы встречаются во всех хро- мосомах с частотой приблизительно один полиморфный сайт на
300-500 п.о. Этот тип изменчивости ДНК был выявлен и исполь- зован для молекулярной маркировки специфических участков ге- нома исторически раньше по сравнению с вариабильными сател- литными повторами (Botstein et al.,1980).
Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагмен- тов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. Ана- лиз полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так назы- ваемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism
-RFLP analysis), включает следующие этапы: выделение геном- ной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекро- форетическое разделение образующихся фрагментов ДНК и иден- тификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рест- рикции, путем блот-гибридизации по Саузерну (см.Главу 1).
При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофо- реграммах или радиоавтографах (в зависимости от типа мечения
ДНК-зонда) будет выявляться один крупный фрагмент, соот- ветствующий по длине последовательности ДНК между двумя соседними константными сайтами рестрикции для той же эндо- нуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном локусе на электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам фрагмент, равный расстоянию между полиморфным сайтом рест- рикции и одним из ближайших константных сайтов рестрикции. С каким именно из двух фрагментов, прилегающих к полиморфному локусу, будет происходить гибридизация зависит от локализа- ции используемого для анализа ДНК-зонда. В частном случае возможна гибридизация одновременно с двумя соседними рест- рикционными фрагментами, если выбранный ДНК-зонд комплемен- тарен последовательности, содержащей полиморфный сайт рест- рикци. Однако, такие зонды очень редко используются на прак- тике, так как длина рестрикционных фрагментов обычно в десятки раз больше длины ДНК-зондов и далеко не всегда уда- ется выделить и проклонировать фрагмент ДНК, содержащий по- лиморфный сайт рестрикции. Поэтому в дальнейшем для простоты изложения мы будем рассматривать только более общую ситуацию и считать, что при отсутствии рестрикции в полиморфном сайте
ДНК-зонд гибридизуется с одним длинным фрагментом, а при на- личии рестрикции гибридизующийся фрагмент имеет меньшую дли- ну. Таким образом, при анализе ДНК особей, в обеих хромосо- мах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной об- ласти, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в нижней области геля, соответствующий более короткому фраг- менту ДНК. У особей, гомозиготных по мутации, изменяющей по- лиморфный сайт рестрикции, будет наблюдаться один бэнд в верхней части геля, соответствующий фрагменту большей длины, тогда как у гетерозигот проявятся оба эти бэнда (Рис. 2.3а).
ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае, если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содер- жащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния этого локуса возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амп- лифицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеа- зой, тогда как при полном соответствии полиморфной области сайту рестрикции образуются два фрагмента меньшей длины
(Рис.2.3б). У гетерозигот будут присутствовать 3 фрагмента, один из которых по длине будет соответствовать размеру амп- лификата до рестрикции, плюс 2 маленьких фрагмента с той же суммарной длиной. Таким образом, как и в случае использова- ния для анализа блот гибридизации по Саузерну, трем возмож- ным вариантам генотипа будут соответствовать три различных варианта электрофореграмм.
Необходимо подчеркнуть, что первичная идентификация по- лиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с определенными ге- нами, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зон- дов. Дальнейшая тактика заключается в поиске рестрикционной нуклеазы, выявляющей полиморфизм. С этой целью используют широкий набор эндонуклеаз для рестрикции геномной ДНК, выде- ленной из группы неродственных индивидуумов, представляющих собой репрезентативную выборку популяции. Затем проводят
ПДРФ-анализ отдельно для каждой из рестриктаз с набором име- ющихся ДНК-зондов. После обнаружения полиморфизма в одной из популяций аналогичные исследования проводят в других популя- циях.
Следует учитывать, что полиморфные сайты рестрикции всегда представляют собой двухаллельную систему, поэтому да- же при самой высокой вариабильности такого сайта, число ге- терозиготных по данному локусу особей в популяции не будет превышать 50% Между тем, только при наличии полиморфного сайта в гетерозиготном состоянии можно отличить мутантный аллель от нормального, то есть осуществить его молекулярную маркировку. Следовательно, информационная емкость такого по- лиморфизма относительно невелика ( см. Главы Y и VII).
Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные ДНК.
Гипервариабильные сателлитные повторы являются гораздо более информтивными маркерами по сравнению с полиморфными сайтами рестрикции, так как представляют собой мультиаллель- ные системы с уровнем гетерозиготности, достигающим 70 -
90%. Кроме того, оказалось, что количество высокоизменчивых микрои минисателлитных последовательностей в геноме челове- ка, по-видимому, превышает несколько десятков тысяч, они достаточно плотно и равномерно расположены в каждой из хро- мосом. Так более 90% из 5000 идентифицированных (C-A)-повто- ров являются полиморфными, причем в большинстве из них уро- вень гетерозиготности значительно превышает 50% (Weissenbach et al, 1992). Среди гипервариабильных мини-сателлитных последовательностей различают варьирующие по числу тандемные повторы - VNTR, три-, тетра- и пентануклеотидные повторы, а также некоторые другие классы повторов. Общее число высоко- полиморфных минисателлитных последовательностей в геноме превышает 1500 (Armour et al., 1990; Charlesworth et al.,
1994). VNTR (variable number tandem repeats - варьирующие по числу тандемные повторы) -характеризуются наличием 10 - 15 - ти нуклеотидных "коровых" последовательностей, сходных с контролирующими элементами рекомбинации E.coli (Jeffreys et al., 1985). С помощью ДНК-зондов, сконструированных на осно- ве тандемно повторяющихся "коровых" последовательностей, можно анализировать индивидуальную изменчивость в единичных или множественных высокополиморфных локусах, несущих одно- типную коровую последовательность. Примером может служить
VNTR, обнаруженная в интроне миоглобинового гена, включающая четыре тандемных повтора из 33 п.о., фланкированных прямыми повторами из 9 п.о. Полученные из этого района ДНК-зонды с успехом используются для идентификации личности методом
ДНК-фингерпринта, так как вероятность совпадения аллелей у двух неродственных индивидуумов по всем гипервариабильным локусам, гибридизующихися с этим ДНК-зондом, значительно меньше 10!-7 (Jeffreys et al.,1991). Высокополиморфные VNTR найдены также в гене инсулина, в области глобинового псевдо- гена и в Х-хромосоме, содержащей последовательности, гомоло- гичные ДНК вируса гепатита В (Nakamura et al., 1985). В последнее время многочисленные VNTR- последовательности об- наружены в хромосомах 1, 2q, 14, 16, 17, 19 (O'Brien,1992).
Поиск новых гипервариабильных локусов основан на системати- ческом скрининге клонированных последовательностей ДНК с по- мощью искусственно синтезированных "коровых" зондов. Особен- но удобны для такого скрининга геномные библиотеки, сконструированные на основе предварительно фракционированных по величине Mbo1 или Sau3A1 фрагментов ДНК, так как большие фрагменты обогащены длинными и более вариабильными минисате- литными последовательностями (Armour, et al., 1990). Хорошие результаты были получены также при скринировании космидных библиотек с помощью G-богатых синтетических ДНК-зондов и использование хемолюминесцентного метода в сочетании с ПЦР
(Decorte, Cassiman, 1990). В некоторых случаях с этой целью применяют также последовательности ДНК, выделенные из фага
М13, имеющего в своем составе сходные структуры (Armour etal., 1990).
Одним из вариантов минисателлитных последовательностей являются тримерные и тетрамерные короткие тандемные повторы
-STR (short tandem repeats), которые стабильно наследуются и также обладают высоким уровнем полиморфизма по числу коровых единиц (Edwards et al., 1991). В X хромосоме такие повторы обнаружены через каждые 300 - 500 кб, тогда как в других частях генома они встречаются на расстоянии 10 кб друг от друга. По некоторым оценкам их частота может достигать 1/20 кб (Charlesworth et al.,1994). Возможно, истиное число три- и тетрамерных повторов в геноме человека еще больше, так как они обнаружены во многих генах. Подобно другим повторам STR обычно встречаются в некодирующих частях генов. В последнее время, однако, обнаружена группа структурных генов, несущих тримерные повторы в регуляторных и даже в транслируемых частях генов. Изменения числа этих внутригенных повторов в сторону их увеличения может приводить к нарушению функции этих генов вплоть до полного блока экспрессии и быть причи- ной ряда тяжелых наследственных заболеваний - болезни экспансии (см.Главу X). В качестве зондов для выявления ко- ротких тандемных повторов используют синтетические олигонук- леотиды, построенные из простых повторов трех или четырех нуклеотидов.
В последнее время для обнаружения различных классов микросателлитных последовательностей и STR-повторов применя- ют эффективные методы, основанные на использовании ПЦР
(Edwards et al., 1991). Для этих локусов характерно большое число аллелей, которые различаются по числу коровых единиц.
Продукты амплификации этих сайтов могут отличаться друг от друга числом ди- три- или тетрануклеотидных повторов. Для удобства идентификации различных аллелей полимеразную цепную реакцию проводят в присутствии меченых нуклеотидов, а для электрофоретического разделения продуктов амплификации используют специальные секвенирующие гели. Многие STR-локусы настолько полиморфны, что нашли применение в судебной меди- цине для идентификации личности. Для повышения достоверности результатов с этой целью используют мультиплексные варианты
ПЦР, позволяющие устанавливать генотип индивидуума одновре- менно по нескольким STR-сайтам (Weber,May, 1994; Асеев и др.,1995). Возможность точного генотипирования личности с использованием полимеразной цепной реакции, то есть на мини- мальном количестве ДНК, является важным методическим преиму- ществом STR перед ранее рассмотренными VNTR, для анализа ко- торых чаще используют блот-гибридизацию по Саузерну.
Высокая частота коротких тандемных повторов, уникаль- ность комбинаций числа тетра-, три- и димеров в разных сай- тах в сочетании с их большой вариабильностью и сравнительной легкостью идентификации аллелей позволяет широко использо- вать эти повторы для генетического и физического картирова- ния в качестве наиболее удобных индексных маркеров геномных
ДНК-последовательностей (см.Главу III). Такие маркерные сай- ты получили название STS (sequence tagged sites). В настоя- щее время в геноме человека уже идентифицировано около 10
000 STS, подавляющее большинство которых представляет собой тандемные повторы 2 - 4 нуклеотидов. Благодаря выраженной индивидуальной специфичности и достаточно стабильному менде- левскому типу наследования STS-сайты нашли широкое примене- ние и в молекулярной диагностике генных болезней, прежде всего в качестве молекулярных маркеров для идентификации му- тантных хромосом в семьях высокого риска (см. Главу VII).
Наличие большого числа гипервариабильных микро- и минисател- литных последовательностей ДНК является характерной особен- ностью генома человека. Аналогичные последовательности, об- наруженные в геноме приматов, значительно более однородны, что доказывает возможность существенного увеличения вариа- бильности этих участков ДНК за сравнительно короткий эволю- ционный промежуток (Юров,1988; Gray et al., 1991).
Сведения о мутабильности высокополиморфных последова- тельностей в геноме человека весьма противоречивы. Показано, однако, что в наиболее вариабильных минисателлитных локусах частота мутаций может достигать 5% на гамету (Jeffreys et al., 1988). Предполагается, что одной из главных функций ги- первариабильных микро- и минисателлитных последовательностей
ДНК может быть контроль гомологичной рекомбинации в мейозе.
На культурах клеток показано стимулирующее влияние миниса- теллитных последовательностей ДНК на гомологичную рекомбина- цию. Так, инсерция синтезированной последовательности, составленной на основе гипервариабильных минисателлитов в геномную ДНК приводит к более, чем 10-кратному увеличению числа реципрокных обменов, причем степень этого влияния об- ратно пропорциональна расстоянию между STR и сайтом рекомби- нации (Wahls et al., 1990). Вместе с тем, многие авторы об- ращают внимание на достаточно высокую стабильность миниса- теллитных аллелей, что позволяет их широко использовать как для генетического маркирования, так и для популяционных исследований и идентификации личности методом ДНК-фингерп- ринта (Decorte,Cassiman 1993; Edwards et al.,1991; Ива- нов,1989).
Для многих мутаций, локализованных в некодирующих частях генома, характерны высокие уровни популяционного по- лиморфизма. Необходимо, однако, подчеркнуть, что эта измен- чивость не затрагивает общей структуры генома, определяющей различия между видами. Более того, сопосталение первичных нуклеотидных последовательностей сравнительно протяженных секвенированных участков ДНК (области Т-рецепторных генов длиной около 100 кб) обнаружило сохранение высокой степени гомологии не только в кодирующих, но и, что особенно удиви- тельно, в некодирующих частях этих последовательностей. Если учесть, что эволюционно человек и мышь разделены почти 80 миллионами лет эволюции, эти данные рассматриваются как сви- детельство функциональной значимости некодирующих частей этих генов По-видимому, далеко не всякие мутации в некодиру- ющих районах ДНК являются нейтральными и в определенных слу- чаях они могут отрицательно влиять на жизнеспособность. К сожалению, в настоящее время ничего или почти ничего неиз- вестно о функциях некодирующих ДНК-последовательностей.
Высказывалось даже предположение, что их единственной функ- цией является репликация. Отсюда возникло представление об
"эгоистической" или "паразитической" ДНК. Конечно, полностью исключить наличие подобных паразитических последователь- ностей ДНК в любом геноме нельзя. Тем ни менее, представля- ется маловероятным, что значительная часть генома человека, также как и других видов, относится к эгоистической ДНК.
По-видимому, наши знания о роли некодирующей или, как еще говорят, "избыточной" ДНК все еще явно недостаточны. Ста- бильность структурной организации генома в пределах вида свидетельствует скорее о важной эволюционной роли некодирую- щих ДНК-последовательностей и об их участии в процессах он- тогенеза. Можно предполагать, что ответ на этот интригующий вопрос в какой-то мере будет получен при расшифровке и срав- нении полной первичной нуклеотидной последовательности гено- мов у животных разных видов и, прежде всего, у человека и мыши, где прогресс в секвенировании геномной ДНК особенно значителен (см.Главу III). Уместно заметить, что проведенный недавно компьютерный анализ генома человека позволяет пред- полагать наличие в его некодирующей части особого, пока еще непонятного генетического кода, смысл и значение которого остаются загадочными ( ?).
Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факульта- тивные элементы генома.
До сих пор мы рассматривали основные структурные эле- менты генома человека, положение которых в соответствии с представлениями классической генетики достаточно постоянно.
Начиная с 50-х годов стали накапливаться данные о существо- вании большого числа мобильных генетических элементов, присутствие которых в геноме не является обязательным, а их топография и количество может варьировать в различных клет- ках, тканях и у разных индивидуумов (McClintock, 1984; Berg,
Howe, 1989). У прокариот такие элементы получили название транспозонов. Их структура и функции достаточно хорошо изу- чены. Отличительной особенностью мобильных элементов явля- ется способность существовать как в интегрированном с хро- мосомой виде, так и в виде отдельных макромолекул - эписом, плазмид, вирусных частиц. Почти 50 различных семейств мо- бильных элементов описано у дрозофилы . Вместе эти последо- вательности составляют около 12% гаплоидного набора
(Golubovsky, 1995). В геноме млекопитающих содержится до 50
000 диспергированных копий ретропозона LINE размером около
6500 пар основанийю. Семейство Alu- повторов, содержащее от
300 до 500 тысяч копий, также относится к числу мобильных элементов генома (Сharlesworth et al.,1994). Явление лизоге- нии, то есть присутствие вирусных последовательностей в составе ДНК человека и наличие фрагментов генов человека в вирусных геномах, служит одним из примеров мобильности ДНК и возможности "горизонтальной" передачи наследственно закреп- ленных признаков между видами. Мобильные ДНК, как правило, относятся к факультативным элементам. Как уже отмечалось, не существует четких границ между облигатными и факультативными элементами генома, так как возможен взаимный переход от од- ного состояния к другому. Структурные локусы или сегменты хромосом могут трансформироваться в факультативные элементы за счет амплификации, интеграции в мобильные элементы или путем образования цитоплазматических ретротранскриптов. Об- ратный переход от факультативных элементов к облигатным осу- ществляется посредством инсерций, транспозон-индуцированных перестроек и обратной транскрипции.
Факультативные элементы существуют в геноме как популя- ции информативных макромолекул. Изменения, возникающие в них под воздействием внешних факторов, носят совершенно иной ха- рактер по сравнению с классическими мутациями в структурных локусах. Для описания изменений в факультативных элементах предложен термин " вариации" (Голубовский, 1985). Этот тер- мин впервые использован Жакобом и Воллманом для описания по- ведения эписом (Jacob, Wollman, 1961). Вариации могут приво- дить к изменениям на генотипическом уровне, то есть к мута- циям, вследствие простого перемещения факультативных элемен- тов или сдвига в соотношении между факультативными и обли- гатными элементами. В этих случаях мутации встречаются од- новременно у многих индивидуумов. Подобные изменения упоря- дочены, могут происходить сразу во многих локусах и отлича- ются высокой сайт-специфичностью. Локализация структурных перестроек, возникающих в результате вариаций, предопределе- на первоначальной топографией факультативных элементов на хромосомах. И наконец, сами вариации могут быть индуцированы обычными "не-мутагенными" факторами, такими как температура или межлинейные кроссы (Golubovsky, 1995). Факультативные элементы могут рассматриваться как оперативная память гено- ма, так как во многих случаях спонтанное возникновение мута- ций в облигатных элементах опосредовано их активацией. Счи- тается, в частности, что инсерционный мутагенез является причиной спонтанного возникновения 70% видимых мутаций в природных популяциях дрозофилы. Однако, у человека пока за- регистрированы лишь единичные случаи возникновения мутаций вследствие перемещения мобильных элементов генома (Vidaud et al.,1993).
Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные сайты.
Перечисленные выше компоненты генома не случайным обра- зом связаны с последовательностями нуклеотидов. И в этом смысле можно говорить о существовании в геноме человека структур более высокого иерархического порядка. Примером служат изохоры - длинные, в среднем, свыше 300 кб сегменты
ДНК, гомогенные по композиции оснований или по GC-уровням.
62% генома состоит из GC-бедных изохор и в них локализовано около 34% генов, 31% генома представлен GC-богатыми изохора- ми, содержащими 38% генов, и в 3% изохор, обогащенных
GC-последовательностями (так называемых H3 изохор), нахо- дится 28% генов (Mouchiroud et al., 1991; Saссone et al.,
1993). Таким образом, существуют относительно небольшие участки ДНК, в которых плотность генов в 10 -20 раз выше, чем в остальных последовательностях.
Другой общей чертой генома человека является то, что in vivo значительная доля цитозиновых остатков в молекуле ДНК метилирована, то-есть находится в форме 5-метилдезоксицити- дина. Экспериментальное изучение характера метилирования основано на сопоставлении рестрикционных фрагметов, образую- щихся после обработки ДНК эндонуклеазами, для которых сайты узнавания одинаковы и содержат в своем составе цитозин, но действуют эти ферменты по-разному, в зависимости от того, находится ли это основание в метилированном состоянии или нет. В частности, рестриктазы - Msp1 и Hpa11, узнают после- довательность CCGG, но в отличие от Msp1, Hpa11 не расщепля- ет ДНК в тех сайтах, где внутренний CpG динуклеотид метили- рован. Некоторые сегменты генома, особенно это относится к повторяющимся последовательностям, полностью метилированы в местах 5'-CCGG-3' и частично метилированы в 5'-GCGC-3' - сайтах рестрикции для Hha1. В других сегментах наблюдается характерный рисунок частичного метилирования в 5'-CCGG-3' последовательностях (Behn-Krappa et al., 1991). Различные индивидуумы, независимо от их этнического происхождения, практически не различаются по характеру метилирования ДНК в одних и тех же типах тканей, тогда как в процессе онтогене- тической дифференцировки происходят значительные изменения рисунков метилирования. В перевиваемых культурах клеток опу- холевого происхождения число метилированных сайтов резко уменьшено.
Высказано предположение о наличии прямой связи между метилированием ДНК и состоянием генетической активности в клетках. Существует класс белков, которые специфическим об- разом связываются с метилированными участками ДНК, делая их недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, воз- можно, и для полимераз. Получено много прямых эксперимен- тальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации эукариотических промоторов, а, значит, и в регуляции актив- ности генов. Напротив, гипометилирование промоторной области генов, в особенности CpG островков, как правило, свиде- тельствует о функциональной активности генов. Показано, что необычные структуры в молекуле ДНК, также как экзогенная
ДНК, инкорпорированная в процессе генетической трансформа- ции, нередко подвергаются метилированию. Известно, что мети- лирование играет важную роль в инактивации X хромосомы у са- мок, в регуляции экспрессии генов в процессе развития, а также непосредственно вовлечено в феномен хромосомного (ге- номного) импринтинга, связанного с различиями пенетрантности некоторых аллелей в зависимости от их происхождения, то есть прохождения через материнский или отцовский гаметогенез (Ба- ранов, 1991).
В GC-богатых изохорах локализовано большое количество
CpG островков - последовательностей от 500 до 2000 п.о., ха- рактеризующихся очень высоким содержанием гуанина и цитозина
(G+C > 60%), представленных в виде кластеров неметилирован- ных CpG дуплетов и, так называемых, G/C боксов - локусов, родственных сайту узнавания для одного из транскрипционных факторов Sp1 - (G)4C(G)4C (Lindsay, Bird, 1987; Bird, 1986;
Aissani, Bernardi, 1991). CpG острова содержат много сайтов узнавания для чувствительной к метилированию эндонуклеазы
HpaII, а также сайты для редкощепящих рестриктаз, узнающих неметилированные CpG дуплеты. В частности, более 80%
Nor1-сайтов связано с CpG-богатыми островками. Как правило,
CpG островки локализованы в 5'- фланкирующих последователь- ностях, 5'-зкзонах и 5'-интронах всех изученных хаузки- пинг-генов и 40% тканеспецифических генов. CpG островки яв- ляются характерной особенностью транскрибируемых участков генома. Их идентификация в клонированных последовательностях геномных библиотек существенно облегчает поиск конкретных структурных генов (см.раздел 2.4) . Наибольшая плотность CpG островков наблюдается в теломерных участках хромосом 1, 9,
15, 16, 17, 19, 20, 22 (Antonarakis,1994). Точные молекуляр- ные методы регистрации СрG островков показали, что их число в геноме человека приближается к 45000 (
Antequera,Bird,1993).
Можно также отметить существование в геноме человека сайтов, гиперчувствительных к действию ДНК-азы 1 и структур- но отличающихся от основной массы хроматина. Присутствие та- ких сайтов показано для многих генов млекопитающих и, по-ви- димому, это необходимое, но не достаточное условие их экспрессии. Локализация гиперчувствительных сайтов может ме- няться в процессе развития и под действием гормонов. В неко- торых случаях эти участки маркируют положение транскрипцион- ных регуляторных элементов генома, действующих как в положи- тельном, так и в отрицательном направлениях. В других случа- ях это области функционально активных генов, находящихся в деспирализованном состоянии и имеющих однонитевую структуру.
Именно такие однонитевые участки ДНК особенно выско чувстви- тельны к ДНК-азе 1. На этом их свойстве основан метод ник-трансляции in situ, позволяющий непосредственно на хро- мосомных препаратах визуализировать функционально активные районы хромосом. С этой целью хромосомные препараты обраба- тывают ДНК-азой 1, после чего непосредственно на них с по- мощью ДНК-полимеразы проводят синтез ДНК в присутствии мече- ных нуклеотидов. При этом метка включается преимущественно только в те участки хромосом,где находятся функционально ак- тивные гены (Verma, Babu, 1989).
ГЛАВА YIII.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА.
Раздел 8.1. Генетические линии животных.
Большая роль в исследовании проблем генетики челове- ка и медицинской генетики принадлежит мутантным генетическим линиям животных и, в особенности, генетическим линиям мышей
(Конюхов, 1969, 1980; Корочкин, 1978). Высокий процент сходства по нуклеотидными последовательностям между кодирую- щими, регуляторными и даже интронными областями гомологичных генов млекопитающих и человека, а также наличие большого числа консервативных групп сцепления с идентичным расположе- нием генов наряду с возможностями использования очень мощных экспериментальных подходов для идентификации и клонирования генов линейных животных позволяют проводить параллельные исследования, значительно ускоряющие эффективность поиска и молекулярного анализа индивидуальных генов человека.
Для многих моногенных заболеваний человека животные, несущие мутации в гомологичных генах, являются лучшими, а зачастую и единственными моделями для исследования молеку- лярных основ патогенеза и отработки оптимальных схем лече- ния, в том числе и с применением методов генной терапии
(см.Главу IX). Поиск таких биологических моделей, прежде всего, ведется, среди уже существующих генетических линий животных с установленным типом наследования определенных аномальных признаков. Наиболее трудным при этом является до- казательство идентичности мутантных генов и, соответственно первичных биохимических дефектов, у человека и у линейных животных.
В различных питомниках мира, в том числе и в России, созданы и поддерживаются кллекции, насчитывающие от десятков до несколько сотен генетических линий различных эксперимен- тальных животных - мышей, крыс, кроликов, собак и др. (Коню- хов, 1969; 1980; Staat, 1969; Hogan et al, 1989; Бландова и др., 1990). Среди них генетические линии мышей наиболее мно- гочислены в первую очередь из-за высокой плодовитости, удобства содержания, относительной легкости эксперименталь- ного манипулирования и целого ряда других причин. Некоторые из этих линий представляют собой случайные находки, другие, а их большинство, получены в результате действия различных мутагенных факторов. Так, значительное число биологических моделей было получено путем биохимической селекции потомства мышей самцов, обработанных сильными мутагенами - этилнитроз- мочевиной, триэтиленмеламином или облученных Рентгеном. Так были смоделированы на мышах альфа-талассемия, полицитемия, почечный ацидоз (Erickson, 1988). Однако, такой способ полу- чения животных-моделей, хотя и более эффективен, чем поиск спонтанно мутировавших особей, также основан на чистой слу- чайности и не позволяет направленно менять структуру нужного гена.
Процесс создания подобных генетических линий обычно включает отбор особей с фенотипическими отклонениями; анализ наследования этих фенотипческих признаков; длительное близ- кородственное разведение отселектированных особей. При моно- генном наследовании такие линии могут либо целиком состоять из мутантных гомозигот, либо поддерживаться через гетерози- готных особей в случае сниженной жизнеспособности и наруше- ния плодовитости у гомозигот.
На первом этапе поиска адекватной модели какого-либо моногенного наследственного заболевания руководствуются сходством клинических проявлений течения болезни и фенотипом мутантных животных. Однако, одного этого сходства недоста- точно (Конюхов, 1969). Необходимо доказать гомологичность генотипической природы наблюдаемых нарушений, то есть дока- зать, что у человека и у животных (мышей) фенотипические из- менения обусловлены мутациями в гомологичных генах. Огромная мировая генетическая коллекция мышей насчитывет несколько сотен линий, в каждой из которых различные дефекты наследу- ются по моногенному типу. Спонтанные биологические модели наследственных болезней известны и достаточно полно изучены для многих других экспериментальных и домашних животных.
Представляется удивительным, что, несмотря на большое сходство геномов млекопитающих и наличие близких по первич- ной структуре и тождественных по функциям структурных генов, для значительной части наследственных болезней человека ге- нетические аналоги среди животных до сих пор не найдены (Ко- нюхов, 1969).
Это ограничение в настоящее время может быть преодалено путем целенаправленного конструирования генетических модель- ных линий животных. Экспериментальные основы такого подхода уже хорошо разработаны (Erickson, 1988; Аллен и др., 1990;
Melton, 1993; Stewart et al., 1994). Для этого используют технику культивирования и трансфекции эмбриональных стволо- вых клеток (см.ниже), отбор in vitro клонов с нужными генет- ческим изменениями и пересадку их в зародыши или в сомати- ческие ткани животных. Для анализа экспрессии мутантных ге- нов in vivo и оценки их биологического действия особенно удобными оказались трансгенные животные.
Раздел 8.2. Трансгенные животные.
Трансгенных животных получают в результате искусствен- ного введения - трансгеноза, чужеродного генетического мате- риала, представляющего из себя фрагмент гена или иную после- довательности ДНК, в оплодотворенную яйцеклетку или в ранние зародыши млекопитающих. Подобные модели являются идеальными экспериментальными системами для исследования молекуляр- но-генетических основ онтогенеза, для изучения функции чуже- родного гена, оценки его биологического действия на орга- низм, а также для производства различных манипуляций со спе- цифическими клеточными клонами in vivo. Разработано несколь- ко способов получения трансгенных животных. Исторически бо- лее ранним и широко применяемым до настоящего времени явля- ется микроиньекция чужеродной ДНК в пронуклеус - ядро опло- дотворенной яйцеклетки. Существуют детальные описания этого метода (Аллен и др., 1990; Hogan et al, 1989). Суть метода состоит в том, что под контролем микроскопа при помощи мик- романипулятора в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцек- летки тонкой иглой (до 1 микрона) вводят около 2 пиколитров раствора ДНК. Чужеродная ДНК, вначале свободно лежащая в нуклеоплазме, в течение нескольких последующих делений дроб- ления случайным образом интегрирует в один из сайтов ка- кой-либо хромосомы, то есть встраивается в ДНК-реципиента.
При этом, как показали эксперименты с меченой ДНК, в различ- ных бластомерах одного и того же дробящегося зародыша интег- рация может происходить в разные хромсомные сайты и число интегрированных копий ДНК в каждом из этих сайтов может зна- чительно варьировать. Тем не менее, поскольку сам эмбрион развивается, по-сути, из одного бластомера, во всех клетках такой особи после рождения чужеродная ДНК обычно находится только в одном каком-нибудь хромосомном сайте, хотя у разных особей она интегрируется по-разному и в разные сайты. После введения чужеродной ДНК в пронуклеус яйцеклетку транспланти- руют самке-реципиенту. Доля трансгенных животных в потомстве таких самок варьирует от 10% до 30%. Это означает, что по- добный механический вариант трансфекции чужеродных генов на ранней стадии эмбриогенеза является чрезвычайно эффективным.
Идентификацию трансгенных животных производят путем анализа геномной ДНК на наличие экзогенных последовательностей, ис- пользуя при этом методы блот-гибридизации или ПЦР. Экспрес- сию введенного гена анализируют путем идентификации специфи- ческих мРНК и/или соответствующих белковых продуктов в раз- личных тканях трансгенного животного.
Другой, более более прогрессивный способ получения трансгенных животных основан на том, что трансфекции подвер- гается не зигота, а тотипотентные эмбриональные стволовые клетки (см.ниже), которые затем трансплантируют в полость бластоцисты (Gardner, 1978). Этот метод и его решающие преи- мущества в плане генетического моделирования подробно рассмотрены в разделе 8.4.
Как правило, иньецированная ДНК при встраивании в хро- мосому образует блок из множества тандемно расположенных ко- пий, при этом число единиц повтора в блоке у разных особей может варьировать от единицы до нескольких сотен.
После интеграции введенной ДНК в хромосому различные генети- ческие конструкции устойчивы и стабильно передаются по- томству в соответствии с законами Менделя. Встраивание вве- денной ДНК в функционально значимые области генома может приводить к их дестабилизации и сопровождаться появлением мутаций, спектр которых очень разнообразен. Таким образом, животные, полученные при введении одного и того же гена, бу- дут различаться как по сайтам интеграции, так и по количест- ву копий встроенной чужеродной ДНК, а в некоторых случаях, по уровню мутабильности и по типам индуцированных мутаций.
Таким образом, каждое трансгенное животное в этом смысле уникально.
Трансгенные животные являются черезвычайно удобным обь- ектом для анализа роли отдельных элементов гена в регуляции его работы. Так, сопоставление характера экспрессии введен- ного гена у животных, различающихся по длине фланнкирующих последовательностей иньецированной ДНК, дает возможность об- наружить элементы гена, контролирующие его работу в разных типах тканей. Для облегчения анализа регуляторных последова- тельностей гена часто вводят генетические конструкции, соче- тающие эти элементы с геном-репортером, экспрессия которого выражается в появлении известной и легко определяемой фер- ментативной активности. Использование для трансгеноза реком- бинантных молекул ДНК, представляющих собой различные комби- нации регуляторных элементов и кодирующих последовательнос- тей, ведет к более глубокому пониманию молекулярных механиз- мов активации генов в разных типах тканей.
Как уже указывалось, случайный характер интеграции чуже- родной ДНК нередко индуцирует мутации и нарушает экспрессию нормальных генов реципиента. В ряде случаев наблюдаемые отк- лонения в развитии оказываются аналогичными или сходными с уже известными наследственными нарушениями у человека и по- добные животные также могут использоваться в качестве гене- тических моделей заболеваний. Этот подход был применен для получения моделей таких заболеваний, в патогенезе которых решающую роль играет эффект дозы генов. В частности, путем трансфекции зиготы мышей генами бета-глобина, коллагена, ре- нина, антигенов гистосовместимости удалось получить биологи- ческие модели таких заболеваний, как бета-талассемия, несо- вершенный остеогенез, гипертония и диабет, соответственно
(Erickson, 1988). Во всех перечисленных случаях введение до- полнительной дозы экспрессирующего гена приводило к наруше- нию балланса белковых генопродуктов в клетках и, как следс- твие этого, было причиной патологических процессов.
Раздел 8.3. Экспериментальное моделирование.
Другой вариант биологического моделирования основан на получении животных с определенными очень специфичными, но ненаследственными изменениями. Эти животные также могут быть использованы для анализа молекулярных основ патогенеза и разработки методов адекватного лечения. Рассмотрим несколько примеров подобного экспериментального моделирования.
Описанная технология трансгеноза (введение генов в про- нуклеус) может быть использована, в частности, для направ- ленного получения животных с избирательными дефектами
(уродствами) тех или иных тканей и органов. Метод заключает- ся в возможности селективной элиминации тех специфических типов клеток, которые отсутствуют или дефектны у больных с моделируемым типом заболевания. Такие животные могут быть получены при иньекции в зародыш рекомбинантной ДНК, содержа- щей какой-либо цитотоксический ген, например, ген дифтерий- ного токсина, находящийся под контролем работающих в опреде- ленных типах клеток регуляторных элементов ДНК. При актива- ции этих контролирующих элементов на определеной стадии раз- вития экспрессия токсического гена приводит к избирательной гибели всей специфической популяции клеток, то есть такая система действует как очень точный скальпель.
Дальнейшая модификация метода заключается в использова- нии для трансгеноза условно летального гена, каким является, например, ген тимидинкиназы вируса Герпеса. Клетки, экспрессирующие этот ген, функционируют совершенно нормаль- но. Однако, на любой стадии онтогенетического развития можно вызвать их селективную гибель при введении животному ганцик- ловира - противогерпесного препарата. Эта система дает боль- ше возможностей для экспериментального анализа роли специфи- ческих клонов клеток в процессе нормального развития, а так- же для изучения патологичеких процессов, связанных с гибелью этих клеток. Подобная методология используется также при разработке генотерапевтических подходов для лечения некото- рых ненаследственных, в частности онкологических заболева- ний (см Главу IX).
Весьма многообещающим методом моделирования представля- ется направленное выключение работы определенных генов путем введения в доимплантационные зародыши антисмысловых мРНК.
Такой подход был применен, в частности, при попытке модели- рования болезни Гоше - лизосомного заболевания, обусловлен- ного дефицитом бета-глюкуронидазы (Bevilacqua et al., 1988).
Естественно, что в этом случае выключение экспрессии гена носит транзиторный характер, то есть моделью, по-сути, явля- ется само животное - реципиент антисмысловой мРНК матрицы.
Другой пример экспериментального моделирования основан на пересадке тканей или клеток атимусным иммунодефицитным мышам nu/nu. У мышей этой линии в связи с отсутствием тимуса и выраженным врожденным иммунодефицитом не происходит оттор- жение трансплантированных чужеродных тканей. Более того, у таких животных может происходить дифференцировка трансплан- тированных подкожно эмбриональных зачатков и регенерация пе- ресаженных кусочков тканей из различных органов других видов животных и человека. Так например, кусочки трахеи крысы с нанесенными на них клетками бронхогенного эпителия человека, имплантированные подкожно атимусным мышам, формируют струк- туру поверхностного эпителия, сходную с той, которая имеется в бронхах человека. Именно таким путем мыши nu/nu были ак- тивно использованы для анализа экспрессии мутантных вариан- тов гена муковисцидоза человека, а также для испытания эф- фективности коррекции этого генетического дефекта с помощью методов генотерапии. В последнем случае мутантные эпители- альные клетки пациентов с муковисцидозом вначале подвергали трансфекции ретровирусными или аденовирусными векторами, не- сущими, наряду с геном - репортером, полноразмерную кДНК нормального гена муковисцидоза. Относительная простота по- добных моделей и возможность генетического манипулирования с клетками человека до их трансплантации атимусным мышам дела- ют этот подход весьма привлекательным для решения многих экспериментальных вопросов. Основные недостатки таких моде- лей связаны с трудностями содержания и разведения атимусных мышей и их низкой жизнеспособностью. Генетические линии жи- вотных в этом отношении имеют значительные преимущества.
Раздел 8.4. Конструирование модельных генетических ли- ний животных.
Современный уровень экспериментальной эмбриологии мле- копитающих и современные достижения молекулярной генетики позволяют осуществлять направленное получение генетических моделей наследственных болезней путем введения сайт-специфи- ческих модификаций в геном млекопитающих. Такой значительный качественный прорыв в генетическом моделировании стал возмо- жен благодаря появлению принципиально новой технологии мани- пулирования с ранними зародышами млекопитающих. Особенно важными в этом отношении оказались два новых методических подхода: получение зародышей-химер, состоящих из клеточных клонов разных зигот, путем введения тотипотентных клеток в полость бластоцисты (Gardner, 1978) и разработка технологии культивирования клеточных векторов, так называемых эмбрио- нальных стволовых клеток (Evans, Kaufman, 1981). С другой стороны, появились методы сайт-специфического переноса кло- нированных последовательностей ДНК в геном эукариот, осно- ванные на отборе клеточных клонов, в которых после трансфек- ции происходит инсерция экзогенной ДНК в гомологичном сайте геномной ДНК без какого-либо нарушения последовательности
ДНК в месте встраивания.
Конструированию генетических моделей должны предшество- вать идентификация и сравнительный анализ двух гетерологич- ных генов - гена человека, вследствие нарушения работы кото- рого развивается моделируемое заболевание, и его гомолога у выбранного для моделирования животного. При выборе обьекта моделирования, в первую очередь, руководствуются методичес- кими возможностями экспериментального манипулирования с жи- вотными. Важное значение имеет сходство кодирующих областей гетерологичных генов по нуклеотидным последовательностям. В большинстве случаев мыши представляются наиболее удобным обьектом для моделирования. Современный алгоритм формирова- ния генетической линии животных с мутациями в заданном гене предполагает: (1) наличие культур тотипотентных, то есть способных к неограниченному развитию и дифференцировке, эмб- риональных стволовых клеток; (2) создание на базе рекомби- нантных ДНК генно-инженерных конструкций для направленного переноса генов; (3) трансфекцию этих конструкций в культуры эмбриональных стволовых клеток последующим скринингом и от- бором клонов со специфическими генетическими модификациями;
(4) введение отобранных модифицированных клеток в зародыш на стадии бластоцисты по методу Гарднера с целью получения хи- мерных трансгенных животных; (5) отбор химерных особей, не- сущих модифицированные гены в различных тканях и органах;
(6) селекцию особей, гетерозиготных по данной мутации; (7) инбредное разведение и селекцию гомозигот (Рис.8.1).
Как упоминалось ранее, идеальной системой для направ- ленного переноса мутаций в геном млекопитающих являются эмб- риональные стволовые клетки - ЭСК (Evans, Kaufman, 1981;
Erickson, 1988; Labosky et al., 1994). Первичные культуры этих клеток получают из клеток бластоцисты (внутренней кле- точной массы) или из первичных половых клеток ранних пос- тимплантационных зародышей. При выращивании на питательном слое из эмбриональных фибробластов ЭСК сохраняются в недиф- ференцированном состоянии от трех месяцев до года. При этом они могут быть несколько раз заморожены и оттаяны без потери способности к дифференцировке. ЭСК, введенные в бластоцель
(полость бластоцисты), сохраняют свою тотипотентность и мо- гут участвовать в формировании, практически, всех эмбрио- нальных зачатков и органов развивающегося зародыша. В ре- зультате образуется животное - химера, состоящее из клеточ- ных клонов двух разных типов: клеток исходного родительского генотипа и ЭСК. Если эти клетки различаются, например, по генам окраски шерсти, животное - химера будет иметь попереч- ную или пятнистую окрашенность. При этом все животные, неза- висимым образом полученные в результате введения в одинако- вые по генотипу зародыши одной и той же линии клеток, будут отличаться друг от друга по характеру пятнистости, так как все химеры различны по набору клеточных клонов, развившихся и дифференцировавшихся из введенных в зародыш ЭСК. Химерные животные, у которых ЭСК дифференцировались в половые клетки и дали начало полноценным зрелым гаметам будут устойчиво пе- редавать своим потомкам генетическую информацию, содержащую- ся в ЭСК. Таких животных ингда называют зародышевыми транс- миттерами. При скрещивании их с мышами дикого типа часть по- томков будет уже гетерозиготна по мутантным генам ЭСК, то есть будут нести мутацию в гаплоидном состоянии в каждом ти- пе клеток. Это в равной степени относится и к мутациям, ис- кусственно введенным предварительно в ЭСК. Скрещивая таких гетерозигот, можно получить животных, гомозиготных по задан- ной мутации. Естественно, последнее достижимо только в том случае, если мутация не окажется летальной в гомозиготном состоянии у животных этого вида.
Возможность вести селекцию нужных мутантных или трансгенных клонов ЭСК и лишь затем их использовать в ка- честве клеточных векторов нашло широкое применение в генети- ческом моделировании. Первоначально для этой цели ЭСК обра- батывали различными мутагенами (этилнитрозомочевиной) отби- рали клоны клеток, несущих мутацию в нужном гене, и затем использовали их для создания инъекционных химер по Гарднеру.
Таким способом на мышах была получена модель болезни Леш-Ни- хана - мутация гена гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы
(Hooper et al.,1987). C разработкой технологии адресной доставки чужеродной ДНК в гены-мишени этот способ генети- ческого моделирования стал особенно эффективным. Сайт-специ- фическая модификация генов ЭСК достигается за счет гомоло- гичной рекомбинации между экзогенной и хромосомной ДНК. При трансфекции большая часть проникших в ядра молекул рекомби- нантной ДНК сохраняется там в течение двух-трех дней в виде кольцевых эписом и в дальнейшем теряется либо происходит ин- теграция трансфецирующей плазмиды в геном клетки- хозяина путем негомологичной рекомбинации, то есть в случайные сайты хромосомной ДНК. В таких клетках экспрессия введенных генов устойчиво сохраняется. Частота интеграции экзогенной ДНК мо- жет быть повышена при использовании линейных плазмид и спе- циальных, преимущественно, ретровирусных векторов экзогенной
ДНК (см. Главу IX). Случаи стабильной интеграции экзогенной
ДНК могут быть легко выявлены, если трансфецирующие плазмиды или вектора содержат селектируемый маркерный ген. Чаще всего в качестве маркера используют прокариотический ген neo, со- общающий клеткам устойчивость к неомицину. Клетки, в которых произошла интеграции такой плазмиды в хромосомную ДНК, будут образовывать устойчивые клоны при выращивании на среде G418, содержащей неомицин, в то время как все другие клоны клеток будут в этих условиях деградировать.
Раздел 8.5. Методы направленного переноса генов.
Наиболее важным шагом на пути искусственного получения мутантной линии животных является отбор клонов ЭСК с сайт-специфической модификацией определенного гена. Однако, случаи инсерции экзогенной ДНК в ген-мишень очень редки, их общая частота, обычно, не превышает 10-6. Предпринимаются попытки генетической модификации ЭСК с тем, чтобы повысить в них частоту гомологичной рекомбинации. Идентифицированы не- которые гены, контролирующие этот процесс у мышей и у чело- века. Однако, в любом случае схемы направленной модификации генов должны включать селекцию нужных клонов клеток. Впервые направленная сайт-специфическая модификация была выполнена также на гене гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы (см.выше) и была получена еще одна генетическая линия мышей, моделиру- ющая вызванную дефектом в HPRT-гене болезнь Леш-Нихана у че- ловека (Thomas, Capecci, 1987). Успех этих исследований, в первую очередь, обусловлен существованием простых схем отбо- ра клеток с функционирующим и нефункционирующим HPRT-геном на селективных средах. Важно также, что этот ген локализован в X-хромосоме и в ХУ-клетках он представлен одной копией.
При этих условиях случаи модификации гена, вызванные инсер- цией экзогенной ДНК в правильном положении, легко идентифи- цируются - Рис.8.1 (см. Главу X).
В настоящее время предложено несколько вариантов для направленного переноса неселектируемых генов за счет допол- нительной инсерции в трансфецирующую плазмиду селектируемого маркерного гена в таком положении, при котором его экспрес- сия происходит преимущественно при правильном встраивании векторной последовательности в ген-мишень (рис.8.2). Так, маркерный ген neo, помещенный в инсертируемую область ДНК плазмиды без собственного промотора, может экспрессироваться только находясь под контролем какого-либо другого промотора хромосомной ДНК. Для этого инсерция экзогенной ДНК должна произойти в область гена-мишени без сдвига рамки считывания.
При случайной интеграции экспрессии маркерного гена не будет
Таким образом, отбор неомицин-устойчивых клеток приведет к резкому увеличению частоты клонов, в которых произошла гомо- логичная рекомбинация между зкзогенной и геномной ДНК. На этом же принципе основано использование генетических конс- трукций с геном neo, не содержащим поли-А последовательности в 3' области. Дальнейший поиск гомологичных рекомбинантов среди G418-устойчивых клеток проводят путем блот-гибридиза- ции, используя в качестве ДНК-зонда фрагмент векторной пос- ледовательности, расположенный вне направленно переносимого участка экзогенной ДНК.
Особенно перспективным на сегоднешний день представля- ется метод позитивно-негативной селекции (Melton, 1994). Ме- тод сочетает отбор клеток, в которых произошла интеграция экзогенной ДНК, с селективной элиминацией тех из них, где встраивание произошло за счет негомологичной рекомбинации.
Для этого маркерный селектируемый ген neo с регуляторными последовательностями инсертируют в переносимую область ДНК плазмиды, а вне этой области встраивают условно летальный вирусный ген тимидинкиназы герпеса (HSV-tk). При интеграции такого вектора в геномную ДНК путем гомологичной рекомбина- ции HSV-tk ген не инкорпорируется в хромосому, тогда как при негомологичной рекомбинации этот ген будет присутствовать в неомицин-устойчивых клетках. Обработка таких клеток противо- герписным агентом - ганцикловиром, будет сопровождаться ги- белью всех клонов, экспрессирующих вирусную тимидинкиназу
(Рис.8.3).
Отбор клеток с модифицированным геном также может про- изводиться с помощью ПЦР. При этом не используют какие-либо маркерные гены и/или селектируемые среды. Олигопраймеры для амплификации выбирают таким образом, что один из них гомоло- гичен соседней с сайтом интеграции последовательности моди- фицируемого гена, а другой соответствует участку инсертируе- мой экзогенной ДНК (Рис.8.4). Метод позволяет обнаруживать присутствие пяти правильно модифицированных клеток среди
50 000. После трансфекции клетки разделяются на группы, в каждой из которых проводят тестирование с помощью ПЦР. При положительном ответе группу клеток разбивают на подгруппы и процедуру повторяют до тех пор, пока не удается изолировать нужные клоны.
Направленное выключение генов-мишеней может быть достиг- нуто несколькими способами. Так называемые, нулевые мутации могут быть получены путем встраивания плазмиды, содержащей, наряду с экзонными последовательностями модифицируемого гена и селектируемым маркерным геном, сильные транскрипционные и трансляционные стоп-сигналы. При этом в разрушенном за счет инсерции экзоне транскрипция прекращается, в результате чего образуется укороченный белок, незащищенный от действия кле- точных протеаз.
Более совершенной является разработанная недавно техни- ка двойной замены гена. Для этого используют ЭСК, дефицитные по ферменту HPRT - НМ1 (Melton, 1994). На первом этапе ген-мишень инактивируют путем замены одного из экзонов и прилежащих последовательностей на HPRT мини-ген. При этом в нокаутирующем векторе HPRT маркер фланкируется ДНК последо- вательностями, гомологичными месту вставки в ДНК гена-мише- ни. В этот же вектор включен и ген вирусной тимидинкиназы
(Рис.8.5). После трансфекции отбираются клетки позитивные по
HPRT и негативные по вирусной тимидин-киназе. Именно в таких клетках с высокой степенью вероятности произошла гомологич- ная рекомбинация с заменой одного из экзонов на инсертиро- ванный мини-ген HPRT. Факт такого встраивания доказывается при помощи ПЦР. На следующем этапе инсертированный HPRT ми- ни-ген заменяют на отсутствующий фрагмент гена-мишени, в ко- торый предварительно вносят интересующие исследователя мута- ции. При этом альтернативный вектор несет те же фланкирующие
ДНК-последоваельности гена-мишени, что и первый (нокаутирую- щий) вектор. Клетки HPRT минус на этом, 2- м этапе с большой вероятностью будут нести гомологичную рекомбинацию встроен- ной конструкции мини-HPRT гена и альтернативного фрагмента исходного гена. Факт такой рекомбинации контролируется с по- мощью ПЦР. Таким образом, вместо обычного выключения функции гена, что достигается уже на 1-м этапе, данная технология позволяет вносить в структуру гена дикого типа различные, заранее спланированные изменения, в том числе и специфичес- кие мутации, аналогичные таковым при наследственных болезнях у человека. Следовательно, данный подход позволяет проводить более тонкое генетическое моделирование и исследовать осо- бенности функции мутантного гена in vivo.
Для введения специфических мутаций в определенные экзо- ны гена используют, так называемые "hit & run" векторы (Has- ty et al., 1991). Перспективным также представляется исполь- зование дрожжевых YAC-векторов, несущих полноразмерные кДНК-овые последовательности гена. Так как уровень гомоло- гичной рекомбинации у дрожжей достаточно высок, в такие конструкции легко вводить специфические мутации и затем ис- пользовать их для трансфекции ЭСК и получения трансгенных животных 4.
Отбор клонов эмбриональных стволовых клеток, в которых произошла направленная модификация гена-мишени, в значитель- ной степени, предопределяет успех всего комплекса работ по созданию модельной генетической линии. Однако, и дальнейшие этапы этой программы, включающие получение химерных транс- генных животных, идентификацию зародышевых трансмиттеров
(химер, продуцирующих трансфецированные половые клетки) и селекцию гетерозиготных, а затем гомозиготных мутантнах осо- бей, требуют большой квалификации, труда и времени. Осложня- ющим обстоятельством является то, что химерные животные не- редко имеют сниженную жизнеспособность и плодовитость. То же может быть справедливо и в отношении гетерозиготных мутант- ных особей. В гомозиготном состоянии инсертированные мутации могут не только снижать жизнеспособность и плодовитость, но и обладать летальным или полулетальным эффектом уже в прена- тальном периоде. В таком случае линия поддерживается путем отбора и скрещивания гетерозигот.
Несмотря на огромные методические сложности и высокую стоимость, направленное получение моделей наследственных бо- лезней оправдывает затраченные усилия. Мутантные животные представляют уникальную возможность исследовать патофизиоло- гические процессы, развивающиеся в организме вследствие на- рушений работы определенного гена, анализировать влияние специфических мутаций на фенотип, тестировать новые лекарс- твенные препараты и испытывать различные терапевтические подходы. Велика также роль генетических линий в разработке методов генной терапии (см. Главу IX).
ГЛАВА IY.
ТИПЫ И НОМЕНКЛАТУРА МУТАЦИЙ. МЕТОДЫ ДНК- ДИАГНОСТИКИ.
Раздел 4.1 Мутантные аллели, характеристика и типы му- таций.
Каждый генетический локус характеризуется определенным уровнем изменчивости, то есть присутствием различных аллелей или вариантов последовательностей ДНК у разных индивидуумов.
Применительно к гену, аллели разделяются на две группы - нормальные, или аллели дикого типа, при которых функция гена не нарушена, и мутантные, приводящие к нарушению работы ге- на. В любых популяциях и для любых генов аллели дикого типа являются преобладающими. Под мутацией понимают все изменения в последовательности ДНК, независимо от их локализации и влияния на жизнеспособность особи. Таким образом, понятие мутации является более широким по сравнению с понятием му- тантного аллеля. Уместно, однако, заметить, что в научной литературе сравнительно часто встречающиеся в популяциях ва- рианты последовательностей генов, не приводящие к заметным нарушениям функций, обычно рассматриваются как нейтральные мутации или полиморфизмы, тогда как понятия "мутация" и "му- тантный аллель" зачастую употребляются как синонимы.
Как упоминалось ранее, различные изменения в нуклеотид- ной последовательности транскрибируемых областей ДНК могут по-разному проявляться в фенотипе. Часть из них не оказывает никакого влияния на структуру и функцию соответствующего белка. Примером могут служить замены нуклеотидов, не приво- дящие к замене аминокислот в силу вырожденности генетическо- го кода. Мутантные аллели, в свою очередь, могут быть под- разделены на три класса: (1) мутации, ведущие к полной поте- ре функции (loss-of-function), (2) мутации, сопровождающиеся количественными изменениями соответствующих мРНК и первичных белковых продуктов и (3) доминантно-негативные мутации, из- меняющие свойства белковых субъединиц таким образом, что они оказывают повреждающий эффект на жизнеспособность или функ- ционирование экспрессирующих типов клеток (gain-of-function мутации). Наибольшим повреждающим действием обладают мута- ции, приводящие либо к образованию бессмысленного белка, ли- бо к преждевременному окончанию его синтеза, то есть делеции или инсерции, не кратные трем нуклеотидам и потому вызываю- щие сдвиг рамки считывания, а также нонсенс мутации - замены нуклеотидов, при которых образуются терминирующие стоп-кодо- ны. Проявление таких мутаций зависит от их внутригенной ло- кализации. Чем ближе мутации к 5' концу гена, то есть к на- чалу транскрипции, тем короче их белковые продукты. Такие абортивные (truncated) белки неспособны к модификациям и быстро деградируют.
Фенотипическое проявление замен нуклеотидов в кодо- нах, так нназываемых миссенс мутаций, зависит от природы соответствующих аминокислотных замен в белке и от функцио- нальной значимости того домена, в котором это произошло.
Так, замены аминокислот в активных центрах белков могут соп- ровождаться полной потерей его функциональной активности, тогда как даже значительно более серьезные нарушения в дру- гих частях белка часто оказывают существенно меньшее влияние на фенотип. Мутации на стыке экзонов и интронов (так называ- емые сплайсинговые мутации) часто нарушают процессинг пер- вичного РНК-транскрипта, в результате чего происходит либо неправильное вырезание соответствующей интронной области и трансляция бессмысленного удлиненного белка, не защищенного от протеолитического действия внутриклеточных ферментов, ли- бо вырезание экзонов и образование делетированного белка. В обоих случаях сплайсинговые мутации, как правило , обуслав- ливают тяжелое течение болезни. Нарушения в регуляторных об- ластях генов сопровождаются количественными изменениями соответствующего продукта и не затрагивают структуры и функ- циональной активности белка. Проявление таких мутаций опре- деляется, в конечном счете, пороговым уровнем концентрации белка, при котором его функция еще сохраняется. Как правило, регуляторные мутации менее серьезны и обладают более выра- женным плейотропным (множественым) эффектом по сравнению с мутациями структурных генов.
Относительно недавно выявлен новый класс так называемых динамических мутаций, или мутаций экспансии, связанных с нестабильностью числа тринуклеотидных повторов в функцио- нально значимых частях генов. Многие тринуклеотидные повто- ры, локализованные в транскрибируемых или регуляторных об- ластях генов, характеризуются высоким уровнем популяционной изменчивости, в пределах которого не наблюдается фенотипи- ческих нарушений (Willems,1994). Болезнь развивается лишь тогда, когда число повторов в этих сайтах превосходит опре- деленный критический уровень. Наследование таких мутаций, как правило, отличается от классического Менделевского ти- па. Для них характерны: различная пенетрантность в сочетании с неполным доминированием; геномный импринтинг (различия фе- нотипических проявлений в зависимости от того, получена му- тация от матери или от отца) и феномен антиципации - на- растание тяжести проявления заболевания в последующих поко- лениях (Willems,1994).
Классическим примером мутаций экспансии является синд- ром ломкой Х-хромосомы (FraXA), обусловленный присутствием удлиненных CCG повторов в 5'-нетранслируемой регуляторной области FMR1-гена (Xq27.3). Аналогичные нестабильные повторы обнаружены еще в трех ломких сайтах, причем два из них
(FraXE и FraXF) расположены на очень небольшом расстоянии дистальнее FraXA. Во всех четырех случаях CCG-повторы лока- лизованы вблизи от CpG островков, при этом увеличение числа копий триплетов выше определенного порогового уровня сопро- вождается гиперметилированием всей регуляторной GC-богатой области, вследствие чего и происходит резкое снижение и полное выключение транскрипционной активности - мутации по типу " утраты функции" (loss-of-functions). Таким образом, область CCG-повторов в этих локусах можно рассматривать, как своеобразный cis-действующий элемент транскрипции (Willems,
1994, Mandel,1994).
Другой тип динамических мутаций описан для 6-ти раз- личных тяжелых аутосомно-доминантных нейродегенеративных расстройств (см. Главу X). Для всех этих заболеваний обнару- жено присутствие удлиненных CAG-повторов в открытой рамке считывания (ORF). Эти повторы транслируются в протяженные полиглютаминовые треки, предположительно локализованные в
ДНК- связывающих доменах соответствующих белковых продуктов.
В результате белковые молекулы приобретают новые свойства, нарушающие нормальные метаболические связи. Таким образом, нестабильные CAG-повторы можно рассматривать, как gain-of-function - мутации. Интенсивно обсуждается также возможность участия амплификации CAG-повторов в формировании предрасположенности к таким частым расстройствам центральной нервной системы, как шизофрения и маниакально-депрессивный психоз. Примером третьей группы болезней экспансии служит миотоническая дистрофия. При этом заболевании огромные CTG
(или CAG) повторы локализованы в 3'-нетранслируемой области гена. Они также рассматриваются, как факторы, нарушающие нуклеосомную организацию гена и подавляющие его транскрипцию
Более подробно болезни экспансии рассмотрены в Главе X.
Раздел 4.2. Генетическая гетерогенность наследственных заболеваний.
Одним из важных обобщающих итогов молекулярно-генети- ческих исследований моногенных болезней явилось доказа- тельство их генетической гетерогенности. Последняя может быть вызвана разными причинами. Прежде всего, оказалось, что один и тот же биохимический эффект (фенотип) может быть обусловлен мутациями в разных генах. С другой стороны, мута- ции одного и того же гена, как установлено, могут приводить к совершенно разным клиническим проявлениям. Например, мута- ции гена адренорецептора, сцепленого с Х-хромосомой, могут быть причиной нейродегенеративного заболевания - болезни
Кеннеди, если они захватывают область тринуклеотидных повто- ров (Глава X), и в то же время приводить к синдрому тестику- лярной феминизации, то есть нарушениям половой дифференци- ровки, если они затрагивают другие последовательности этого же гена. Крайним выражением такой гетерогенности может слу- жить пример с геном рецептора тирозинкиназы -RET, различные мутации которого могут приводить к 4-м совершенно различным наследственным синдромам, таким как семейная медуллярная карцинома щитовидной железы, болезнь Гиршпрунга, множествен- ная эндокринная неоплазия тип 2А (МЭН-2А) и тип 2B (МЭН-2B)
(Hayningen,1994). Подобные фенотипические разнообразия про- явлений мутаций одного и того же гена получили название ал- лельных серий. Термин используется уже около 20 лет для описания групп из нескольких моногенных наследственных забо- леваний, клинические проявления которых позволяют предпола- гать их связь с разными генами, в то время как биохимические и/или генетические исследования доказывают их аллельную при- роду, то есть в основе их патогенеза лежат разные мутации одного и того же гена.
В настоящее время известно более 100 таких болезней
(Romeo, McKusick, 1994). Для каждого заболевания из подобной серии аллелизм мутаций уже доказан на молекулярном уровне.
Причины подобного фенотипического разнообразия могут быть различными: (1) локализация мутантных аллелей в функциональ- но разных доменах белка; (2) принципиально разный механизм действия мутаций (loss-of-function, gain-of-function); (3) присутствие в том же гене модифицирующего мутантного аллеля или полиморфизма и (4) влияние генетического окружения на проявление мутантного аллеля, то есть его взаимодействие с определенными аллелями гена-модификатора или даже нескольки- ми такими генами. Углубленный молекулярно-генетический ана- лиз практически каждого наследственного заболевания указыва- ет на его значительную генетическую гетерогенность, связан- ную с различными мутациями гена. Некоторые примеры аллельных серий и генетической гетерогенности заболеваний будут рассмотрены более подробно в Главе X.
Раздел 4.3 Номенклатура мутаций.
Для практических целей и, главным образом, для чтения научной литературы, важно знать, как записываются мутации.
До недавнего времени единой номенклатуры записи мутаций не существовало. В 1992 г. двумя американскими учеными Артуром
Боде и Лап-Чи Тсуи была предложена универсальная стандартная система для обозначения разных мутаций (Beudet, Lap-Сhee
Tsui, 1993). Она рассчитана как на запись аминокислотных за- мен в белках, так и на нуклеотидные замены и перестановки в
ДНК. В первом случае, каждой аминокислоте соответствует од- нобуквенный символ (Табл.4.1), слева записывается нормальный вариант аминокислоты, справа - мутантный, а расположенный в центре номер соответствует месту замены в цепочке первичного продукта трансляции. Например, запись D44G означает замену аспарагина на глицин в 44-м положении полипептидной цепи, а
A655E - аланина на глутамин в пложении 655 белкового продук- та. Так записываются различные варианты аминокислотных замен при миссенс мутациях. Буквой Х обозначается место остановки синтеза полипептидной цепи при нонсенс мутациях. Например,
Q39X означает замену глицина на стоп сигнал в 39-м кодоне, а
W1282X - триптофан-триплета на стоп-кодон в положении 1282.
Отсутвие одной или нескольких аминокислот обозначают значком
^-дельта. Так, наиболее частая мутация, приводящая к муко- висцидозу- ^F508 - означает отсутствие фенилаланина в 508 положении трансмембранного регуляторного белка муковисцидо- за. Полиморфизмы, связанные с равноценной по функциональной значимости заменой аминокислот, записывают через черточку.
Например, M/V470 - метионин или валин в положении 470.
Таблица 4.1. Символы аминокмслот.
------------------------T-----------------T--------------¬
¦ Аминокислоты 1¦ 0 Трехбуквенный 1¦ 0
Однобуквенный 1¦
¦ 1¦ 0 символ 1¦ 0 символ 1
¦
+-----------------------+-----------------+--------------+
¦ Аланин 1¦ 0 Ala 1¦ 0 A 1
¦
¦ Аргинин 1¦ 0 Arg 1¦ 0 R 1
¦
¦ Аспарагин 1¦ 0 Asn 1¦ 0 N 1
¦
¦ Аспарагиновая кислота 1¦ 0 Asp 1¦ 0 D 1
¦
¦ Asn и/или Asp 1¦ 0 Asx 1¦ 0 B 1
¦
¦ Цистеин 1¦ 0 Cys 1¦ 0 C 1
¦
¦ Глутамин 1¦ 0 Gln 1¦ 0 Q 1
¦
¦ Глутаминовая кислота 1¦ 0 Glu 1¦ 0 E 1
¦
¦ Gln и/или Glu 1¦ 0 Glx 1¦ 0 Z 1
¦
¦ Глицин 1¦ 0 Gly 1¦ 0 G 1
¦
¦ Гистидин 1¦ 0 His 1¦ 0 H 1
¦
¦ Изолейцин 1¦ 0 Ile 1¦ 0 I 1
¦
¦ Лейцин 1¦ 0 Leu 1¦ 0 L 1
¦
¦ Лизин 1¦ 0 Lys 1¦ 0 K 1
¦
¦ Метионин 1¦ 0 Met 1¦ 0 M 1
¦
¦ Фенилаланин 1¦ 0 Phe 1¦ 0 F 1
¦
¦ Пролин 1¦ 0 Pro 1¦ 0 P 1
¦
¦ Серин 1¦ 0 Ser 1¦ 0 S 1
¦
¦ Треонин 1¦ 0 Thr 1¦ 0 T 1
¦
¦ Триптофан 1¦ 0 Trp 1¦ 0 W 1
¦
¦ Тирозин 1¦ 0 Tyr 1¦ 0 Y 1
¦
¦ Валин 1¦ 0 Val 1¦ 0 V 1
¦
L-----------------------+-----------------+---------------
Принципиальная схема записи и нумерации нуклеотидов приведена на Рис.4.1. Отсчет нуклеотидов в молекуле ДНК на- чинается с первого смыслового кодона, так что нуклеотид под номером +1 соответствует первому нуклеотиду в молекуле кДНК.
Вверх по течению (или справа налево от 3' к 5'-концу) от первого кодона нуклеотиды записывают со знаком "-", вниз по течению (от 5 'к 3') - со знаком "+". Для многих генов отсутствие точных данных о положении инициирующего сайта и наличие нескольких мест инициации транскрипции существенно затрудняют нумерацию нуклеотидов. Нуклеотиды экзонов обозна- чают заглавными буквами, интронов - прописными.
В Табл.4.2. даны примеры обозначения различных мутаций с использованием как аминокислотной, так и нуклеотидной ну- мерации. Нуклеотидная система записи особенно важна для обозначения делеций, инсерций, сплайсинговых мутаций и поли- морфизмов, не связанных с заменами аминокислот или происхо- дящими в нетранслируемых частях гена. В случае делеции или инсерции одного или двух нуклеотидов приводится их буквенное обозначение. Например, 441delA, 485insTA. При делеции или инсерции трех и более нуклеотидов указывается только их число. Так, 852del22 означает делецию 22 нуклеотидов, начи- ная с 852-го нуклеотида, а 3320ins7 обозначает вставку 7 пар оснований после нуклеотида 3320. В случае больших вставок или делеций их размеры указыаются в килобазах, например
2115ins13kb, или обозначаются соответствующие инсертирован- ные/ делетированные структурные элементы генома. Так,
2115insAlu означает инсерцию Alu-повтора после нуклеотида
2115. При обозначении сплайсинговых мутаций записывают номер крайнего нуклеотида в ближайшем к мутации экзоне, число нук- леотидов (со знаком "+" в случае 3' конца экзона и со знаком
"-" в случае 5' конца) и характер нуклеотидной замены.
(Рис.4.1, Таб.4.2). Например, 711+5G-T обозначает замену G на Т в 5-м основании интрона, следующего за экзоном, закан- чивающимся 711 нуклеотидом.
Раздел 4.4. Идентификация структурных мутаций, изоляция му- тантных ДНК.
Идентификация мутантных аллелей, то есть обнаружение нарушений в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, является самым прямым методом молекулярной диагностики наследственных заболеваний. Большие перестройки - делеции, дупликации, инверсии, транслокации - размером более 1 Мb, затрагивающие целые гены или даже несколько генов, могут быть обнаружены на цитологических препаратах с использовани- ем техники высокого разрешения хромосомного анализа (анализ дифференциально окрашенных прометафазных хромосом). Еще боль- шая разрешающая способность (до 50 кb) может быть достигнута при работе на специальным образом приготовленных (растяну- тых) интерфазных хромосомах с использованием техники гибри- дизации in situ (FISH - Глава II).
Мутации, изменяющие длину рестрикционных фрагментов, могут быть выявлены путем блот-гибридизации рестрицированной геномной ДНК с соответствующими ДНК-зондами на стадиях гене- тического анализа, предшествующих молекулярному клонированию гена. К числу таких мутаций относятся достаточно протяжен- ные, но не идентифицируемые цитогенетически, внутригенные делеции, инсерции и дупликации, а также точечные мутации, локализованные в сайтах рестрикции. Непременным условием ре- ализации метода блот-гибридизации для поиска подобных мута- ций является наличие ДНК-зонда, являющегося либо частью ге- на, либо тесно сцепленной с этим геном клонированной
ДНК-последовательностью. При поиске таких мутаций геномную
ДНК от здорового донора и больного обрабатывают часто щепя- щими рестриктазами, подвергают электрофорезу, блот-гибриди- зации с меченым ДНК-зондом по стандартной схеме (Глава I) и проводят сравнительный анализ расположения бэндов на ради- оавтографе. Особенно информативными обычно оказываются рест- риктазы Msp1 и Taq1, которые узнают сайты CGGG и TGGA, соот- ветственно. Благодаря наличию СpG последовательностей эти сайты особенно часто подвергаются спонтанному мутированию
(см.раздел 4.5). Наличие протяженных делеций, либо точечных мутаций в сайтах рестрикции приводит к изменениям размеров рестрикционных фрагментов. Целенаправленный поиск других то- чечных мутаций (не затрагивающих сайты рестрикции) и неболь- ших структурных аномалий возможен только для клонированных генов с известной нуклеотидной последовательностью смысловых участков ДНК. Методы идентификации подобных мутаций основа- ны, главным образом, на использовании полимеразной цепной реакции в её различных модификациях (см.Главу I, а также разделы 4.5 и 4.6).
Для анализа мутантных аллелей, прежде всего, необходимо иметь изолированные последовательности мутантного гена, ко- торые могут быть получены либо путем клонирования или ампли- фикации мутантной кДНК, либо за счет специфической амплифи- кации отдельных экзонов, их частей и регуляторных областей гена с использованием в качестве матрицы геномной ДНК паци- ентов (Рис. 4.2). В первом случае отбирают клонированные к-ДНК-последовательности мутантного гена, проводя скрининг кДНК-овых библиотек, сконструированных из специфических тка- ней или культур клеток больного. При этом в качестве зондов используют кДНК-овые последовательности нормального гена.
Другим источником кодирующих последовательностей мутантного гена может служить мРНК, изолированная из экспрессирующих тканей или клеток больного. Мутантную кДНК получают путем специфической амплификации перекрывающихся последователь- ностей кодирующих областей гена, используя в качестве матри- цы тотальную кДНК, полученную при обратной транскрипции изо- лированной мРНК. Преимуществом этого подхода является то, что праймеры для амплификации выбирают из экзонных областей, нуклеотидные последовательности которых, как правило, стано- вятся известны вскоре после идентификации и клонирования ге- на. В ряде случаев изоляция мутантной мРНК затруднена в свя- зи с недоступностью образцов тканей или органов, в которых происходит экспрессия нужного гена (мозг, печень и др.). Од- нако, обнаружение следовых количеств, так называемой, неза- конной или эктопической мРНК во многих клетках и тканях, в том числе в клетках крови, позволяет преодалевать и эти трудности (Kaplan et al., 1992). Успех подобной процедуры получения мутантной кДНК связан, в первую очередь, с разра- боткой эффективных методов выделения и обратной транскрипции мРНК с сохранением всех типов кДНК, включая те, для которых соответствующие мРНК присутствуют в ничтожных концентрациях
(например, мРНК дистрофина при мышечной дистрофии Дюшенна
(см.Главу X). Единственным принципиальным ограничением мето- дов детекции мутаций в кДНК-овых последовательностях явля- ются невозможность выявления мутаций в регуляторных и инт- ронных частях гена. Подобные мутации могут быть выявлены только при анализе геномной ДНК пациента.
Получение геномной мутантной ДНК обычно не представляет сложностей, так как она может быть изолирована из любых кле- ток или тканей больного независимо от характера экспрессии исследуемого гена. Однако, амплификация целых экзонов воз- можна только при знании нуклеотидных последовательностей фланкирующих интронных областей, из которых и производят подбор специфических олигопраймеров. Секвенирование интронов представляет собой достаточно трудоемкую задачу, решенную далеко не для всех клонированных генов. Таким образом, к ог- раничениям этого подхода следует отнести необходимость достаточно полной информации о структуре гена и о его пер- вичной нуклеотидной последовательности. Кроме того, объектом тестирования могут быть лишь сравнительно небольшие области гена, отсюда для получения более полной информации необходи- ма амплификация многих экзонов.
Стратегия идентификации мутаций может быть различной и, в конечном счете, определяется тем, имеем ли мы дело с ранее неизвестными мутациями, либо целью анализа является скрини- рование уже известных мутаций. В первом случае обектом исследования чаще всего служат клонированные или амплифици- рованные кДНК-овые последовательности, тогда как при молеку- лярной диагностике известных мутаций, как правило, анализи- руют амплифицированные фрагменты геномной ДНК.
Раздел 4.5. Первичная идентификация точечных мутаций.
Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем прямого секвенирования мутантной кДНК или отдельных экзонов и часто первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена осу- ществляют именно таким образом. Сам метод секвенирования уже был рассматрен ранее ( см.Главу I,раздел 1.6). Для некоторых генов, имеющих небольшие размеры, метод прямого секвенирова- ния с успехом применяется как основной метод сканирования мутаций. Так, в частности, особенно удобным оказалось его применение для детекции мутаций в сравнительно небольших по размеру генах, таких, например, как ген фактора IX свертыва- ния крови (гемофилия В). Использование эктопической мРНК для получения амплифицированных кДНК-овых фрагментов открывает особенно широкие возможности для применения метода прямого секвенирования.
Разработаные в последние годы модификации методов ПЦР значительно облегчили секвенирование амплифицированных фраг- ментов и повысили его эффективность. Так, в частности, пред- ложен вариант ассиметричной ПЦР, когда при амплификации кон- центрация одного из олигопраймеров в несколько десятков раз превосходит концентрацию другого праймера, в результате чего синтезируется преимущественно только одна, нужная для секве- нирования цепочка ДНК. Для этой же цели (получения одноцепо- чечной ДНК) предложено использование магнитных частиц с фиксированным на их поверхности стрептавидином. При этом один из праймеров для проведения ПЦР метится биотином. Затем к продуктам амплификации добавляют магнитные частицы с при- шитым стрептавидином. Благодаря прочному связыванию биотин - стрептовидин, меченая биотином последовательность ДНК фикси- руется на магнитных частицах. С помощью щелочного лизиса с частиц удаляют вторую немеченую комплементарную последова- тельность ДНК, которую и используют для секвенирования. Еще в одном варианте амплификацию проводят в присутствии прайме- ров, несущих сайт узнавания для фермента Т7 - РНК полимера- зы. После амплификации в системе in vitro проводят транскрипцию амплификата с помощью Т7-РНК полимеразы и обра- зовавшуюся одноцепочечную РНК используют для секвенирования
- метод GAWTS (genome amplification with transcript sequences).
Однако, в общем случае секвенирование полноразмерной кДНК или всех экзонов для генотипирования мутаций у отдель- ных пациентов достаточно трудоемко, дорого и требует много времени. Поэтому на практике чаще проводят предварительный отбор более простыми методами амплифицированных, а иногда клонированных фрагментов ДНК, предположительно содержащих мутации, а затем секвенируют только эти участки ДНК. Методы поиска фрагментов ДНК, предположительно содержащих мутации, основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных последовательностей по целому ряду физических и химических характеристик, которые в значительной степени варьируют в зависимости от типа мутационного повреждения. Следует под- черкнуть, что независимо от метода детекции мутации и прак- тически независимо от её природы (замены нуклеотидов, деле- ции, дупликации и пр.) точные молекулярные характеристики каждой мутации могут быть получены только путем прямого сек- венирования. При наличии в амплифицированном фрагменте из- вестных сайтов рестрикции положение мутации может быть пред- варительно уточнено. Для этого продукты амплификации разре- зают соответствующей эндонуклеазой и исследуют более корот- кие фрагменты.
Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие дли- ну амплифицированных фрагментов, так как подобные нарушения легко выявляются при электрофоретическом анализе. Так, про- тяженные делеции, захватывающие целые экзоны, могут быть вы- явлены по изменению длины рестрикционных фрагментов, гибри- дизующихся со специфическими ДНК-зондами. Более простая и эффективная методика выявления таких мутаций в генах, сцеп- ленных с полом, основана на одновременной амплификации раз- личных экзонов, наиболее часто вовлекаемых в подобные пе- рестройки, так называемый мультиплексный вариант ПЦР. Разни- ца в размерах и числе амплифицированных фрагментов позволяет легко идентифицировать такие мутации на электрофорезе
(Рис.4.2). Особенно широко этот метод используется для иден- тификации делеций в гене дистрофина, на долю которых прихо- дится около 60% всех мутаций, приводящих к миодистрофии Дю- шенна (см.Главу X). При отсутствии делеций все амплифициро- ванные фрагменты после электрофоретического разделения и ок- рашивания можно наблюдать в виде отдельных полос. Если в исследуемой ДНК какие-то из экзонов делетированы, будут отсутствовать и соответствующие им полосы на электрофорег- рамме (Рис.4. 2). Выбирая специфические участки гена для ам- плификации, можно оценить размер делеции с точностью до от- дельных экзонов, а также определить ее внутригенную локали- зацию.
Метод этот, однако, не обнаруживает подобные делеции, находящиеся в гетерозиготном состоянии или локализованные в аутосомных генах, так как нормальная гомологичная последова- тельность геномной ДНК может служить матрицей для амплифика- ции любых фрагментов. Данный подход применим к анализу деле- ций в аутосомных генах только в тех случаях, когда возможно дополнить ПЦР количественной оценкой результатов амплифика- ции - так называемая количественная ПЦР. Оригинальный метод идентификации подобных делеций у гетерозигот основан на использовании в качестве матричной ДНК для ПЦР кДНК, полу- ченной путем обратной транскрипции из эктопической мРНК или из мРНК, изолированной из экспрессирующих данный ген тканей или культур клеток пациента. В отличие от нормального гомо- лога, в мутантной молекуле кДНК граничащие с делецией экзоны сближены. Если в качестве олигопраймеров для ПЦР будут выб- раны последовательности из этих областей гена, только му- тантная кДНК будет служить матрицей для амплификации неболь- шого участка между праймерами из фланкирующих делецию экзо- нов. В нормальной последовательности кДНК этот участок может быть слишком велик, для того чтобы прошла амплификация.
Практически, для обнаружения гетерозигот по протяженным внутригенным делециям проводят мультиплексную ПЦР с исполь- зованием системы олигопраймеров, обеспечивающих амплификацию фрагментов, полностью перекрывающих всю молекулу кДНК. Нали- чие делеции регистрируют по появлению продуктов амплификации необычного размера.
Небольшие делеции и вставки нуклеотидов не приводят к отсутствию амплифицированных фрагментов ДНК, но изменяют их размеры. Эти изменения могут быть зарегистрированы при электрофорезе продуктов амплификации в полиакриламидном или агарозном гелях (Рис.4.3). Именно этот метод используется для детекции наиболее часто встречающейся мутации в гене му- ковисцидоза - делеции трех нуклеотидов ^F508. После выявле- ния различий между нормальной и мутантной ДНК по длине рест- рикционных или амплифицированых фрагментов гена необходимо провести секвенирование необычного фрагмента, с целью опре- деления изменений в первичной структуре мутантной ДНК после- довательности по сравнению с нормальной.
При мутациях гена, представляющих собой замену одного или нескольких нуклеотидов, длины амплифицированных фрагмен- тов остаются постоянными, однако, некоторые физико-хими- ческие свойства мутантных молекул ДНК меняются. Так, напри- мер, при гибридизации однонитевых ДНК, комплементарных нор- мальной и мутантной нитям ДНК, возникают структурные наруше- ния в месте негомологичного спаривания. С учетом этих осо- бенностей разработаны различные варианты поиска мутантных фрагментов ДНК и идентификации в них точечных мутаций. Веду- щими из этих методов являются: метод анализа конформационно- го полиморфизма однонитевой ДНК - SSCP, денатурирующий гра- диентный гель-электрофорез - DGGE, метод химического расщеп- ления некомплементарных сайтов (CMC), метод гетеродуплексно- го анализа (HA) и, наконец, собственно метод секвенирования
Основные характеристики этих методов приведены в Табл.4.3
Таблица 4.3. Преимущества и недостатки основных методов пер- вичной идентификации мутаций.
-------T---------T--------T------------T----------------¬
¦метод ¦ размер ¦ %% ¦ точность ¦ сканирование ¦
¦ ¦фрагмента¦детекции¦картирования+---------T------+
¦ ¦ (п.о.) ¦мутаций ¦ мутации ¦ экзонов ¦ кДНК ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------+---------+--------+------------+---------+------+
¦SSCP ¦ 250 ¦ 80% ¦ нет ¦ +++ ¦ + ¦
¦DGGE ¦ 600 ¦ 95% ¦ нет ¦ ++ ¦ ++ ¦
¦СМС ¦ 1700 ¦>95% ¦ да ¦ + ¦ +++ ¦
¦PCR DS¦ 500 ¦>99% ¦ да ¦ ++ ¦ ++ ¦
¦НА ¦ 300 ¦ 80% ¦ нет ¦ ++ ¦ + ¦
L------+---------+--------+------------+---------+-------
"+" - применимость метода для сканирования геномной ДНК и кДНК
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) - метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК, пред- ложенный (Оrita et al.1989, Сlavac, Dean, 1993) основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности одно- нитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся вследствие нуклеотидных замен по пространственной организа- ции молекул (Рис 4.4). Скручивание или конформация небольших однонитевых ДНК существенно зависит от их нуклеотидной последовательности, так что замена даже одного основания в молекулах одинакового размера приводит к изменению их прост- ранственной структуры. Метод включает амплификацию специфи- ческих сегментов ДНК размером от 50 до 300 пар оснований, обычно в присутствии меченых трифосфатов, денатурацию обра- зовавшихся продуктов ПЦР и нативный высокоразрешающий элек- рофорез в полиакриламидном геле. Иногда амплификацию прово- дят без использования метки, но тогда для лучшего разделения
ДНК и однозначной идентификации бэндов на электрофореграмме используют специальные гели - Hydrolink либо MDE (AT
Biochem,USA), а также более чувствительные по сравнению с этидиумом бромидом методы окрашивания, такие как окраска се- ребром. На процесс конформации оказывают влияние различные внешние факторы - температура, концентрация акриламида и глицерина в геле, ионная сила буферных растворов
(Сlavac,Dean,1993). Оптимальный подбор этих параметров поз- воляет эффективно разделять амплифицированные фрагменты ДНК, различающиеся даже всего на один нуклеотид. Конформационный метод выявления точечных мутаций быстро получил широкое распространение благодаря своей простоте и возможности обна- руживать любые типы замен. Эффективность детекции мутаций при размерах амплифицируемого фрагмента менее 200 п.о. составляет 70-95%, но при длине фрагмента, превышающей 400 п.о., вероятность обнаружения мутаций уменьшается до 50%.
DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) - ме- тод денатурирующего градиентного гель-электрофореза, основан на зависимости свойств плавления (или денатурации) небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последователь- ности, а точнее от соотношения A-T и G-C пар в исследуемых фрагментах (Майерс и др.,1990; Fodde, Losekoot, 1994). Объ- ясняется это тем, что G-C связь более прочная по сравнению со связью между нуклеотидами A и T. Подобные различия в ди- намике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвиж- ности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях ( Рис.4.5). Гра- диент денатурации достигается разницей температур, различной концентрации мочевины или формальдегида в гелях. При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК, отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатуриру- ют по -разному . Разработан компьютерный алгоритм, позволяю- щий предсказывать характер плавления в зависимости от нукле- отидной последовательности (Lerman, Silverstein, 1987). При электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денату- рирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквива- лентной температуре плавления - tm, то есть такой температу- ре, при которой каждая пара оснований с 50%-ой вероятностью может соединиться или разойтись. После начала плавления продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедля- ется вследствие сложной пространственной конфигурации моле- кул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Таким способом удается идентифицировать лишь около
50% однонуклеотидных замен в фрагментах ДНК длиной от 50 до нескольких сотен нуклеотидов. Связано это с тем, что при прохождении ДНК через гель может начаться частичная денату- рация концов молекул еще до достижения оптимальной области плавления. Поэтому мутации, локализованные вблизи концов ам- плифицированных участков ДНК, оказывают меньшее влияние на процесс плавления и поэтому могут не выявляться. Эффектив- ность обнаружения мутаций с помощью градиентного денатуриру- ющего электрофореза может быть существенно повышена за счет присоединения к концам амплифицированной геномной ДНК синте- тических фрагментов GC-нуклеотидов, длиной в несколько десятков пар оснований. Такие монотонные тугоплавкие концы выполняют роль своеобразных зажимов и резко увеличивают шансы обнаружения для всех точечных мутаций, независимо от их локализации внутри исследуемого фрагмента ДНК. Эта моди- фикация делает метод очень чувствительным (см.Таб.4.2). В отличии от SSCP он пригоден для более крупных амплифициро- ванных фрагментов ДНК. При исследовании фрагментов до 600 п.о. эффективность выявления мутаций этим методом достигает
95%. Чаще всего DGGE -метод применяется для скрининга мута- ций в амплифицированных экзонах, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК. Этот метод может быть с успехом применен также для анализа индуцированных мутаций, так как позволяет улавливать точечные мутации, возникшие даже в од- ной из 100 обработанных мутагеном клеток. К недостаткам ме- тода следует отнести техническую сложность получения равно- мерного градиента денатурирующего агента в полиакриламидном геле, а также высокую стоимость искусственно синтезированных
GC-концов.
HA (Неteroduplex analysis) - гетеродуплексный анализ поз- воляет идентифицировать мутации, находящиеся в компаунде или в гетерозиготном состоянии. Следует заметить, что у подавля- ющего большинства пациентов с генными болезнями, наследуемы- ми по аутосомно-рецессивному типу, мутации в гомологичных хромосомах находятся в компаунде, то есть в каждом из гомо- логичных генов имеются функционально значимые нарушения, но их молекулярная природа и внутригенная локализация различны.
Исключение составляют лишь мажорные мутации, частота которых в популяции достигает десятков процентов. Примерами таких мутаций являются ^F508 в гене муковисцидоза или R408W мута- ция в гене фенилкетонурии. Принцип HA-метода заключается в том, что при амплификации относительно небольших фрагментов генов гетерозигот или гомозиготных компаундов мутация может быть локализована лишь в одной из гомологичных нитей матрич- ной ДНК. Поэтому в амплификационной смеси наряду с двумя ти- пами гомодуплексов образуются гетеродуплексы между нормаль- ной и мутантной цепочками ДНК. Такие гетеродуплексные моле- кулы ДНК имеют иную электрофоретичеcкую подвижность по срав- нению с гомодуплексами (не отличающимися между собой по под- вижности) за счет конформационных особенностей в местах несовпадения нуклеотидов (mismatch) (Рис.4.6). Эти различия могут быть обнаружены при электрофорезе в обычном полиакри- ламидном геле. Значительно более эффективное разделение гомо- и гетеродуплексов может быть достигнуто при использовании новых вариантов гелей - Hydrolink либо MDE. Вероятность идентификации точечных мутаций этим способом на фрагментах
ДНК менее 300 п.о. достигает 80-90%. Детекция мутаций осу- ществляется как изотопным, так и неизотопными методами
(Grompe, 1993).
CMC (Chemical Mismatch Cleavage) - метод химического расщепления некомплементарных сайтов, основан на способности некоторых химических агентов специфически разрывать нить ДНК в месте локализации неспаренного основания (Рис.4.7). Так, цитозин чувствителен к действию гидроксиламина, а тимин - к действию тетроксида осмия. Некоторые модификации метода используют чувствительность тимина и гуанина к карбодиимиду.
Последующая обработка пиперидином приводит к полному разрыву молекулы ДНК в модифицированном сайте. Выявление мутаций осуществляют с помощью меченых ДНК-зондов, соответствующих, как правило, нормальным вариантам последовательности ДНК.
Такими зондами могут быть синтезированные олигонуклеотиды, клонированные последовательности ДНК или амплифицированные фрагменты (Cotton, 1990; Cotton, Malcolm, 1991).
При проведении исследования эталонную меченую ДНК сме- шивают с избытком тестируемой ДНК (или РНК). Тестируемыми образцами ДНК могут служить клонированные ДНК, обработанные соответствующими эндонуклеазами, либо амплифицированные фрагменты. Смесь нагревают до полной денатурации двухнитевых молекул и затем охлаждают, чтобы создать условия для образо- вания дуплексов. При наличии мутаций в тестируемых образцах
ДНК в гетеродуплексах, возникших в результате гибридизации между однонитевыми молекулами эталонной и тестируемой ДНК, образуются места негомологичного спаривания. После обработки соответствующими химическими агентами идентификация и лока- лизация мутантных сайтов в исследуемых участках ДНК прово- дится путем электрофореза и авторадиографии. Появление уко- роченных фрагментов ДНК на электрофореграмме (а точнее нео- бычных бэндов в нижней части геля) свидетельствует о наличии мутантного сайта, а определение размера укороченных фрагмен- тов однозначно определяет локализацию этого сайта в исходной тестируемой молекуле ДНК. Современные модификации метода
CMC позволяют идентифицировать до 95-100% мутаций
(Grompe,1993). Большими преимуществами этого метода являются:
(1) возможность исследовать протяженные участки ДНК - до 2 кб, (2) способность одновременно выявить и локализовать несколько мутаций в одном фрагменте ДНК и (3) возможность одновременно использовать несколько ДНК-зондов для поиска мутаций - мультиплексный вариант методики. К числу недостат- ков можно отнести высокую токсичность используемых хими- ческих реактивов. Последняя может быть частично ослаблена использованием карбодиимида для идентификации GT гетеродуп- лексов.
Весьма близким по принципу к CMC- методу является метод расщепления гетеродуплексов РНКазой А. С этой целью созда- ются условия для образования гетеродуплексов между тестируе- мой ДНК и комплементарной ей радиоактивно меченой РНК про- бой. При обработке РНКазой А происходит разрезание молекул
РНК в местах нарушения спаривания оснований. Места точечных мутаций определяются как и в случае СМС, по размерам образо- вавшихся фрагментов после электрофореза и авторадиграфии.
Необходимость использования радиоактивно меченой РНК- пробы и возможность детекции только около 50% точечных мутаций ли- митируют широкое применение метода (Grompe, 1993).
Первичная идентификация мутаций может быть осуществлена путем анализа нарушений не в нуклеотидной последовательности гена, а в аминокислотной последовательности соответствующего полипептидного продукта. Для этого выделяют тотальную мРНК из лейкоцитов крови, проводят обратную транскрипцию, ампли- фицировуют специфические экзоны кДНК (метод RT-PCR), встраи- вают амплифицированную область ДНК в экспрессионную систему и анализируют образовавшийся продукт. Этот метод особенно эффективен при детекции мутаций в протяженных генах, содер- жащих большое число экзонов, таких как ген миопатии Дюшенна или ген нейрофиброматоза 1.
Раздел 4.6. Молекулярное сканирование известных мутаций.
Рассмотренные выше методы обнаружения мутаций предпола- гают обязательное секвенирование содержащих их сегментов ДНК с целью точной идентификации нуклеотидных нарушений, оценки их фенотипического проявления и определения причастности к развитию болезни. Поэтому они редко используются в практи- ческой диагностике и при популяционном скрининге гетерози- гот. После описания мутации появляется возможность ее анали- за более простыми способами, не требующими секвенирования.
Как упоминалось выше, мутации, изменяющие длину амплифициро- ванных фрагментов, могут быть выявлены с помощью нативного электрофореза в полиакриламидном или агарозном гелях.
Из миссенс мутаций наиболее просто диагностируются те замены нуклеотидов, которые приводят к исчезновению или об- разованию сайта узнавания для какой-нибудь из рестриктаз.
Они выявляются по изменению длины амплифицированного фраг- мента ДНК после его обработки соответствующей эндонуклеазой.
Поэтому сразу после идентификации мутации проводится компь- ютерный поиск возможных сайтов рестрикции в месте локализа- ции замены основания. Вероятность такого события довольно велика, так как для каждой из нескольких сотен известных в настоящее время рестрикционных эндонуклеаз сайтом узнавания служит своя специфическая последовательность ДНК, средние размеры которой составляют 5 - 6 нуклеотидов.
Если естественных рестрикционных сайтов в месте мутации найти не удается, то такие сайты могут быть созданы искусственно. В частности, разработана методика создания с помощью ПЦР новых сайтов рестрикции в мутантных аллелях, но не в аллелях дикого типа - метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза ( Ng et al., 1991; Eiken et al.,1991). Для этого амплифицируемый участок ДНК выбирают таким образом, чтобы 3'-конец одного из праймеров непосред- ственно примыкал к мутантному сайту (Рис.4.8). Именно этот праймер неполностью комплементарен матричной ДНК. В нем из- меняют один из нуклеотидов с 3'-конца так, чтобы в сочетании с нуклеотидом мутантного, но не нормального сайта в этом месте образовывался сайт рестрикции для какой-нибудь из эн- донуклеаз. Тогда после рестрикции и электрофореза продуктов амплификации геномной ДНК у индивидуумов, не содержащих дан- ную мутацию, на электрофореграмме будет присутствовать один нерестрицированный фрагмент, у гетерозигот появится два до- полнительных фрагмента, соответствующих по длине рестрициро- ванным сегментам ДНК, и у гомозигот по мутации будут присутствовать только эти два фрагмента.
Концептуально близким к этому варианту является метод получивший название "амплификация рефрактерной мутационной системы"- amplification refractory mutation system - ARMS. В основе метода лежит неспособность Taq1 термофильной полиме- разы к амплификации фрагмента при наличии несоответствия
(mismatch) между матричной ДНК и 3'-концом одного из олигоп- раймеров (Newton et al.,1989; Bottema et al.,1990 ). Суть метода заключается в оновременном проведении двух ПЦР, для каждой из которых одним из праймеров служит аллель-специфи- ческая мутантная или нормальная олигонуклеотидная последова- тельность, соответственно. При этом в качестве второго прай- мера для проведения двух реакций выбирают одну и ту же оли- гонуклеотидную последовательность, так что в обоих случаях могут амплифицироваться участки ДНК одинаковой протяжен- ности.Мутантный сайт в аллель-специфических праймерах распо- ложен не в центре, а ближе к 3'-концу, и чаще всего занимает предпоследнюю позицию. При определенных условиях, важнейшим из которых является концентрация ионов магния в растворе, наличие сайта негомологичного спаривания в 3'-области прай- мера препятствует началу синтеза ДНК. Таким образом, при на- личии мутации в исследуемой матричной ДНК амплифицированные фрагменты образуются только в том случае, если в качестве аллель-специфического праймера выбирается мутантная последо- вательность, тогда как при использовании нормального олиго- нуклеотидного праймера ПЦР блокируется (Рис.4.9.). Метод на- шел широкое применение для детекции мутаций при фенилкетону- рии, бета-талассемии, муковисцидозе, при типировании генов
HLA системы. Однако, сложности в подборе праймеров и в выбо- ре оптимального режима ПЦР ограничивают широкое применение этого метода. Вместе с тем, его несомненным преимуществом является возможность применения полностью автоматического сканирования.
Таким же преимуществом обладают и методы детекции состояния гена, основанные на лигировании синтетических оли- гонуклеотидных зондов- OLA (oligonucleotide ligation assay).
При проведении этих реакций специфические ДНК или РНК после- довательности исследуют путем использования их в качестве матрицы для ковалентного связывания двух пар олигонуклеотид- ных зондов (Landegren,1993). ДНК-зонды для лигирования под- бирают таким образом, чтобы они были полностью комплементар- ны нормальному фрагменту ДНК в области локализации мутации, причем сама нуклеотидная замена должна находиться на стыке двух праймеров. Обычно в один из зондов вводят радиоактивную или флюоресцентную метку, а другой - метят биотином. После гибридизации при строго стандартных условиях синтезированные олигонуклеотидные последовательности сшивают ДНК-лигазами из термофильных микроорганизмов. Такие ферменты работают при высоких температурах и сохраняют свою активность в условиях, необходимых для проведения денатурации молекул ДНК. При на- личии мутации в тестируемой молекуле ДНК на конце одного из зондов образуется сайт некомплементарного спаривания, не- посредственно примыкающий к месту лигирования. Наличие тер- минального неспаренного основания в смежно расположенных последовательностях ДНК-зондов резко снижает скорость лиги- рования и при определенных условиях проведения реакции сшив- ки между зондами в этом случае не происходит. Метод включает несколько последовательных циклов гибридизации, лигирования и денатурации. Начиная со второго цикла, матричной ДНК для гибридизации зондов наряду с тестируемой пробой служат также лигированные последовательности. В дальнейшем проводят электрофоретический анализ меченых однонитевых фрагментов
ДНК. Система успешно апробирована на мутациях глобиновых ге- нов при серповидно-клеточной анемии и на мутации delF508 при муковисцидозе.
Универсальным методом детекции замен оснований является метод аллель-специфических олигонуклеотидов - ASO, который включает амплификацию фрагментов ДНК и последующую дот- или слот-гибридизацию с мечеными аллель-специфическими олигонук- леотидами (Reiss, 1991). Для этого синтезируют два типа оли- гонуклеотидных последовательностей обычно размером 19 пар оснований, в которых мутантный сайт занимает центральное по- ложение. Каждый из этих олигонуклеотидных зондов комплемен- тарен нормальному или мутантному вариантам ДНК, соот- ветственно. Условия гибридизации подбирают таким образом, чтобы дуплексы образовывались только при полной комплемен- тарности гибридных пар. В этих условиях амплифицированные фрагменты ДНК без мутации будут гибридизоваться только с нормальным зондом, ДНК гомозигот по мутации - только с му- тантным и ДНК гетерозигот - с обоими олигонуклеотидами
(Рис.4.10). Для уменьшения перекрестной аллель-специфической гибридизации в реакционную смесь добавляют 30-кратный избы- ток конкурентного немеченого олигонуклеотидного ДНК-зонда.
Разработаны удобные модификации метода ASO с использованием аллель-специфических ДНК-зондов, меченых биотином или пе- роксидазой хрена (Лебедева и др.,1994).
Наиболее быстрым, экономичным и удобным методом скани- рования точечных мутаций является модифицированный вариант
ASO, так называемая гибридизационная система обратного дот-блота (reverse dot-blot hybridisation system) (Saiki et.al.,1989). Метод позволяет одновременно скринировать сра- зу много точечных мутаций и доступен автоматизации
(Chebab, 1993). В этом случае проводят гибридизацию меченых продуктов ПЦР, обычно представляющих собой отдельные экзоны, с фиксированными на нейлоновых фильтрах аллель-специфически- ми олигонуклеотидными зондами (ASO). Предварительную иммоби- лизацию мутантных и нормальных ASO-зондов на мембранах осу- ществляют за счет присоединения гомополимерных T-хвостов с дезоксирибонуклеотид-трансферазой на конце. При этом олиго- нуклеотидные последовательности остаются свободными и могут участвовать в гибридизации с мечеными амплифицированными фрагментами ДНК. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК ра- диоавтографические или цветные пятна на фильтрах становятся заметными только в местах локализации олигонуклеотидов, пол- ностью комплементарных тестируемой геномной ДНК. Реакцию, обычно проводят в присутствии ионов тетра-алкиламмония, уменьшающих зависимость температуры плавления от композиции оснований. Это позволяет использовать одинаковые условия гибридизации для различных олигонуклеотидов, то есть вести поиск сразу нескольких типов мутаций, локализованных в одном и том же экзоне гена. Данный метод положен в основу разра- ботки специальных систем, предназначенных для одновременной детекции наиболее распространенных мутаций в исследуемом ге- не. Система представляет собой ленточный фильтр (стрип) с нанесенными пятнами олигопраймеров, каждый из которых соот- ветствует определенной мутации. Стрип помещают в раствор со смесью тех меченых амплифицированных экзонов, которые могут содержать тестируемые мутантные аллели и создают условия для аллель-специфифческой гибридизации. Таким способом сканируют одновренно 42 мутации, ответственные за серповидноклеточную анеми, 34 мутации при муковисцидозе (Сhebab,1993)
Очень простой метод обнаружения и идентификации описанных ранее мутаций в амплифицированных фрагментах ДНК основан на анализе характера электрофоретического разделения продуктов ПЦР в MDE-гидросвязывающих гелях в присутствии высоких концентраций мочевины. Эти гели способствуют форми- рованию гетеродуплексов в процессе электрофореза, причем расположение дуплексов очень специфично для различных му- тантных аллелей, локализованных в одном и том же амплифици- рованном фрагменте. Это позволяет не только выявлять, но с высокой степенью вероятности идентифицировать известные му- тации. В мультиплексном варианте методики возможен одновре- менный поиск мутаций в нескольких амплифицированных фрагмен- тах. Простота и высокая скорость анализа способствуют разра- ботке на основе разделения в MDE-гелях схем максимальной ав- томатизации процесса поиска и идентификации известных мута- ций у пациентов и гетерозиготных носителей мутаций
Итак, методы выявления мутаций довольно разнообразны и постоянно совершенствуются. В первую очередь, молекулярному анализу подвергают те гены, повреждения которых сопровожда- ются развитием наиболее частых заболеваний. Исследования проводят либо в семьях высокого риска, где уже имеются боль- ные с тем или иным моногенным заболеванием с целью выявления гетерозиготных носителей, либо непосредственно в популяциях, где имеется большая выборка больных и можно предполагать высокую частоту гетерозиготных носителей мутаций. При этом выбор конкретных схем идентификации мутантных аллелей, за- частую, определяется диагностическими возможностями лабора- торий и стоимостью анализов. Особое внимание уделяют поиску тех аллелей, которые встречаются в популяциях с высокой частотой. Именно для таких мутаций разрабатывают более простые и эффективные методы молекулярной диагностики, поз- воляющие тестировать больных и проводить скрининг гетерози- гот среди их родственников или среди определенных групп населения.
Важнейшей характеристикой мутантного аллеля является его корреляция с тяжестью течения заболевания, то есть фе- нотипическое выражение мутации в гомозиготном и в гетерози- готном состоянии, а также в компаунде с другими мутантными аллелями того же гена. Для многих моногенных болезней обна- ружено большое число аллелей, которые по своему клиническо- му проявлению могут быть подразделены на различные группы, от очень мягких, оказывающих незначительный повреждающий эффект, до летальных или полулетальных, обусловливающих смерть пациентов в раннем возрасте. Таким образом, молеку- лярная диагностика мутаций может иметь определяющее значе- ние для прогнозирования развития заболевания и выбора адек- ватной тактики лечения. Подобные скринирующие программы в настоящее время разработаны и успешно осуществляются во многих странах для таких распространенных заболеваний как серповидноклеточная анемия, муковисцидоз (Rene et al.,1994). Реализация этих программ наряду с большой меди- цинской пользой приносит и массу социальных проблем, неко- торые из которых будут рассмотрены ниже.
ВВЕДЕНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНУЮ ДИАГНОСТИКУ И ГЕНОТЕРАПИЮ
НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ.
В.Н.Горбунова, В.С.Баранов
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА I. СТРУКТУРА И МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК.
Раздел 1.1 Общие представления, центральная догма, гене- тический код.
Раздел 1.2 Выделение ДНК, ее синтез и рестрикция.
Раздел 1.3 Блот-гибридизация по Саузерну, гибридизация in situ.
Раздел 1.4 ДНК-зонды, клонирование, векторные системы.
Раздел 1.5 Геномные и к-ДНК-овые библиотеки генов, их скрининг.
Раздел 1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.
Раздел 1.7 Полимеразная цепная реакция.
ГЛАВА II. ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, СТРУКТУРА ГЕНОВ.
Раздел 2.1 Определение генома и его основных элементов.
Раздел 2.2 Повторяющиеся последовательности ДНК.
Раздел 2.3 Мультигенные семейства, псевдогены, онкоге- ны.
Раздел 2.4 Современное определение понятия "ген", транскрипция, регуляторные элементы генов.
Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест- рикции, ПДРФ-анализ.
Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные ДНК.
Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факультатив- ные элементы генома.
Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные сайты.
ГЛАВА III. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ, ПОЗИЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ.
Раздел 3.1 Классификация генетических карт, оценка сцепления.
Раздел 3.2 Соматическая гибридизация, цитогенетический анализ, картирование анонимных последова- тельностей ДНК.
Раздел 3.3 Генетические индексные маркеры.
Раздел 3.4 Хромосом-срецифические библиотеки генов, пульсирующий гель-электрофорез.
Раздел 3.5 Позиционное клонирование, прогулка и прыжки по хромосоме, идентификация и изоляция ге- нов.
Раздел 3.6 Каталог генов и генных болезней МакКьюсика.
Международная программа "Геном человека".
ГЛАВА IY. ТИПЫ И НОМЕНКЛАТУРА МУТАЦИЙ. МЕТОДЫ ДНК-
ДИАГНОСТИКИ.
Раздел 4.1 Мутантные аллели, характеристика и типы му- таций.
Раздел 4.2 Генетическая гетерогенность наследственных заболеваний.
Раздел 4.3 Номенклатура мутаций.
Раздел 4.4 Идентификация структурных мутаций, изоляция мутантных ДНК.
Раздел 4.5 Первичная идентификация точечных мутаций.
Раздел 4.6 Молекулярное сканирование известных мутаций.
ГЛАВА Y. ПОПУЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ МУТАЦИЙ. ЭНДОГЕННЫЕ
МЕХАНИЗМЫ СПОНТАННОГО МУТАГЕНЕЗА.
Раздел 5.1 Популяционный анализ мутаций, полиморфизм, неравновесность по сцеплению.
Раздел 5.2 Частоты спонтанного мутагенеза.
Раздел 5.3 Эндогенные механизмы возникновения мутаций.
Раздел 5.4 Механизмы поддержания и распространения му- таций в популяциях.
ГЛАВА YI. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ.
Раздел 6.1 Дифференциальная активность генов, выбор адекватных биологических моделей.
Раздел 6.2 Анализ регуляторных элементов гена, изоляция и исследование мРНК, искусственные транскрипционные системы.
Раздел 6.3 Анализ трансляции, ДНК-экспрессионные систе- мы.
ГЛАВА VII. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРЕНАТАЛЬНОЙ
ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ.
Раздел 7.1 Прямые и косвенные методы молекулярной диаг- ностики.
Раздел 7.2 ДНК-диагностика при различных типах наследо- вания.
Раздел 7.3 Группы риска, поиск гетерозиготных носите- лей мутаций.
Раздел 7.4 Особенности применения молекулярных методов в пренатальной диагностике моногенных болез- ней.
Раздел 7.5 Доимплантационная диагностика, общая схема пренатальной диагностики, точность прогнози- рования.
ГЛАВА YIII. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ
ЧЕЛОВЕКА.
Раздел 8.1 Генетические линии животных.
Раздел 8.2 Трансгенные животные.
Раздел 8.3 Экспериментальное моделирование.
Раздел 8.4 Конструирование модельных генетических ли- ний животных.
Раздел 8.5 Методы направленного переноса генов.
ГЛАВА IX. ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ.
Раздел 9.1 Определение, историческая справка, программы генной терапии.
Раздел 9.2 Типы генотерапевтических вмешательств, выбор клеток-мишеней.
Раздел 9.3 Методы генетической трансфекции в генной те- рапии.
Раздел 9.4 Конструирование векторных систем и совер- шенствование методов трансформации клеток че- ловека.
9.4.1 Основные векторные системы.
9.4.2 Методы физического переноса чужеродной ДНК в клетки эукариот.
9.4.3 Липосомный метод трансфекции.
9.4.4 Рекомбинантные вирусы.
9.4.5 Перспективы создания "идеальных" векторных систем.
Раздел 9.5 Генотерапия моногенных наследственных заболе- ваний.
Раздел 9.6 Генотерапия ненаследственных заболеваний: опухоли, инфекции.
Раздел 9.7 Некоторые этические и социальные проблемы ген- ной терапии.
ГЛАВА X. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ
МОНОГЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.
Раздел 10.1 Хромосомная локализация и принципы класси- фикации генов наследственных болезней.
Раздел 10.2 Метаболические дефекты лизосомных фермен- тов. Болезни накопления.
Раздел 10.3 Болезни экспансии, вызванные "динамически- ми" мутациями.
Раздел 10.4 Моногенные наследственные болезни, диаг- ностируемые молекулярными методами в России.
10.4.1 Муковисцидоз.
10.4.2 Миодистрофия Дюшенна.
10.4.3 Гемофилия А.
10.4.4 Гемофилия B.
10.4.5 Болезнь Виллебранда.
10.4.6 Фенилкетонурия.
10.4.7 Синдром Леш-Нихана.
10.4.8 Болезнь Вильсона-Коновалова.
10.4.9 Адрено-генитальный синдром.
10.4.10 Спинальная мышечная атрофия.
10.4.11 Атаксия Фридрейха.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ГЛАВА Y.
ПОПУЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ МУТАЦИЙ. МЕХАНИЗМЫ СПОНТАННОГО
МУТАГЕНЕЗА.
Раздел 5.1 Полиморфизм, неравновесность по сцеплению.
Молекулярная идентификация мутантных аллелей и разра- ботка эффективных методов их диагностики у больных и у гете- розиготных носителей являются той экспериментальной базой, которая позволяет исследовать распространенность мутаций в различных этнических группах и популяциях. Одновременно воз- можен анализ сцепления мутантных аллелей с другими генети- ческими маркерами и оценка на этой основе предполагаемых ме- ханизмов возникновения и поддержания в популяциях наблюдае- мого уровня изменчивости. Но прежде чем перейти к описанию основных целей и методов популяционного анализа мутаций оп- ределим более точно два основных понятия, часто используемых при проведении подобных исследованиях - это понятия полимор- физма и неравновесности по сцеплению.
Генетическая изменчивость локуса в определенной попу- ляции измеряется уровнем полиморфизма, и количественным вы- ражением этой меры служат частоты аллелей. В однолокусной двухаллельной системе частоты двух вариантов аллелей - А1 и
А2, обозначаются буквами p и q, соответвственно, и (p+q=1).
Когда мы говорим, что в популяции существует полиморфизм по мутации, это значит, что ее частота выше определенного выб- ранного в соответствии с какими-то причинами условного уров- ня, чаще всего выше 5%. Высокополиморфными считаются локусы с близкими значениями частот аллелей. В больших популяциях со случайным характером скрещивания, то есть в панмикти- ческих популяциях, действует закон Харди-Вайнберга, согласно которому частоты гомозиготных особей в популяции равны p!2 и q!2, соответстенно, а доля гетерозигот равна 2pq. Таким об- разом, в двухаллельной модели частота гетерозигот в популя- ции по полиморфным локусам составляет от 10% и более, а по высокополиморфным локусам может достигать 50%. Если число аллелей в локусе больше двух, общая частота гетерозигот в популяции равна 1 - (p1!2 + p2!2 + ... + pn!2), где pk - частота аллеля Ak, k = 1, 2, ... n и p1 + p2 +... + pn = 1.
При этом доля гетерозигот в популяции возрастает с увеличе- нием числа аллелей и достигает максимального предела в каж- дой группе из n аллелей при равенстве их частот. Таким обра- зом, при увеличении числа аллелей, встречающихся с равными вероятностями, частота гетерозигот в популяции будет стре- миться к единице, то есть подовляющее число особей в популя- ции будут гетерозиготными по данному локусу. Такая ситуация характерна для высокополиморфных микросателитных повторов, в частности STR, что и делает их наряду с другими преимущест- вами наиболее удобными генетическими маркерами.
Как мы уже упоминали, частыми моногенными наследствен- ными заболеваниями считаются такие, при которых один больной ребенок встречается среди 2000 - 10000 новорожденных, то есть q!2 колеблется в пределах 1 /2000 - 1/10000. Соот- ветственно, частота мутаций - q, в этих генах составляет от
0.5% до 2.5% и доля гетерозиготных носителей - 2pq, достига- ет 1% - 5%. Для более редких заболеваний частоты гетерозигот не превышают десятых долей процента. Тем ни менее, если учесть, что общее количество различных моногенных заболева- ний составляет около 5000 нозологий, оказывается, что, в среднем, каждый человек является носителем мутантных аллелей около десяти генов. В общем случае, набор этих генов разли- чен у разных людей, и только в тех семьях, где оба родителя являются носителями мутаций одного и того же гена появляется
25%-ый риск рождения больного ребенка.
До сих пор мы рассматривали изменчивость в одном локусе
- A. Понятие неравновесности по сцеплению определяет отноше- ния между изменчивостью в двух локусах - A и B. Ситуация здесь может быть двоякой. Если изменчивость в этих локусах независима, то аллели двух локусов встречаются в популяции в случайных комбинациях. Однако, если аллели различных локусов в одних комбинациях встречаются чаще, чем в других, то гово- рят, что существует неравновесность по сцеплению. Количест- венно эта связь оценивается с помощью детерминанта неравно- весности по сцеплению - d. Рассмотрим, чему равен детерми- нант неравновесности по сцеплению в двухлокусной двухаллель- ной системе. Пусть Pnm, где n=1,2 и m=1,2, частоты четырех возможных в этом случае типов гамет - A1B1, A2B2, A1B2,
A2B1, а Pn и Rm - частоты аллелей локусов A и B, соот- ветственно. Если сочетания аллелей в гаметах случайны, то теоретически ожидаемые частоты гамет четырех типов равны произведению частот входящих в эти гаметы аллелей, то есть
Pnm=Pn*Rm. В этом случае произведение частот двух типов га- мет (A1B1 и A2B2), находящихся в состоянии "притяжения", равно произведению частот гамет в состоянии "отталкивания"
(A1B2 и A2B1), то есть P11*P22 = P1*P2 *R1*R2 = P12*P21. Од- нако, если сочетания аллелей в гаметах неслучайны, то эти произведения различны. Их разность служит мерой неравно- весности по сцеплению - d. Итак d = ¦P11*P22 - P12*P21¦ При отсутствии неравновесности по сцеплению d = 0. Верхняя гра- ница d = 0.25. Максимальная неравновесность по сцеплению достигается при полном отсутствии двух типов гамет, находя- щихся либо в состоянии "притяжения", либо в состоянии "от- талкивания", при одновременном равенстве частот оставшихся двух типов гамет.
Мутации в различных локусах возникают, как правило, не- зависимо друг от друга и наличие неравновесности по сцепле- нию, по-видимому, отражает тот факт, что мутация в одном из локусов возникла в хромосоме, несущей определенный аллель другого локуса, и далее эта хромосома получила распростране- ние в популяции. Неравновесность по сцеплению является очень важной популяционной характеристикой, позволяющей судить о порядке и примерном времени возникновения различных мутаций, а также оценивать возможные механизмы их поддержания в попу- ляции. Обнаружение сильной неравновесности по сцеплению меж- ду специфическими мутациями гена и определенными аллелями маркерных локусов имеет важное практическое значение. Часто наблюдается неравновесность по сцеплению между мутантными аллелями гена и одновременно несколькими маркерными локуса- ми. В этом случае анализ маркерных гаплотипов, то есть набо- ров аллелей различных локусов, локализованных в одной хро- мосоме, дает возможность с высокой степенью вероятности оце- нивать характер мутационного повреждения и прослеживать его наследование в семьях больного.
Раздел 5.3 Частоты спонтанного мутагенеза.
Считается, что средняя частота спонтанного возникнове- ния мутаций в структурных локусах человека колеблется в пре- делах от 10(-5) до 10(-6) на одну гамету за каждое поколе- ние. Однако, эта величина может значительно варьировать для разных генов, меняясь в пределах от 10(-4) для высокомута- бильных локусов до 10 (-11) в наиболее устойчивых частях ге- нома. Эти различия зависят от многих факторов и, в первую очередь, от характера мутационного повреждения, от механизма возникновения мутации и локализации нарушения. Большое зна- чение также имеет сам ген, протяженность его кодирующих об- ластей и те функции, которые выполняют контролируемые им мо- лекулы в обеспечении жизнедеятельности клеток и всего орга- низиа, в целом. Так например, нарушение работы генов, про- дукция которых необходима на ранних стадиях эмбриогенеза, может приводить к гибели плода. Такие мутации трудны для ди- агностики и в практической медицине мы чаще всего имеем дело только с теми мутациями, которые не проявляют летального эф- фекта на ранних стадиях эмбрионального развития. Тем ни ме- нее, не исключено, что ранние эмбриональные летали составля- ет немалый процент среди мутантных аллелей различных генов и вносят определенный вклад в снижение репродуктивной функции.
Особого внимания заслуживает проблема мутирования в
STR-сайтах и в VNTR- локусах, часто используемых в настоящее время для геномной дактилоскопии и молекулярной диагностики.
Эти участки генома, изменчивость в которых обусловлена раз- личиями в числе тандемных повторов, формально можно отнести к разряду высокомутабильных. Заметим сразу, однако, что пря- мое сопоставление темпов мутирования в кодирующих областях генома и в мини- и микросателлитных последовательностях ДНК, по-видимому, некорректно, так как физическая основа изменчи- вости, наблюдаемой в этих функционально и структурно разли- чающихся локусах совершенно различна. Мутабильность в
STR-сайтах обусловлена нестабильностью числа повторов, при- чем возникающие мутации затрагивают, как правило, лишь весь- ма ограниченное число кластерированных копий, чаще всего 1 или 2. Подобные тандемные повторы редко наблюдаются в смысловых последовательностях ДНК. Исключение составляют лишь мутации экспансии, но и для них характерно (1) сущест- вование большого числа аллелей дикого типа, отличающихся друг от друга небольшим числом копий, и (2) значительные различия по длине повторяющегося участка между нормальными и мутантными вариантами гена. Кроме того, изменчивость в
STR-сайтах в основе своей носит нейтральный характер и пото- му темп мутирования в этих локусах не подвержен жесткому контролю со стороны естественного отбора.
Прямые исследования показали, что в большинстве случаев частота возникновения спонтанных мутаций в микросателлитных
STR -сайтах варьирует в пределах от 0.1% до 0.45% на гамету, что должно учитываться при использовании этих маркеров в практической медицине. Частота мутирования в вариабильных
(C-A)n -повторах, используемых в качестве индексных маркеров в Genethon - картах сцепления составляет 0.05% на гамету.
Показано, что для ряда VNTR-локусов (MSB2) частота мутирова- ния достигает 0.7% на гамету. Для других локусов (М17) обна- ружено достоверное превышение скорости мутагенеза в зароды- шевых клетках по сравнению с соматическими. Для многих достаточно стабильных STR-локусов обнаружены существенные межпопуляционные различия по частоте аллелей, что позволяет использовать эту изменчивость для генетической характеристи- ки отдельных популяций. В то же время другие STR-сайты зна- чительно чаще подвергаются спонтанному мутированию, что при- водит к уравновешиванию паттерна аллелей и делает эти марке- ры малопригодными для популяционных исследований. Имеются данные, что в наиболее вариабильных STR-локусах частота спонтанных мутаций может достигать 5% на гамету за поколение
(Jeffreys et al., 1988).
Раздел 5.3. Эндогенные механизмы возникновения мутаций.
Основную часть мутаций, ведущих к наследственным болез- ням, составляют точечные мутации, делеции и в меньшей степе- ни инсерции и дупликации. При этом, как показывает детальный сравнительный анализ, частота, тип и локализация этих мута- ций отнюдь неслучайны и зависят от многих, пока еще невы- ясненных эндогенных механизмов мутагенеза. В пользу такого вывода свидетельствует уникальный характер спектра мутаций для каждого из многих десятков генов, первичная структура
ДНК и типы мутаций которых уже хорошо изучены. Так, для мно- гих структурных генов доминирующими по спектру и частоте яв- ляются точечные мутации (ген трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза, ген фенилаланингидроксилазы, ген факто- ра IX cвертывания крови, бета-глобиновый ген и мн др.), тог- да как для других - достаточно протяженные структурные пе- рестройки типа делеций, дупликаций и инсерций (гены дистро- фина, фактора VIII свертывания крови, 21-гидроксилазы)
(см.Главу X). К структурным факторам, определяющим эндоген- ные механизмы мутагенеза, можно отнести (1) наличие прямых и обратных повторов и симметричных элементов вблизи места пе- рестройки; (2) высокую концентрация СpG динуклеотидов; (3) наличие внегенных последовательностей ДНК, гомологичных фрагментам структурного гена; (4) мобильные элементы генома.
Естественно, что реализация этих структурных факторов в те или иные типы мутаций возможна лишь в процессе репликации
(1,2) и рекомбинации (3) ДНК хромосом.
Как подробно рассмотрено в серии работ D.N Cooper и
M.Кrawczak (1990, 1991), наличие в первичной структуре ДНК прямых повторов, идентичных повторяющихся последователь- ностей, инвертированных повторов, шпилечных структур, квази- палиндромных последовательностей и симметричных элементов генома (например CTGAAGTC) нередко ведет к образованию пе- тель при репликации ДНК вследствие скользящего нарушения спаривания (slipping mispairing) родительской и дочерней це- пей ДНК. Эти новые структурные элементы ДНК либо уничтожа- ются ферментами системы репарации, что ведет к делециям, ли- бо сохраняются и дублируются, что приводит к дупликациям и инсерциям, при этом возникшие изменения закрепляются при последующих раундах репликации. Авторы приходят к следующим выводам: (1) возникновение подобных мутаций происходит неслучайно, но зависит от особенностей первичной структуры
ДНК в месте перестройки; (2) в основе структурных перестроек
ДНК лежат ошибки репликации; (3) принципиально сходные моде- ли эндогенного мутагенеза характерны как для делеций, так и для инсерций. Считается, что именно механизм скользящего на- рушения спаривания ответственен за мутации экспансии, приво- дящие к быстрому увеличению числа тринуклеотидных повторов и к нарушению работы соответствующих генов, а также за высокую изменчивость, наблюдаемую во многих местах локализации мини- и микросателлтных тандемных повторов.
Недавно показано, что повышенной эндогенной мутаген- ностью обладают вообще все последовательности ДНК, находящи- еся в определенном конформационном состоянии, а именно в состоянии изгиба (bent DNA) (Milot et al.,1992). Известно, что такая конформационная структура ДНК свойственна промо- торным частям генов, местам начала репликации (origins of replication), местам контакта хромосом с ядерным матриксом.
Именно эти участки ДНК являются местами посадки ферментов топоизомераз, вовлеченных в процессы репликации, транскрип- ции, рекобинации, в том числе, как оказалось, и в процесс негомологичной (незаконной -illegitimate) рекомбнации. Уста- новлено, что именно негомологичная рекомбинация может приво- дить не только к внутригенным делециям, дупликациям и другим мутациям на молекулярном уровне, но и является одной из основных причин крупных структурных хромосомных перестроек типа транслокаций, инверсий и других.
Замены или утраты отдельных оснований в геномной ДНК могут возникать в результате нарушения процессов репликации и репарации. Ошибки в ДНК матрице, вызванные действием пов- реждающих внешних агентов, либо спонтанной деградацией осно- ваний закрепляются в последующих циклах репликации. Основные типы спонтанной деградации включают потерю оснований и про- цесс дезаминирования. Особенно чувствительны к дезаминирова- нию цитозиновые остатки. Установлено, что у позвоночных поч- ти половина всех цитозиновых остатков в ДНК метилирована в
5-ом положении. Процесс метилирования особенно часто захва- тывает области повторов 5'CpG 3', расположенные как внутри генов, так и в их промоторных частях. При дезаминировании
5-метилцитозин превращается в тимин. В цикле последующей репликации, возникший в результате дезаминирования мисмэтч
(T-G) может либо коррегироваться в нормальный вариант (С-G), либо приводить к мутациям типа трансцизий (Т-G) или (С-А).
Естественно, что гены, имеющие в своей структуре большой процент CpG оснований, особенно часто подвергаются спонтан- ному мутированию типа трансцизий. В частности, преобладание подобных точечных мутаций известно для генов факторов IX и
VIII свертывания крови, для гена фенилкетонурии и других.
Так, из 76 мутаций гена фактора IX в 21 случае найдены трансцизии CpG - TpG или СрА (Green et al.,1990). Преоблада- ние таких мутаций отмечено и в 22 CpG дуплетах гена фенила- ланингидроксилазы у больных фенилкетонурией (Abadie et al.,1989).
Другим важным фактором эндогенного мутагенеза является наличие тесно сцепленных с генами гомологичных последова- тельностей ДНК (псевдогенов). В мейозе такая ситуация неред- ко приводит к неравной гомологичной рекомбинации и, как следствие этого, к генной конверсии, сопровождающейся струк- турными перестройками типа делеций, дупликаций и т.п. Подоб- ный механизм мутаций, как оказалось, является доминирующим для гена 21-гидроксилазы (Morel, Miller,1991), а также для гена фактора VIII свертывания крови (Lakich et al.,1993).
Важная роль ошибок рекобинации в этиологии структурных поло- мок гена особенно очевидна при анализе гена дистрофина, му- тации которого ведут к миопатии Дюшенна. Известно, что в 60% случаев мутации этого гена представляют собой делеции, зах- ватывающие один или несколько соседних экзонов. Известно также, что подавляющее большинство делеций сосредоточено в двух "горячих" районах этого гигантского по размерам гена
(2,2 Мб), и при этом частота внутригенных рекомбинаций почти в 4 раза больше, чем можно предполагать, исходя из его раз- меров (Oudet et al.,1992). Любопытно отметить, что в одной из этих горячих точек (интрон 7) недавно обнаружен кластер транспозоноподобных повторяющихся последовательностей.
Удельный вес мобильных (транспозонподобных) элементов типа
Alu и Line повторов (см. Главу 2) в возникновении генных му- таций до конца не выяснен. Имеются единичные наблюдения о реальном перемещнии этих элементов по типу конверсии и их интеграции в структурные гены аденозиндезаминазы, аполипоп- ротеина С, факторов VIII и IX свертывания крови, кальмодули- на (Vidaud et al.,1993).
Раздел 5.4 Механизмы поддержания и распространения му- таций в популяциях.
Частоты и характер распределения мутаций в популяциях зависят от многих факторов, главными из которых являются частоты мутагенеза и давление естественного отбора. Значи- тельное влияние на этот процесс оказывают также структурные особенности популяций, такие как размеры, степень географи- ческой и этнической изолированности, величина инбридинга, характер миграции населения.
Для всех мутаций, возникающих за счет повышенного уров- ня спонтанного мутагенеза, характерны следующие особенности
- неслучайный характер внутригенной локализации мутаций, сходство типов нарушений при отсутствии полной молекулярной идентичности между ними. В отличие от спонтанных мутаций, вызыванных эндогенными причинами, для мутаций, индуцирован- ных действием неблагоприятных факторов внешней среды, про- мышленными и сельскохозяйственными вредностями, ионизирующим облучением, химическими агентами и прочим, специфики в типах мутаций и в характере их локализации не наблюдается. В попу- ляциях, находящихся в области действия таких неблагоприятных факторов, будет повышена частота мутаций в различных генах, однако спектр индуцированных мутаций будет достаточно разно- образным.
Рассмотрим теперь влияние отбора на процесс поддержа- ния и распространения мутаций в популяциях. Многие гены мо- ногенных наследственных заболеваний рецессивны, то есть му- тации в них в гетерозиготном состоянии не оказывают вредного влияния на жизнеспособность. Поэтому после возникновения му- тация может распространяться в популяции до определенной концентрации, практически не подвергаясь элиминирующему действию естественного отбора. В дальнейшем частота этой му- тации достигнет равновесного состояния и не будет повышаться за счет выщепления гомозиготных особей, жизнеспособность и репродуктивные качества которых резко снижены. При этом ско- рость элиминации мутации из популяции резко замедляется при снижении ее частоты и, практически, после возникновения му- тация может сохраняться в популяции на протяжении многих десятков и даже сотен поколений. Различные мутации могут случайным образом получить большее распространение в изоли- рованных популяциях или среди групп населения, отличающихся повышенным уровнем инбридинга. В целом, при отсутствии дав- ления отбора по отношению к гетерозиготным особям общая кон- центрация мутантных аллелей в популяции определяется часто- той их спонтанного возникновения, при этом пул мутаций будет состоять из большого количества разнообразных аллелей, каж- дый из которых будет представлен редкими или даже единичными случаями в различных популяциях.
Однако, специфические мутации могут получить значи- тельно более широкое распространение в тех случаях, когда гетерозиготные особи имеют какие-либо селективные преиму- щества. Таким эффектом может обладать сама мутация, но более вероятна возможность неравновесности по сцеплению между этой мутацией и селективными аллелями другого локуса. Гетерозиго- ты могут получить преимущество при изменении условий окружа- ющей среды, в каких -то экстремальных ситуациях или среди определенных групп населения. Так например, мутации, повыша- ющие устойчивость организма к действию инфекционных агентов, могут получить широкое распространение в период массовых эпидемий. Одновременно повысится частота всех аллелей других локусов, находящихся в неравновесности по сцеплению с данной мутацией. Мутантные аллели, обеспечивающие селективное преи- мущество гетерозигот, становятся преобладающими во многих популяциях, не полностью изолированных друг от друга. При этом наибольшая частота таких аллелей будет наблюдатся в ра- йонах, где влияние поддерживающего отбора было максимальным
(например, в эпицентре эпидемии). По мере удаления от этого района концентрация таких мутантных аллелей будет умень- шаться, причем их распределение в разных популяциях будет коррелировать с характером миграции населения. Подобный ха- рактер распределения определенного мутантного аллеля в частично изолированных популяциях принято связывать с так называемым эффектом основателя или родоначальника.
Исследование спектров распределения мутаций в различ- ных популяциях позволяет делать предположения относительно возможного происхождения таких повреждений и тех механизмов, которые лежат в основе их распространения среди населения.
Рассмотрим наиболее вероятные интерпретации различных вариантов распределения аллелей в популяциях. Мутации, представленные у единичных больных или в группе родственных индивидуумов и не имеющие специфической внутригенной локали- зации, по-видимому, являются следствием естественного мута- ционного процесса. Если в каких-то популяциях концентрация мутаций в различных генах повышена, вероятно, они находятся в зоне действия внешних неблагоприятных факторов, индуцирую- щих возникновение нарушений в структуре ДНК. В тех случаях, когда локализация и типы мутаций носят специфический харак- тер можно предполагать наличие особых молекулярных механиз- мов контроля повышенного уровня мутагенеза в определеннных районах генома. Распространение специфических мутаций в изо- лированных популяциях происходит за счет их ограниченного размера и повышенного уровня инбридинга (эффект родоначаль- ника). И, наконец, обнаружение градиентного распределения мутаций, превалирующих в различных, частично изолированных популяциях позволяет предполагать селективное преимущество гетерозиготных носителей мутаций на определенных этапах эво- люционного развития.
Таким образом, сопоставляя спектры распределения одно- типных мутаций у жителей разных континентов, разных стран, у людей, принадлежащих к различным расам и национальностям можно определить степень генетической близости между всеми этими группами и реконструировать их филогенетические отно- шения (Cavalli-Sforza,Piazza,1993). Одним из практических следствий этих исследований является возможность прогнозиро- вать наиболее вероятные мутации в различных генах у пациен- тов разного этнического происхождения, что приводит к суже- нию спектра поиска специфических мутаций. Особый интерес в этом смысле представляют наиболее распространенные мутации
(например delF508 при муковисцидозе; R408W - при фенилкето- нурии и многие другие). Для профилактики наследственных за- болеваний необходима разработка эффективных и простых мето- дов молекулярной диагностики таких мутаций как у больных, так и у гетерозиготных носителей с целью проведения скрини- рующих программ среди населения и выявления максимально воз- можного числа семей с повышенным риском рождения больного ребенка.
ГЛАВА VII.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГ-
НОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.
Раздел 7.1 Прямые и косвенные методы молекулярной диаг- ностики.
Локализация и клонирование кДНК-овых последовательнос- тей генов открывают принципиально новые возможности диагнос- тики наследственных заболеваний, основанные на исследовании мутантных аллелей у пациентов, членов их семей или у предпо- лагаемых гетерозиготных носителей патологических мутаций.
Это в равной мере относится и к пренатальной диагностике, которая может быть проведена с использованием молекулярных методов анализа на самых ранних стадиях развития плода
(см.7.5). Эти же подходы вполне приемлемы для диагностики до появления каких-либо клинических или биохимических симптомов болезни (досимптоматическая диагностика), что позволяет вы- работать и начать рациональную тактику лечения (упреждающая терапия), а также эффективно выявлять гетерозиготных носите- лей в семьях высокого риска, что является важным фактором профилактики наследственных болезней. Решающими преимущест- вами молекулярной диагностики являются её универсальность, возможность использовать для анализа любые ДН-содержащие клетки или ткани, причем анализ может быть произведен на лю- бых стадиях онтогенеза, начиная со стадии зиготы.
Принципиально различают прямую и непрямую ДНК-диагнос- тику мононогенных наследственных болезней. В общем случае, использование прямых методов диагностики возможно лишь для клонированных генов с известной нуклеотидной последователь- ностью полноразмерной кДНК, при этом необходимо предвари- тельное генотипирование мутантных аллелей у родителей. В случае прямой диагностики обьектом молекулярного анализа яв- ляется сам ген, точнее мутации этого гена, идентификация ко- торых и составляет основную задачу исследования. Такой под- ход особенно эффективен при наличии точной информации о при- роде, частоте и локализации наиболее распространенных (доми- нирующих по частоте) мутаций соответствующих генов, а также о наличии в них особенно легко мутирующих "горячих" точек. К таковым относятся мутация delF508 и ряд других мутаций при муковисцидозе, делеционные мутации при миодистрофии Дюшенна, мутация R408W при фенилкетонурии, инверсионная мутация при гемофилии А, протяженная делеция при адрено-генитальном синдроме, экспансии триплетных повторов в случае "динамичес- ких" мутаций при синдроме ломкой X-хромосомы и при ряде дру- гих нейродегенеративных заболеваний (см. Главы IV и X). Ме- тоды, используемые для направленного поиска этих мутаций, подробно рассмотрены в Главе IV. В ряде случаев (муковисци- доз, фенилкетонурия, серповидно-клеточная анемия) эти методы удалось автоматизировать, что позволяет одноверменно тести- ровать сразу несколько (до 30 и более) различных мутаций.
При этом появляется реальная возможность выявлять свыше
95-98% мутантных хромосом, что делает целесообразным и эко- номически оправданным скринирование всей популяции отдельных стран на выявление мутантных особей для последующей органи- зации эффективных профилактических мероприятий, направленных на предупреждение рождения больных детей. Подобные программы по муковисцидозу уже успешно проводятся в ряде стран Запад- ной Европы (Великобритания, Дания, Франция) и Северной Аме- рики.
Главное преимущество прямого метода - это высокая, до- ходящая до 100%, точность диагностики и отсутствие необходи- мости анализа всей семьи на предмет её информативности
(см.ниже). Последнее обстоятельство особенно важно для про- ведения пренатальной диагностики тяжелых, зачастую летальных наследственных болезней (муковисцидоз, миодистрофия Дюшен- на, гемофилия А и др). Такие семьи нередко обращаются за ме- дико-генетической помощью уже после того как больной ребенок умер. Так, по нашим наблюдениям до 80% семей с высоким рис- ком муковисцидоза обращаются по поводу необходимости дородо- вой диагностики уже после смерти больного ребенка (Baranov et al., 1992).
Однако, существует огромное количество наследственных болезней, для которых мутации не описаны либо не найдено ма- жорных мутаций в исследуемых популяциях. И даже во всех тех случаях, когда имеются мажорные мутации, наряду с ними, опи- саны многочисленные редко встречающиеся (вплоть до единичных случаев), так называемые минорные мутации. Кроме того, всег- да сохраняется возможность присутствия у пробанда неизвест- ных мутаций, а клонирование гена больного человека для целей прямого секвенирования, даже ограниченного только смысловой его частью - кДНК, далеко не всегда возможно в силу очевид- ных финансовых и временных ограничений такого подхода. Эти трудности успешно преодолеваются благодаря наличию непрямых
(косвенных) методов молекулярной диагностики.
Этот исторически более ранний подход основан на исполь- зовании сцепленных с геном полиморфных маркеров, с помощью которых проводится идентификации мутантных хромосом (точнее хромосом, несущих мутантный ген) в семьях высокого риска, то есть у родителей больного и его ближайших родственников. В настоящее время косвенные методы молекулярной диагностики принципиально возможны практически для всех моногенных забо- леваний с известной локализацией контролирующего гена, для каждого из которых уже разработана удобная система вне- и внутригенных полиморфных индексных маркеров (см.Главу III).
Более того, косвенные методы молекулярной диагностики пригодны даже для тех болезней, гены которых еще не иденти- фицированы и мутации не известны. Единственным и непременным условием этого является наличие полиморфных сайтов рестрик- ции либо коротких тандемных повторов типа STR, находящихся в непосредственной близости от мутантного гена или, что еще лучше, внутри него (чаще всего в интронах). При помощи этих полморфных сайтов удается маркировать мутантные аллели гена и проследить их передачу потомству (см. Главу 111). Ранние иследования непрямым методом проводились почти исключительно с использованием полиморфных сайтов рестрикции - двухаллель- ной системы, информативная емкость которой не превышает 50%, а реальное число гетерозигот по данному признаку в популя- ции, зачастую, оказывается существенно ниже 0.5. Следова- тельно, в лучшем случае только половина гетерозиготных носи- телей наследственного заболевания, вызванного рецессивной мутацией какого-нибудь гена, может быть доступна непрямой молекулярной диагностике с использованием одного полиморфно- го сайта рестрикции. Повышение информативности в случае
ПДРФ-анализа могло быть достигнуто только путем увеличения числа полиморфных сайтов. Как првило, для диагностики необ- ходим не один, а 3-4 полиморфных сайта, что далеко не во всех случаях возможно. Многие из полиморфных сайтов локали- зованы вне генов на расстояниях, при которых кроссинговер может в заметном проценте случаев исказить результаты диаг- ностики. Кроме того, практическое использование рестрикцион- ных сайтов зачастую затруднено из-за отсутствия или большой стоимостью соответствующих эндонуклеазных рестриктаз.
Все эти недостатки могут быть устранены при использова- нии в качестве молекулярных маркеров высокополиморфных тан- демно повторяющихся коротких три- и тетрамерных повторов
(STR) (см. Главу III). Для многих генов найдены уникальные паттерны полиморфных аллелей, отличающихся по числу "коро- вых" едининц повторяющихся последовательностей нуклеотидов.
Такие "количественные" полиморфизмы , как уже упоминалось
(см.Главу III), очень широко распространены по всему геному и присутствуют в интронных и фланкирующих областях многих генов. Появление в конце 1994г 0.7-сантиморганной карты ге- нома человека, построенной на базе высокополиморфных динук- леотидных (C-A)n повторов, сделало реальным маркирование, практически, любого картированного гена. Особенную диагнос- тическую ценность представляют внутригенные маркеры, для ко- торых резко снижена вероятность кроссинговера с мутантными аллелями гена, а следовательно, особенно высока точность ди- агностики. Кроме того, как оказалось, многие внутригенные полиморфные короткие тандемные повторы обнаруживают сильное неравновесие по сцеплению с определенными мутантными аллеля- ми гена, что значительно облегчает их идентификацию в отяго- щенных семьях. Индекс гетерозиготности таких полиаллельных мини- и микросателитных систем нередко превышает 0.8. Их применение позволяет маркировать, то есть сделать информа- тивными (см. 7.4) для ДНК-диагностики практически все семьи высокого риска при условии наличия больного ребенка или дос- тупности для молекулярного анализа его патанатомического ма- териала .
Изучение полиморфных маркеров у больного пробанда и его родителей и выяснение аллельной природы молекулярного марке- ра, так называемое "определение фазы сцепления" (см.раздел
7.4), составляет основу для дальнейшей диагностики косвенны- ми методами (Евграфов, Макаров,1987). Применение косвенных методов молекулярной диагностики предусматривает также в ка- честве обязательного предварительного этапа исследование частоты аллелей соответствующих полиморфных сайтов в анали- зируемых популяциях, среди больных и гетерозиготных носите- лей мутаций, а также определение вероятности рекомбинации и неравновесности по сцеплению между маркерными сайтами и му- тантными аллелями гена. Такие исследования проводятся с по- мощью методов блот-гибридизации по Саузерну, либо ПЦР
(см.разделы 1.3.; 1.7; 2,5). В первом случае в распоряжении исследователя должны быть соответствующие ДНК-зонды, во вто- ром - должны быть известны нуклеотидные последовательности районов ДНК, включающие соответствующие полиморфные сайты, для выбора олигопраймеров (см. Главы II,1V).
Раздел 7.2. ДНК-диагностика при различных типах насле- дования.
Напомним, что значительное число моногенных заболеваний наследуется по рецессивному типу. Это значит, что при ауто- сомной локализации соответствующего гена болеют только гомо- зиготные носители мутаций. Гетерозиготы клинически здоровы, но с равной вероятностью передают своим детям мутантный или нормальный варианты гена. Таким образом, на протяжении дли- тельного времени мутация в скрытом виде может передаваться из поколения в поколение. При аутосомно-рецессивном типе наследования в родословных тяжелых больных, которые либо не доживают до репродуктивного возраста, либо имеют резко сни- женные потенции к размножению, редко удается выявить больных родственников, особенно, по восходящей линии. Исключение составляют семьи с повышенным уровнем инбридинга, который возникает либо за счет высокой частоты близкородственных браков, либо за счет вступления в брак людей из одинаковых изолированных популяций ограниченной численности. Больные дети с вероятностью 25 % рождаются в тех семьях, где оба ро- дителя являются гетерозиготными носителями мутаций одного и того же гена. Возможно также рождение больного ребенка в та- кой семье, где только один из супругов несет мутацию, а вто- рая мутация возникла в гамете его партнера в момент, пред- шествующий оплодотворению. Доля таких семей в общей группе риска относительно невелика, а риск повторного рождения в них больного ребенка не превышает общей частоты спонтанного возникновения мутаций в данном гене. Для болезней, сцеплен- ных с полом, то есть контролируемых генами, локализоваными в
Х-хромосоме, характерно то, что болеют преимущественно маль- чики, тогда как носителями являются девочки.
Y-хромосома содержит очень мало генов, большинство из которых (около 10) картировано в так называемой псевдоауто- сомной области короткого плеча, гомологичной таковой на ко- ротком плече X-хромосомы. Важнейшим истинным геном Y-хромо- сомы, то есть геном, представленным только на этой хромосо- ме, является ген SRY (Yp21.1), детерминирующий развитие пола по мужскому типу. Мутации этого регуляторного гена приводят к нарушениям половой дифференцировки (XY-женщины), а его пе- ренос вследствие ошибок рекомбинации псевдоаутосомных райо- нов на короткое плечо X-хромосомы обусловливает синдром ре- версии пола- Sex reverse (XX-мужчины) (McElreavey et al.,
1993). Практически важно, что присутствие даже небольшого околоцентромерного фрагмента длинного плеча Y-хромосомы при кариотипе XX является безусловным показанием для удаления зачатков гонад у таких индивидуумов в связи с высокой веро- ятностью экспрессии гена Gba, ведущего к их злокачественному перерождению - гонадобластоме (Giquel et al., 1992). В отли- чие от Y-хромосомы, большая по размеру X-хромосома человека несет до 5% всех структурных генов, многие из которых уже идентифицированы (см. Главу III).
Все рецессивные аллели Х-хромосомы у мальчиков проявляют- ся, так как находятся в гемизиготном состоянии. Девочки мо- гут болеть в том случае, если они гомозиготны по мутации.
Такая возможность может осуществиться в семье, где болен их отец, а мать является носительницей мутации и передала доче- ри свой мутантный аллель. Если отец больной девочки здоров, можно предполагать, что мутация возникла в той его гамете, которая участвовала в оплодотворении. Х-сцепленные заболева- ния у девочек (миодистрофия Дюшенна, гемофилия А) могут быть следствием сочетанного проявления мутации этих генов у одно- го из родителей и делеции соответствующих фрагментов хромо- сом у другого. В этих редких случаях у девочек, как и у мальчиков, мутации Х-сцепленных генов будут находиться в ге- мизиготном состоянии
При доминантном наследовании для развития болезни дос- таточно одного мутантного аллеля. Такие больные с вероят- ностью 50% рождаются в семьях, где один из родителей болен.
Очень редко больные дети с доминантным типом наследования могут родиться и у здоровых родителей в результате мутирова- ния одной из гамет. Однако, вероятность повторного рождения больного ребенка в такой семье такая же, как и для популяции в целом. Пренатальная диагностика доминантных болезней про- водится достаточно редко по ряду причин. Во-первых, такие болезни составляют относительно небольшой процент среди всех моногенных заболеваний. Во-вторых, тяжелые болезни, сопро- вождающиеся летальным исходом в раннем возрасте или приводя- щие к бесплодию, не передаются по наследству, а появляются каждый раз заново вследствие мутации при созревании гамет.
Необходимость же предотвращения рождения больных, которые не только доживают до репродуктивного возраста, но и способны оставить потомство, является вопросом дискуссионным. Прове- дение пренатальной диагностики таких заболеваний принимается с учетом многих конкретных обстоятельств. Актуальность этой проблемы стала особенно очевидной в последние годы, когда была открыта многочисленная группа доминантных нейродегене- ративных заболеваний (см. Главу IV), которые проявляются сравнительно поздно, нередко уже в репродуктивном возрасте, тяжело протекают и, по-сути, не имеют сколько-нибудь реаль- ной терапии. Для таких заболеваний первостепенное значение приобретают методы досимптоматической диагностики с исполь- зованием методов ДНК-анализа (см.Главу X).
Значительно больше распространены моногенные болезни с частичным доминированием и неполной пенетрантностью. Для по- добных заболеваний риск рождения больного ребенка в отяго- щенной семье зависит от конкретных значений этих параметров, которые, в свою очередь, определяются молекулярными механиз- мами, лежащими в основе формирования такого рода отклонений от Менделевского типа наследования.
Разработка молекулярных методов диагностики болезней, вызванных мутациями в митохондриальных генах, как показывают исследования последних лет (McKusick, 1994), приобретает особое значение. Как правило, в основе различных митохондри- альных болезней лежат нарушения в системе окислительного фосфорилирования. Поскольку некоторые ткани обладают повы- шенной чувствительностью к подобным нарушениям, сходная кли- ническая картина заболеваний может наблюдаться вследствие мутаций разных митохондриальных генов. Наследование таких болезней значительно отличается от Менделевского типа, в превую очередь, из-за материнского характера наследований митохондрий, наличия в зиготе и соответственно во всех клет- ках организма большого числа копий митохондриальных хромо- сом, из-за особенностей сегрегации этих хромосом при делении клеток и, наконец, из-за тех количественных и качественных изменений в митохондриальной ДНК, которые соровождают про- цессы онтогенетической дифференцировки клеток и старения ор- ганизма.
Для всех "митохондриальных болезней" характерен мате- ринский тип наследования и присутствие мутантных аллелей только в части хромосом (так называемая гетероплазмия), доля которых может варьировать в разных тканях. Как правило, су- ществует определенное пороговое значение доли мутантных хро- мосом, превышение которого ведет к появлению и прогрессиро- ванию заболевания. Сокращение числа митохондрий, происходя- щее в норме при старении, может способствовать увеличению доли мутантных хромосом в определнных тканях и тем самым быть причиной болезни. Неслучайно поэтому, что для многих
"митохондриальных болезней", характерно позднее начало. В силу функциональных особенностей митохондриальных генов час- то наблюдается кумулятивный эффект двух и более мутаций, ло- кализованных в разных генах. Важным представляется также то обстоятельство, что в митохондриальных генах OXPHOS-комплек- са частота возникновения мутаций выше, чем в ядерных генах, кодирующих субьединицы окислительного фосфорилирования
(McKusick, 1994).
Раздел 7.3. Группы риска, поиск гетерозиготных носите- лей мутаций.
Как следует из вышеизложенного, точная диагностика в сочетании с детальным анализом типа наследования того или иного заболевания имеет определяющее значение для формирова- ния групп риска, то есть отбора семей, в которых вероятность рождения больных детей повышена. Прежде всего, это те семьи, где уже есть или был ребенок, страдающий каким-либо моноген- ным наследственным заболеванием. Для аутосомно-рецессивных болезней с большой долей вероятности можно считать, что оба родителя этого ребенка являются гетерозиготными носителями мутантных аллелей соответствующего гена и риск повторного рождения больного ребенка в такой семье составляет 25%, не- зависимо от исхода предыдущих родов. Поэтому в таких случаях рекомендуется обязательная пренатальная диагностика плода при каждой последующей беременности.
Для сцепленных с полом заболеваний важной практической задачей является выявление случаев спонтанного возникновения мутаций в родительском поколении. Для таких распространенных заболеваний, как миодистрофия Дюшенна и гемофилия А, почти
1/3 всех случаев имеет спонтанное происхождение. При этом мутации гена дистрофина, как правило, возникают в оогенезе, то есть у матери, а мутации гена фактора Y111, обычно, появ- ляются во время сперматогенеза у деда больного ребенка (см.
Главу X). В отличие от тех семей, в которых мать гетерози- готна, вероятность повторного рождения больного ребенка в семьях со спонтанной мутацией не превышает среднепопуляцион- ной частоты, и потому нет необходимости проводить пренаталь- ную диагностику плода при последующих беременностях. Специ- ального рассмотрения в этой связи заслуживает,однако, вопрос гонадного мозаицизма, то есть наличия в гонадах матери гене- тически нормальных и мутантных ооцитов. Особенно велик риск такого состояния в случае миодистрофии Дюшенна. Гонадный мо- зацизм в силу своей органной специфики достаточно трудно до- казать или опровергнуть. Между тем, считается что 6,7% спо- радических случаев иодистрофии Дюшенна обусловлена гонадным мозаицизмом у матери (Essen et al.,1992).
Подробное медико-генетическое консультирование семей, в которых зарегистрированы спонтанные случаи рождения детей с
Х-сцепленными заболеваниями в сочетании с соответствующими лабораторными, в том числе и молекулярными исследованиями, как правило, позволяют ответить на вопрос о происхождении мутации. Так,гетерозиготное носительство у матери может быть заподозрено, в частности, по содержанию соответствующих бел- ковых продуктов (например, фактора Y111 свертывания крови при гемофилии А; дистрофина в мышцах и креатинкиназы в сыво- ротке крови при миодистрофии Дюшенна) либо при помощи специ- альных ДНК-методов, позволяющих идентифицировать мутантный аллель у матери. Если дифференцировка этих случаев невозмож- на или доказано, что мутация у больного ребенка не является спонтанной, следует предпологать, что мать является гетеро- зиготной носительницей и с 50%-ой вероятностью будет переда- вать болезнь своим сыновьям. В этом случае пренатальная ди- агностика обязательна и должна сопровождаться определением пола плода. Следует, однако, подчеркнуть, что установление мужского пола плода на сегодняшний день отнюдь не является показанием для прерывания беременности, поскольку в 50% слу- чаев они получают от матери X-хромосому с нормальным аллелем гена и являются вполне здоровыми. Определить, какую именно X
-хромосому (с нормальным или мутантным аллелем) получил бу- дущий мальчик, и является задачей молекулярной диагностики.
С помощью прямых и непрямых методов ДНК-диагностики эта за- дача уже практически решается для очень многих сцепленных с полом заболеваний (см.Главу X).
Наиболее эффективной мерой профилактики наследственных заболеваний является выявление гетерозиготных носителей му- таций, так как при этом удается предотвратить рождение пер- вого больного ребенка в семьях высокого риска. Родственники больного с большой вероятностью могут быть гетерозиготными носителями мутантных аллелей, поэтому в тех случаях, когда это возможно, они подлежат обследованию в первую очередь.
Для болезней, сцепленных с полом, это родственники по женс- кой линии - сестры, дочери и тетки пробанда. Их диагностика особенно важна, так как вероятность рождения больных сыновей в потомстве носительниц мутаций очень высока и не зависит от генотипа супруга. При аутосомно-рецессивных заболеваниях по- ловина сибсов родителей и 2/3 здоровых сибсов больного будут гетерозиготными носителями мутации. Поэтому в тех семьях, где принципиально возможна молекулярная идентификация му- тантных аллелей, необходимо обследовать максимальное число родственников больного пробанда для выявления гетерозиготных носителей. Иногда в больших семьях с разветвленными родос- ловными удается проследить наследование неидентифицируемых мутаций с помощью косвенных методов молекулярной диагности- ки.
Для заболеваний, распространенных в определенных попу- ляциях или в каких-то этнических группах и обусловленных присутствием одного или нескольких преобладающих и легко идентифицируемых мутантных аллелей, возможно проведение то- тального скрининга на гетерозиготное носительство этих мута- ций среди определенных групп населения, например, среди бе- ременных женщин или среди новорожденных. Считается, что по- добный скрининг экономически оправдан в том случае, если при проведении процедуры выявляются аллели, составляющие не ме- нее 90 - 95 % всех мутаций данного гена в исследуемой попу- ляции. Выявленные при подобных обследованиях носители мута- ций также составляют группу риска, и в последующем должны быть аналогичным образом протестированы их супруги. Однако, даже в том случае, если мутация найдена только у одного из родителей, вероятность рождения больного ребенка несколько выше популяционной частоты, но, конечно, значительно меньше
25%. Конкретное значение этого риска зависит от общей часто- ты мутаций соответствующего гена в популяции. В таких семьях по желанию родителей также может быть проведена пренатальная диагностика и прослежено наследование мутантного аллеля. При отсутствии этой мутации у плода прогноз считается благопри- ятным, независимо от того, какие аллели ребенок получит от второго супруга.
Раздел 7.4 Особенности применения молекулярных методов в пренатальной диагностике моногенных болез- ней.
Следующим шагом после отбора нуждающейся в пренатальной диагностике семьи является комплексное молекулярное обследо- вание ее членов - родителей и, если есть такая возможность, больного ребенка. Эти исследования могут быть достаточно длительными и поэтому желательно их проводить до наступления беременности. Результаты молекулярного обследования семьи служат основой для назначения и выбора способов проведения пренатальной диагностики. После этого семья планирует бере- менность, и в определенные сроки женщина поступает в клинику для проводения процедуры, обеспечивающей забор необходимых для диагностики тканей плодного происхождения. При этом сле- дует учитывать, что определение конкретных сроков этой про- цедуры зависит от многих медицинских показаний (в превую очередь, акушерских), обеспечивающих максимальную безопас- ность подобного инвазивного вмешательства как для матери, так и для будущего ребенка (Баранов и др.,1994; Бара- нов,1994).
Наиболее объективная информация о наличии моногенного наследственного заболевания у плода может быть получена при анализе его ДНК и обнаружении мутационных изменений в коди- рующих или регуляторных последовательностях соответствующих генов. Практическая диагностика мутантных аллелей в семьях высокого риска проводится для заболеваний с известным спект- ром наиболее часто встречающихся мутаций. При этом для каж- дой болезни разрабатываются относительно простые и наиболее эффективные методы идентификации мутантных аллелей. В насто- ящее время насчитывается уже несколько сотен таких заболева- ний и количество их быстро увеличивается (Baranov,1993; Ба- ранов,1994; см.Главу X).
Для генотипирования мутаций, то есть для выяснения при- роды мутантных аллелей у больного и его родителей использу- ются различные стандартные методы, подробно изложенные в главе IV. Выбор конкретного метода зависит от типа предпола- гаемых мутаций и от методических возможностей диагностичес- ких центров. При отсутствии у пробанда наиболее частых и ра- нее описанных мутаций его ДНК может быть направлена в специ- ализированные молекулярно- генетические лаборатории для бо- лее тщательного анализа с использованием всего комплекса ме- тодов идентификации мутаций вплоть до получения и секвениро- вания мутантных кДНК- вых последовательностей гена. Однако, подобные исследования очень дороги, требуют много труда и времени и потому в обычной клинической практике используются достаточно редко. В этих случаях чаще прибегают к косвенным методам молекулярной диагностики (см. раздел 7.1). Для мно- гих заболеваний, эти методы все еще остаются единственно возможными (см.Главу X). Однако, как уже указывалось, они требуют обязательного обследования полной семьи, включая больного ребенка. При его отсутствии молекулярное маркирова- ние мутантных генов у гетерозиготных родителей становится невозможным, а, следовательно, невозможна и пренатальная ди- агностика.
Идентификацию мутантных генов осуществляют путем срав- нения маркерных генотипов родителей и больного ребенка. Если не произошел кроссинговер между маркерным локусом и геном, все больные дети в семье должны иметь одинаковый маркерный генотип. Поэтому при проведении пренатальной диагностики сходство генотипов плода и пробанда является необходимым, однако в ряде случаев, вовсе не достаточным условием для подтверждения наличия заболевания. Так, например, у гомози- готных по маркеру родителей все дети будут иметь одинаковый генотип по этому локусу независимо от присутствия мутантных аллелей гена. Необходимым условием дифференцировки нормаль- ных и мутантных генов у носителей мутаций является их сцеп- ление с разными аллелями маркерного локуса. Поэтому, дискри- минация мутантных генов у родителей возможна только с по- мощью гетерозиготных маркеров. При этих условиях мутантные гены родителей могут быть определены по тем маркерным алле- лям, которые присутствуют у больного ребенка. Однако, иден- тификация по маркерным аллелям обоих мутантных генов возмож- на лишь в тех случаях, когда родители гетерозиготны, а про- банд (больной) гомозиготен по маркерному локусу.
Возможность идентификации мутантных генов родителей на основе анализа маркерных генотипов определяет информатив- ность семьи по отношению к данному маркеру. На Рис.7.1 представлены возможные маркерные генотипы в полностью и час- тично информативных, а также в неинформативных семьях при определении их путем блот-гибридизации с ДНК-зондом. Анало- гичные схемы могут быть составлены и в тех случаях, когда маркерные генотипы определяются путем анализа содержащих по- лиморфные локусы амплифицированных фрагментов ДНК. В инфор- мативных семьях маркерный генотип больного ребенка отличает- ся от маркерных генотипов обоих родителей и здорового сибса, поэтому можно проследить наследование мутантных генов при каждой беременности. В этом случае сходство маркерных гено- типов пробанда и плода достаточно для неблагоприятного прог- ноза, а носители мутации будут иметь родительский генотип. В частично информативных семьях идентифицируется только один из мутантных генов, так как маркерный генотип больного ре- бенка совпадает с генотипом одного или даже обоих родителей.
В этом случае при сходстве маркерных генотипов плода и про- банда вероятность болезни будущего ребенка составляет 50%.
Все дети с другим маркерным генотипом будут здоровы, но по- ловина из них будет нести один из мутантных аллелей. Неин- формативный маркер не пригоден для идентификации мутантных генов, а следовательно, и для проведения молекулярной диаг- ностики в данной семье. При отсутствии полной информативнос- ти необходимо исследовать другие сцепленные с геном поли- морфные локусы и выбрать в качестве маркеров те из них, ко- торые у родителей пробанда находятся в гетерозиготном состо- янии. В частично информативных семьях можно проводить прена- тальную диагностику с такой же степенью достоверности, как и в полностью информативных семьях, при одновременном исполь- зованием двух полиморфных локусов, каждый из которых марки- рует разные мутантные гены обоих родителей. Информативными оказываются также те семьи, в которых один из мутантных ал- лелей может быть идентифицирован прямым анализом соответс- твующего участка гена, а наличие другого мутантного аллеля доказывается с помощью маркерного локуса. Для многих моно- генных наследственных заболеваний количество идентифициро- ванных высокополиморфных локусов, тесно сцепленных с контро- лирующим геном, достаточно для того, чтобы более 90% семей высокого риска оказались полностью информативными, а значит, пригодными для проведения в них пренатальной диагностики с использоваанием молекулярных методов тестирования состояния плода.
Таким образом, при отсутствии возможности прямой иден- тификации соответствующих мутантных аллелей, анализ информа- тивности семьи следует начинать с наиболее полиморфных мар- керных локусов. так как при этом больше вероятность того, что родители больного ребенка окажутся гетерозиготами по выбранному маркеру. При последующем выборе маркеров важно также учитывать наличие между ними неравновесности по сцеп- лению, так как чаще всего информативность семей в отношении маркеров, находящихся в сильном неравновесии по сцеплению, будет одинакова. Действительно, неслучайный характер цис- и транс-расположения аллелей в неравновесных по сцеплению ло- кусах обуславливает повышенную вероятность таких событий, при которых гомозиготы по одному из маркеров оказываются го- мозиготными и по другому. То же самое справедливо и в отно- шении гетерозигот. Поэтому при анализе информативности семьи, в первую очередь, следует выбирать маркерные локусы, находящиеся между собой в равновесии по сцеплению.
Следует также учитывать, что определенные аллели поли- морфных сайтов, расположенных близко к мутации, возникшей однократно много лет назад и распросранившейся в популяции, будут оставаться в очень тесном неравновесии по сцеплению.
Примером может служить неравновесность между delF508 (ориен- тировочный возраст возникновения 30-50 000 лет) и 6-ти член- ным тетрамерным повтором TAGG в интроне 6 гена муковисцидоза
(Chebab et al., 1993; Агбанглы и др., 1994). Поэтому в семь- ях высокого риска с большой долей вероятности, конкретное значение которой определяется детерминантом неравновесности по сцеплению, гомозиготы по этому маркерному аллелю, окажут- ся также гомозиготами и по мутации, то есть будут больны.
Конечно, пренатальный диагноз не может быть основан только на этой информации, однако, её следует учитывать при выра- ботке комплексного заключения относительно здоровья будущего ребенка.
Во всех случаях при использовании косвенных методов мо- лекулярной диагностики необходимо также помнить, что маркер- ный генотип плода определяет наличие мутантных генов с точ- ностью до вероятности кроссинговера между мутантным аллелем и маркерным локусом. Поэтому, чем ближе расположен маркер по отношению к мутантному аллелю, тем меньше вероятность ошибки при проведении пренатальной диагностики. Для того чтобы пол- ностью избежать или, по крайне мере, резко снизить вероят- ность такой ошибки, желательно использовать внутригенные маркеры или проводить одновременное тестирование ДНК плода с помощью двух маркерных локусов, фланкирующих мутантный ал- лель. Последний подход особенно оправдан при работе с очень протяженными генами ( например геном дистрофина длиной около
2,2 миллионов пар оснований), где вероятность внутригенного кроссинговера по некоторым данным может достигать 2-2,5%.
Раздел 7.5 Доимплантационная диагностика, точность прог- нозирования.
Следует подчеркнуть, что общий подход к молекулярному тестированию, практически, не зависит от формы нозологии, так как для анализа генов и мутантных аллелей используется один и те же методы (см. Глава IV). При наличии у больного или у его родителей идентифицируемых мутаций или при нахож- дении информативных для данной семьи ДНК-маркеров проведение пренатальной диагностики становится возможным на любой ста- дии развития и при любом сроке беременности.
ДНК-диагностика на начальных этапах развития человека, безусловно, имеет свои методические особенности и тесно соп- ряжена с приемами экстракорпорального оплодотворения и трансплантации зародышей. Эти обстоятельства позволяют выде- лить ее в самостоятельное научно-практическое направление - доимплантационную диагностику генных и хромосомных болезней
(Verlinsky, Kuliev, 1993). Несмотря на очевидные успехи в этой области, достигнутые в ряде зарубежных лабораторий (до- имплантационная диагностика муковисцидоза, некоторых X-сцеп- ленных заболеваний - миодистрофии Дюшенна, синдрома ломкой X
-хромосомы, гемофилии), данное направление исследований все еще находится на уровне научных разработок и не имеет широ- кого применения. Объектом ДНК-диагностики на этих стадиях развития могут служить полярные тельца овулировавших яйцек- леток и отдельные бластомеры зародыша, полученные методом микрургии (Рис.7.2). Недостатком этого подхода является сравнительно невысокий процент (до 30%) приживаемости опери- рованных зародышей после их искусственной трансплантации в матку. Подробно с методами доимплатационной диагностики, её современным состоянием и перспективами можно ознакомиться в уже цитированной монографии (Verlinsky, Kuliev, 1993). Есть определенные основания считать, что в связи с быстрым ростом числа центров экстракорпорального оплодотворения в Рос- сии, заметным увеличением эффективности их работы, оценивае- мой по числу наступивших беременностей и родов, методы доим- плантационной диагностики наследственных болезней будут привлкать к себе все большое число исследователей. Однако, практическая значимость такого подхода в виду его высокой стоимости и недостаточной надежности еще сравнительно долго будет оставаться проблематичной, по крайней мере, в нашей стране.
Обобщенный опыт различных молекулярных диагностических центров мира свидетельствует о том, что оптимальным для пре- натальной диагностики является первый триместр беременности
(10-12- недели), поскольку при неблагоприятном прогнозе бе- ременность может быть прервана обычным медицинским абортом.
Зачастую молекулярную диагностику проводят и во втором три- местре беременности (обычно на 17-21 неделях). Необходимые для анализа образцы ДНК плода выделяют из биоптатов хориона
(плаценты), клеток амниотической жидкости (амниоцитов) или из лимфоцитов пуповинной крови при помощи соответствующих инвазивных процедур - хорионбиопсия, плацентобиопсия, амнио- центез или кордоцентез, которые проводятся под контролем уль тразвука (Рис. 7.3). Подробнее об этих методах, их преиму- ществах и недостатках можно узнать в соответствующих моног- рафиях и обзорах (Рарр,1992; Баранов, 1994; Баранов и др.,
1994). Диагностика во 2-м триместре беременности нередко по- казана для неинформативных семей в случае тех нозологий, пренатальная диагностика которых принципиальна возможна пу- тем биохимического тестирования первичных нарушений (напри- мер муковисцидоз) или оценки каких-либо иных проявлений бо- лезни у плода.
Основным источником ДНК для диагностики в постнатальном периоде являются лимфоциты крови. Реже для этих целей ис- пользуют другие ткани и биологические жидкости, содержащие клеточные элементы (слюна, кости, моча). Если семья частично информативна (идентифицируется либо доступен молекулярной маркировке лишь один мутантный аллель), также рекомендуется диагностика в 1-м триместре беременности, так как она позво- ляет отвергнуть диагноз у 50% всех плодов при аутосомно-ре- цессивных заболеваниях, что доказывается отсутствием иденти- фицируемого мутантного аллеля. В противном случае дальнейшая тактика определяется исходя из пожеланий женщины и возмож- ностей для уточнения диагноза на более поздних сроках разви- тия (II-й триместр беременности). Так, в случае пренатальной диагностики муковисцидоза результаты молекулярных исследова- ний могут быть дополнены биохимическим тестированием фермен- тов амниотической жидкости на 18- 20-й неделях беременности
(Горбунова и др., 1991; Baranov et al., 1992); в случае ге- мофилии А - прямым серологическим исследованием активности фактора Y11 свертывания крови (Aseev et al., 1994); в случае миодистрофии Дюшенна - иммуноцитохимическим анализом дистро- фина в биоптатах мышц плода (Hoffman et al., 1992) и т.д.
Следует однако подчеркнуть, что современный уровень молеку- лярных знаний о природе гена, его мутациях и полиморфизмах позволяет в идеале проводить молекулярную диагностику наибо- лее частых моногенных заболеваний, практически, во всех слу- чаях. Возможности молекулярной диагностики в России пока весьма ограничены ( Baranov, 1993 ;см. Глава X). Кроме того, ситуация осложняется сравнительно поздним (часто, уже во время беременности) обращением семей высокого риска на пре- натальную диагностику, что не позволяет провести молекуляр- ные исследования ее информативности в полном обьеме. Связано это, в первую очередь, с плохой информированностью населения о работе соответствующих медико-генетических служб.
Из всех существующих способов пренатальной диагностики методы, основанные на анализе ДНК, являются наиболее точны- ми, так как они выявляют первичные нарушения в структуре ге- нов. Это прежде всего относится к тем заболеваниям, диагнос- тика которых осуществляется путем прямой идентификации му- тантных аллелей. Тем ни менее, даже в этом случае оконча- тельное заключение о здоровье будущего ребенка хотя и приб- лижается к абсолютному, но все же носит вероятностный харак- тер. Основным источником ошибок при проведении пренатальной диагностики служит возможная контаминация материала плода, используемого для постановки диагноза, другими тканями, в первую очередь, материнского происхождения. Поэтому сразу после взятия диагностического материала путем биопсии хорио- на, амниоцентеза или кордоцентеза проводят тщательную его оценку с использованием разнообразных лабораторных методов.
Отличие молекулярных методов тестирования от биохимических или любых других заключается в их повышенной чувствительнос- ти и огромной разрешающей способности. Загрязнение материала особенно опасно в тех случаях, когда прогноз дается на осно- ве анализа амплифицированных фрагментов ДНК. Попавшие в тес- тируемые образцы клетки чужеродного происхождения могут пос- лужить источником донорской ДНК для ПЦР и тогда может быть получено несоответствующее действительности заключение о том, что ребенок будет здоров. Риск подобных ошибок может быть значительно уменьшен при работе в стерильных условиях и при постановке анализов в нескольких параллельных пробах.
Конечно, в любом диагностическом центре возможны лаборатор- ные ошибки чисто технического порядка, не зависящие от ис- пользуемых методов тестирования. Однако, достоверность прог- нозирования, основанного на прямом анализе мутантных аллелей плода, обычно, превышает 99%. При использовании косвенных методов молекулярной диагностики появляется дополнительный риск ошибки, связанный с возможностью рекомбинации между му- тантным аллелем и маркерным локусом (особенно при больших размерах гена, как, например, в случае гена дистрофина).
Конкретное значение этого риска зависит от взаимного распо- ложения используемых для диагностики маркеров и соответству- ющих мутантных аллелей. Обычно, для молекулярной диагностики используют маркеры, частота рекомбинации которых с мутантны- ми аллелями гена не превышает десятых, а иногда и сотых до- лей процента.
В случае неблагоприятного прогноза в отношении здоровья будущего ребенка решение о прерывании или продолжении бере- менности принимают родители на основании предоставленного в их распоряжение общего заключения. После рождения ребенка или прерывания беременности желательно проводить верификацию диагноза всеми доступными для этого методами, включая и те, которые были использованы для постановки пренатального диаг- ноза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При всем разнообразии тем, затронутых в монографии, весь изложенный в ней материал, по-сути, касается трех основных проблем : 4(1) 0генетическое картирование и геном че- ловека, 4(2) 0молекулярная диагностика генных болезней,
4(3) генокоррекция наследственных дефектов и генотерапия. В реше- нии каждой из названных проблем достигнуты серьезные успехи.
Напомним некотрые из них.
Известно, что первый ген человека (ген цветной слепо- ты-дальтонизма) картирован на Х-хромосоме человека в
1911г. Первый аутосомный ген - только в 1968г. К 1973 на всех хромосомах человека было картировано всего 64 гена, а к
1994г. на генетических картах уже локализовано свыше 60 000 маркерных ДНК последовательностей (главным образом, фрагмен- тов кДНК экспрессирующихся генов-EST см.Главу III.), а также
4более 05 000 полноразмерных структурных генов. Благодаря мно- гочисленным полиморфным сайтам и, главным образом, микроса- теллитным молекулярным маркерам, созданы подробные (1,5-2 сантиморганные) генетические карты для каждой хромосомы че- ловека. Это позволило перейти от функционального к позицион- ному картированию, т 4о 0е 4сть 0картированию новых генов не- посредственно на физической карте ДНК целого генома.
По мнению авторитетных специалистов по генетическому картированию таких как Питер Гудфеллоу, Поль Вайссенбах и др 4угих, 0дальнейшее наращивание плотности молекулярных марке- ров на хромосомах человека уже лишено смысла, тем более, что в процессе идетификации все новых и новых генов методом EST, новые полиморфные сайты все равно будут найдены. Не менее оптимистично обстоят дела и с секвенированием, т 4о 0е 4сть
0вы- яснением первичной нуклеотидной последовательности всей двухметровой молекулы ДНК человека. Достаточно заметить, что первоначальная стоимость секвенирования одной пары нуклеоти- дов оценивалась в 1 $, сейчас она составляет уже около 40 центов и продолжает снижается. Причина этого - широкая авто- матизации монотонного процесса секвенирования. Так, 10 робо- тов фирмы Applied Biosystems за одну неделю секвенируют бо- лее 30 000 000 п 4ар 0о 4снований. 0Дальнейшее
совершенствование технологии секвенирования 4, 0создани 4е 0принципиально новых
под- ходов (метод "чипов"-Мирзабеков А.Д., Ed.Southern ),
4повышающих в десятки раз 0степен 4ь 0автоматизации этого про- цесса в высокоспециализированных центрах позволяет наде- яться, что секвенирование всего генома человека будет завер- шено в 2 006 году, а вполне вероятно и к 2 000 году!
Однако, само по себе завершение гигантского по замыслу и грандиозного по реализации научного проекта "Геном человека" отнюдь не означает, что процесс познания генома завершен.
Уже сейчас становится очевидным, что не существует какого-то усредненного генома человека, каждый геном как и каждый че- ловек сугубо индивидуален. Эта индивидуальность генома про- является не только на уровне отдельной личности, но и на уровне этнических групп, наций, отдельных популяций и рас
(Cavalli-Sforsa,1994). Геном человека как система динамич- ная, очень разнообразен. Анализ этого разнообразия
(diversity) - одно из важнейших продолжений программы Геном человека. Еще более актуальным является выяснение "функцио- нальной карты генома". Секвенирование позволит расшифровать порядок всех 3 4.5 0х 10 4! 09 нуклеотидов. Но ведь это только на- чало. Определить границы генов, выяснить положение много- численных регуляторных элементов, их интронно-экзонную структуру и, наконец, функциональное назначение каждого из
60 000 генов, назначение которых пока неизвестно - вот сле- дующая поистине глобальная задача молекулярной генетики.
Вполне вероятно, что именно на этом пути удастся решить за- гадку "избыточной ДНК", понять эволюцию (филогенез) генома человека и ,возможно, расшифровать партитуру симфонии жизни
- т 4о 0е 4сть 0последовательность включения и выключения генов в ходе онтогенеза.
На генетические карты человека уже в 1994г. нанесено
933 гена, мутации которых приводят к различным наследствен- ным заболеваниям, причем более 400 из них проклонированы, т 4о 0е 4сть 0выделены в чистом виде и размножены вне оргаизма че- ловека в составе ДНК фагов, вирусов, дрожжей и бактерий. Для многих из этих генов, в особенности, сопряженных с наиболее частыми, социально значимыми заболеваниями, подробно изучены спектры мутаций, охарактеризованы аллельные полиморфизмы и разработаны схемы молекулярной диагностики. Причем, если в
1993г. таких заболеваний было около 130 (Bob Williamson), то в 1994 - более 600. По-сути, уже сегодня каждый наследствен- ный недуг, ген которого картирован, доступен молекуярной ди- агностике прямыми или косвенными методами.
Помимо моногенных болезней, проблемы молекулярной диаг- ностики которых в значительной степени уже решены, все боль- ше внимания сегодня уделяют мультифакториальным заболевани- ям. На повестке дня молекулярная диагностика предрасположен- ности к таким широкораспространенным недугам как атероскле- роз, ишемия сердца, онкологические 4, психиатрические 0заболе- вания, диабет и мн 4огое 0друг 4о 0е. Выяснение генетической приро- ды этих болезней, равно как досимптоматическая диагностика многих моногенных болезней с поздней манифестацией, ставит перед исследователями 4, 0т 4о 0е 4сть 0молекулярными биологами и врачами 4, 0проблему целесообразности такой досимптоматической диагностики, права личности на исключительность знаний о собственном геноме, точнее о тех мутациях и генетических предрасположенностях которые закодированы в нем еще до рож- дения. Для некоторых заболеваний 4( 0муковисцидоз, фенилкетону- рия) такая ранняя диагностика, безусловно, целесообразна, так как позволяет начать лечение до начала заболевания. Для тех же нозологий, где реальной терапии пока нет (хорея Ген- тингтона, другие болезни "экспансии", миодистрофия Дюшенна и др.) целесообразность такой диагностики и, главное, конфи- денциальность полученной информации широко обсуждаются.
Да, уже сейчас вполне реально говорить о "генетическом паспорте новорожденных", т 4о 0е 4сть 0о том, что уже вскоре после рождения с помощью автоматизированной системы удасться проа- нализировать весь спектр наиболее частых мутаций широко распространенных заболеваний как моногенной так и мультифак- ториальной природы 4, в 0том числе и генов, мутации которых с высокой вероятностью могут привести к раку молочной железы, толстого кошечника, к атеросклерозу, диабету и мн 4огим 0другим ттяжелым недугам. Жить 4, 0н 4и 0в чем себя не ограничивая, засу- нув как страус голову в песок, либо, зная, что у вас мутация в гене глутатионтранферазы, а следовательно, высока вероят- ность болезней легких (особенно рака) воздержаться от куре- ния ? Что лучше, добровольные ограничения и периодические осмотры или состояние счастливого неведения, грозящее неми- нуемой катастрофой ? А сколько мультифиакториальных заболе- ваний можно избежать, зная о слабых и сильных сторонах свое- го генома! В настоящее время в США провдятся массовые опросы населения, цель которых выяснить целесообразность досимпто- матической диагностики в семьях высокого риска, доступность
(конфиденциальность) этой информации для членов семьи, нани- мателей, страховых компаний и пр. Иными словами, практически овладев плодом Древа Познания - собственным геномом- челове- чество поставлено перед дилеммой как сделать так, чтобы польза от него оказалась много весомее, чем потенциальный вред. Неслучайно, сегодня уже на новом, молекулярном уровне всплывают идеи "улучшения человеческой породы " Фрэнсиса
Гальтона, правда, неимеющие ничего общего с примитивной ев- геникой прошлого. Обрели реальность и казавшиеся невозможны- ми в недалеком прошлом идеи патентования отдельных генов и их фрагментов, потенциально особенно перспективных для моле- кулярной диагностики и биотехнологий. Несмотря на протесты руководителей программы "Геном человека" Фрэнсиса Коллинса,
Томаса Каски и широкой научной общественности патент- носпособность генома человека, по крайней мере, его отдель- ных фрагментов, генов (например, гена BRCA-1- мутации кото- рого резко увеличивают вероятность рака молочной железы) по- лучила одобрени 4е 0 законодательных комитетов США
Еще больше этических и моральных вопросов порождает ге- нотерапия. Однако, и в этой области наметилась определенная эволюция взглядов как специалистов, так и широкой обществен- ности. От полной неприемлемости такого подхода в 70-80-х го- да 4х 0уходящего века до признания безопасности (при соблюдении необходимых правил) генноинженерных манипуляций на сомати- ческих клетках. Между тем, логика подсказывает, что по мере того как все больше соматических мутаций удастся исправить с помощью генной терапиии, тем значительней будет их вклад на уровне половых клеток. Тем больше будет шанс того, что 4при
4вступлении 0в брак гомозигот по аутосомно-рецессивным заболе- ваниям 4(а вероятность такого события будет возрастать по
4мере совершенствования методов лечения генетических
4болезней) 0, все дети 4будут здоровы, хотя и получат от своих
4родителей мутантные гены. Это станет особенно реальным в
4связи с успешной разработкой методологии доимплантационной
4диагностики наследственных болезней. Поэтому 0в научной лите- ратуре все настойчивее звучит тема генокоррекции на уровне половых клеток или ранних зародышей человека. Современный методоческий уровень пока еще не позволяет с абсолютной уве- ренностью осуществлять направленный перенос гена в половые клетки и клетки дробящихся зародышей. Пока этого удалось достичь только в экспериментах с эмбриональными стволовыми клетками, причем на 1-м этапе возникший организм, в действи- тельности, является мозаиком по введенному гену (см. Главу
V 4I 0II). Естественно, это не означает, что проблема гомолого- гичной рекомбинации нормального и мутантного гена на уровне половых клеток и ранних зародышей принципиально неразрешима.
Однако, потребуется еще много времени, возможно не одно десятилетие XXI-го века, прежде, чем эта задача будет успеш- но решена. В настоящее время мнение специалистов и широкой общественности - максимально предотвратить возможность попа- дания чужеродного генетического материала в половые клетки, с тем, чтобы избежать непредсказуемых, а, скорее всего, весьма печальных, последствий для человечества такого трансгеноза.
Нет, однако,сомнений в том, что, если конец ХХ-го века ознаменован расшифровкой молекулярной структуры генома чело- века, то век XXI прославится выяснением его функций на уров- не отдельных генов, генных сообществ, хромосом , также всего генома вцелом в контролировании процессов онто- и филогене- за.
Молодым людям, вступающим в ХХI век, необходимо знать,
4на каком этапе 0находится наука 4о структуре и функциях
0геном 4а человека. Это важно не только с сугубо утилитарных, меди- цинских позиций (хотя и этот аспект крайне важен), но и с позиций общечеловеческих. Ибо всякое эпохальное открытие на- уки (а именно таковым и является расшифровка генома челове- ка) до недавнего времени использовалось не только во благо, но и во вред человечеству ( 4п 0ечальный пример тому - открытие расщепления ядра урана, породившее атомную бомбу). Неразум- ные эксперименты с геномом человека могут привести к еще бо- лее страшным последствиям. Уберечь генофонд человечества, всячески оберегая его от рискованных вмешательств, и при этом извлечь максимальную выгоду из уже полученной бесценной информации в плане диагностики, профилактики и лечения мно- гих тысяч наследственно обусловленных недугов - вот задача, которую необходимо решать уже сегодня 4и 0с которой мы прийдем в новый XXI век !
ГЛАВА IX.
ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ.
Раздел 9.1 Определение, историческая справка, програм- мы генной терапии.
В широком смысле слова генная терапия означает лечение путем введения в ткани или в клетки пациента смысловых пос- ледовательностей ДНК. Первоначально генная терапия рассмат- ривалась как возможность исправления дефекта в гене. Счита- лось, что основным обьектом для такого лечения будут служить моногенные наследственные заболевания человека, причем тео- ретически представлялась вероятной коррекция генного дефекта как на соматическом уровне, так и на уровне зародышевых (по- ловых) клеток. Многочисленные эксперименты по созданию трансгенных животных, начатые после 1980 г., а также на культурах клеток внесли существенные коррективы в эти теоре- тические представления. Во-первых, оказалось значительно проще исправлять не сам дефект в гене, то есть заменять весь мутантный ген или его мутированный фрагмент на нормальный, а вести коррекцию путем введения в организм пациента полноцен- но работающего гена (обычно его кДНК). Во-вторых, несмотря на решающие успехи генной инженерии последних лет, исследо- вания по геннной терапии у человека осуществляются исключи- тельно на соматических тканях, в которых в норме происходит экспрессия дефектного гена. Генная терапия на уровне половых и зародышевых клеток человека ввиду возможных серьезных пос- ледствий для генофонда человечества представляются весьма проблематичной и на данном этапе наших знаний - малореаль- ной. И наконец, в-третьих, уже разработанная и применяемая на практике методология генной терапии оказалась пригодной для лечения не только моногенных наследственных заболеваний, но и таких широко распространенных болезней, какими являются злокачественные опухоли, многие виды тяжелых вирусных инфек- ций, включая спид, сердечно-сосудистые и другие заболевания.
Учитывая эти обстоятельства, генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных, онкологи- ческих, некоторых инфекционных (вирусных) и других заболева- ний путем введения генов в клетки пациентов с целью направ- ленного изменения генных дефектов, либо придания клеткам но- вых функций (Culver, 1994). Первые клинические испытания ме- тодов генной терапии были предприняты 22 мая 1989г. с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы. Маркированные прокариоти- ческим геном neo, Т-лимфоциты были устойчивы к неомицину и могли быть легко отселектированы в культуре, что позволило детально проследить их судьбу в кровотоке и избирательное накопление в опухолях (подробней см. 9.5).
Первым моногенным наследственным заболеванием, в отно- шении которого были применены методы генной терапии, оказал- ся наследственный иммуннодефицит, обусловленный мутацией в гене аденозин-дезаминазы. 14 сентября 1990г.в Бетезде (США)
4-х летней девочке, страдающей этим достаточно редким забо- леванием (1 : 100 000), были пересажены ее собственные лим- фоциты, предварительно трансформированные ex vivo геном ADA
(ген ADA + ген neo + ретровирусный вектор). Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процеду- ра была повторена с интервалом 3-5 месяцев (Anderson, 1992;
Culver, 1994). В течение 3-х лет терапии в общей сложности проведено 23 внутривенных трансфузии ADA-трансформированных
Т-лифоцитов без видимых неблагоприятных эффектов. В резуль- тате лечения состояние пациентки (Ашанти В. ДеСильва) нас- только улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни и не бояться случайных инфекций. Столь же успешным оказалось и лечение второй пациентки с этим заболеванием
(подробней см. раздел 9.5). В настоящее время клинические испытания генной терапии этого заболевания проводятся в Ита- лии, Франции, Великобритании и Японии.
Другие моногенные наследственные заболевания, в отноше- нии которых уже имеются официально разрешенные протоколы и начаты клинические испытания, касаются семейной гиперхолес- теринемии (1992); муковисцидоза (1993); гемофилии В (1992); болезни Гоше (1993). В отношении многих других заболеваний медицинские протоколы клинических испытаний находятся в ста- дии утверждения (см. раздел 9.5.). К 1993г. только в США к клиническим испытаниям генно-инженерных конструкций на чело- веке было допущено 53 проекта (Culver, 1994). К 1995г. в ми- ре число таких проектов возросло до 100 и более 400 пациен- тов было непосредственно вовлечено в эти исследования (Hodg- son, 1995). Подавляющее большинство таких проектов (86) ка- салось лечения онкологических заболеваний, а также спида.
Таким образом, от опытов на животных и теоретических построений 80-х годов уже в 1990 году удалось приступить к реальному лечению моногенных заболеваний, число которых стремительно нарастает. Естественно, что подобные революци- онные перемены могли возникнуть только в результате решающих успехов молекулярной биологии в картировании генов, мутации которых приводят к наследственным заболеваниям (см.Главу
III), выяснении молекулярной природы этих мутаций (см.Главу
IV), успехов в секвенировании и клонировании генов (см.Главы
I и II), создании генно-инженерных конструкций (см.Главу
II), отработки и совершенствования методов их доставки
(см.ниже). Следует также подчеркнуть, что качественный ска- чок в области генной терапии, когда сам ген стал рассматри- ваться как лекарственный препарат, стал возможен благодаря тому, что предшествующие экспериментальные и клинические исследования доказали безопасность генной терапии.
Вместе с тем, и в сегодняшних исследованиях по генной терапии необходимо учитывать, что последствия манипулирова- ния генами или рекомбинантными ДНК in vivo изучены недоста- точно. Следует помнить, что введение в организм человека последовательностей ДНК, не находящихся под контролем свойс- твенных им регуляторных элементов, может приводить к трудно предсказуемым измененим метаболических процессов и сопровож- даться функциональным дисбалансом. Современные представления о структуре генома и его взаимодействиях с экзогенными ДНК и вирусными последовательностями, часто используемыми в ка- честве векторов для переноса генов (см. 9.2), могут оказать- ся недостаточными для прогнозирования возможных нежелатель- ных или неконтролируемых последствий такого вмешательства.
Поэтому при разработке программ генной терапии принципиаль- ное значение имеют вопросы безопасности предлагаемых схем лечения как для самого пациента, так и для популяции в целом
(Anderson, 1992; Miller, 1992). Важно, чтобы при проведении испытаний ожидаемый лечебный эффект или возможность получе- ния дополнительной полезной информации превосходили потенци- альный риск предлагаемой процедуры. Неслучайно, в странах с наиболее продвинутым уровнем исследований в этой области, особенно в США, медицинские протоколы с использованием смыс- ловых последовательностей ДНК подвергаются обязательной экс- пертизе в соответствующих комитетах и комиссиях. Клинические испытания предложенной генотерапевтической процедуры возмож- ны только после ее одобрения соответствующим законодательно утвержденным органом. В США таковыми являются: Консультатив- ный Комитет по Рекомбинантным ДНК (Recombinant DNA Advisory
Committee - RAC), Комитет по лекарствам и пищевым продуктам
(Food and Drug Administration -FDA), с последующим обяза- тельным утверждением проекта директором Национального Инсти- тута Здоровья (National Institute of Health) (Miller, 1992;
Anderson, 1992; Culver, 1994). В Европе такие протоколы сос- тавляются и утверждаются в соответствии с рекомендациями Ев- ропейской Рабочей Группы по Переносу Генов и Генной Терапии
(European Working Group on Human Gene Transfer and Therapy)
(Cohen-Haguenauer, 1995). Программы генной терапии для кли- нических испытаний должны включать следующие разделы: обос- нование выбора нозологии для проведения курса генной тера- пии; определение типа клеток, подлежащих генетической моди- фикации; схему конструирования экзогенной ДНК; обоснование биологической безопасности вводимой генной конструкции, включающая опыты на культурах клеток и на модельных (транс- генных) животных; разработку процедуры ее переноса в клетки пациента; методы анализа экспрессии введенных генов; оценку клинического (терапевтического) эффекта; возможные побочные последствия и способы их предупреждения (Culver, 1993; Co- hen-Haguenauer, 1995).
Важнейшим элементом в программе генной терапии является анализ последствий проводимых процедур. Этот контроль прово- дят на всех этапах терапии, причем исследования выполняют на различных уровнях. Прежде всего, после переноса гена осу- ществляют поиск модифицированных клеток в организме пациента и следят за динамикой этих клеток в определенных тканях.
Этот поиск может быть облегчен при наличии маркерного гена в конструкции. Присутствие последовательностей экзогенной ДНК в модифицированных клетках чаще всего идентифицируют с по- мощью ПЦР. На следующем этапе производят анализ экспрессии введенных генов путем идентификации и количественной оценки соответствующего РНК-транскрипта, либо белкового продукта гена. В тех случаях, когда это возможно, проводят анализ коррекции первичного биохимического дефекта. Затем, все по- лученные данные сопоставляют с результатами комплексного ме- дицинского обследования и вносят необходимые исправления и добавления в проводимую схему лечения.
Раздел 9.2. Типы генотерапевтических вмешательств, вы- бор клеток-мишеней.
Рассмотрим наиболее общие принципы, лежащие в основе построения программ генной терапии. Итак, генная терапия предполагает введение последовательностей ДНК в клетки-мише- ни. Она проводится либо с целью коррекции наследственной па- тологии, возникшей вследствие генетического дефекта, либо для придания этим клеткам новых функций, способствующих уст- ранению патологических процессов. В первом случае, в орга- низм больного вводят нормально работающий гомолог дефектного гена. Второй подход применяют при лечении, таких заболева- ний, как опухоли или инфекции. В этих случаях вводят гены, обладающие условным цитотоксическим эффектом или способству- ющие формированию выраженного иммунного ответа. Мишенями для таких генов служат пораженные ткани, иммунные клетки, специ- фическим образом проникающие в эти ткани, либо предваритель- но трансформированные in vitro другие клетки. Таким образом, в зависимости от характера заболевания и предполагаемого ге- нотерапевтического подхода объектом генетической трансфекции могут служить самые разные соматические клетки, как несущие дефектный ген, так и нормальные клетки, приобретающие тера- певтические свойства после трансфекции. В зависимости от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная те- рапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная терапия или терапия ex vivo предполагает выделение и культи- вирование специфических типов клеток пациента, введение в них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реин- фузию их тому же пациенту (Рис. 9.1). В настоящее время большинство допущенных к клиническим испытаниям программ генной терапии использует именно этот подход (Cul- ver, 1994). Осуществление таких программ возможно лишь в крупных специализированных центрах, требует больших матери- альных затрат и высоких биотехнологий.
Генная терапия in vivo основана на прямом введении кло- нированных и определенным образом упакованных последователь- ностей ДНК в специфические ткани больного. При этом вводимые
ДНК, как правило, интегрируют с молекулами, обеспечивающими их адресную доставку в клетки-мишени (см. 9.3). Этот очень перспективный подход, расчитанный на массовое лечение широко распространенных заболеваний, пока реально апробирован толь- ко для лечения муковисцидоза (Crystal et al., 1994). Особен- но перспективным для лечения генных болезней in vivo предс- таляется введение генов с помощью аэрозольных или иньецируе- мых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения пульмонологических заболеваний, таких как муковисцидоз, энфизема, рак легких, при которых обьекта- ми генетической модификации являются специфические типы ле- гочных клеток (Hoffman, 1991). Иньецируемые вакцины могут использоваться для модификации различных типов клеток и со временем, по-видимому, станут наиболее распространенным и универсальным способом доставки чужеродного генетического материала в любые ткани.
Эффективность курса генной терапии в значительной сте- пени зависит от правильного выбора типов соматических кле- ток, в которых должна бать проведена генетическая модифика- ция. Так например, при лечении какого-либо наследственного заболевания, обусловленного дефектом секреторного белка, ге- нетической коррекции, в принципе, могут быть подвергнуты лю- бые клетки, тогда как для нерастворимых или мембран-связан- ных белков выбор ограничен теми клетками, где экспрессирует- ся соответствующий ген (см.раздел 8.5). Разработке программы генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифи- ческой экспрессии соответствующего гена, идентификация пер- вичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового про- дукта, а также биохимический анализ патологического процес- са. Все эти данные учитываются при составлении соответствую- щего медицинского протокола. Кроме того, план генотерапевти- ческих вмешательств определяется также доступностью кле- ток-мишеней, периодом их жизни и характером миграции в орга- низме, эффективностью и специфичностью трансфекции кле- ток, длительностью экспрессии введенного гена.
Наиболее перспективной представляется возможность гене- тической модификации не самих уже дифференцированных клеток с наследственным дефектом, а их предшественников, то есть долго живущих стволовых клеток. В частности, многообещающей является трансформация тотипотентных эмбриональных стволовых клеток, которые при создании определенных микроусловий могут дифференцироваться, практически, в любые соматические клетки организма (Hodgson, 1995). Следует упомянуть в этой связи предложенный недавно эффективный метод получения стволовых клеток гемопоэтического ряда, перспективных для генотерапии наследственных заболеваний крови (Berardi et al., 1995).
Как правило, определение типа клеток, подлежащих гене- тической модификации, завершается оценкой результатов пере- носа гена в системе in vitro и проведения экспериментов на животных моделях в тех случаях, когда это возможно. Апроба- цию процедуры генокоррекции наследственного заболевания про- водят на первичных культурах экспрессирующих клеток больного либо на перевиваемых культурах, полученных после предвари- тельной трансформации первичных культур. На этих клеточных моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клет- ки, отрабатывают способы идентификации первичного дефекта и его коррекции на биохимическом уровне.
Однако, многие проблемы генной терапии не могут быть решены на уровне клеток. Важное значение имеет анализ влия- ния введенных ДНК-последовательностей на межклеточные взаи- модействия, определяющие работу соответствующих тканей и ор- ганов. Такие исследования могут быть проведены только in vi- vo. Так, например, в культуре клеток можно определить коли- чество синтезированного белка, необходимое для нормализации биохимического дефекта, но этих данных недостаточно для от- вета на вопрос, какое количество клеток в организме должно быть модифицировано для восстановления нарушенной функции.
Используя культуры клеток, можно разработать биохимическую систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако, про- верка надежности работы этой системы может быть осуществлена только на уровне целого организма. Показатели длительности и характера экспрессии введенного гена в культуре клеток могут использоваться лишь в качестве ориентировочных параметров для оценки необходимой периодичности повторения терапевти- ческих процедур. Кроме того, многие побочные эффекты и, в первую очередь, возможные ошибки в регуляции эспрессии чуже- родного гена и опасность вирусной контаминации в результате использования компетентного по репликации вектора (см.ниже), могут быть выявлены только in vivo. Поэтому такое внимание в программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo на естественных или искусственно полученных моделях соот- ветствующих наследственных болезней у животных (см.Главу
VIII). Успешная коррекция генетических дефектов у таких жи- вотных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной терапии является важнейшей предпосылкой для разрешения кли- нических испытаний.
Раздел 9.3 Методы генетической трансфекции в генной те- рапии.
Решающим условием успешной генотерапии является обеспе- чение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векто- ров) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длитель- ной персистенции его в этих клетках и создание условий для полноценной работы, то есть экспрессии. Трансфекция может проводиться с использованием (1) чистой ("голой"-naked) ДНК, лигированной в соответствующую плазмиду, либо (2) комплекси- рованной ДНК - плазмидная ДНК комплексированная с солями, белками (трансферрином), органическими полимерами (DEAE - декстраном, полилизином, липосомами или частицами золота), либо (3) ДНК в составе вирусных частиц, предварительно ли- шенных спсобности к репликации. Залогом длительной персис- тенции чужеродной ДНК в клетках-реципиентах является ее встраивание в геном, то есть в ДНК клетки-хозяина. Пребыва- ние экзогенной ДНК в ядре в свободном состоянии (в виде, так называемых, эписом) с неизбежностью ведет к ее элиминации даже в неделящихся клетках и, соответственно, к транзиторной экпрессии (обычно, в течение нескольких месяцев). Необходи- мой предпосылкой экспрессии чужеродной ДНК является наличие соответствующих промоторов, причем в случае наличия тканес- пецифических промоторов можно добиться экспрессии введенного гена только в определенных тканях и клетках (см.ниже). Ос- новные методы доставки чужеродных генов в клетки подразделя- ются на химические, физические и биологические. Эффектив- ность трансфекции и интеграционная способность трансдуциро- ванной чужеродной ДНК при различных способах трансфекции в
ДНК-клетки мишени приведены в Табл.9.1.
Таблица 9.1. Основные характеристики генетической трансфек- ции in vitro (Culver, 1994).
--------------------T------------T-------------T------------¬
¦ Методы ¦ Трансдукция¦ Иинтеграция ¦Экспрессия ¦
+-------------------+------------+-------------+------------+
¦ Химические: ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Са-фосфат ¦ ¦ ¦ ¦
¦ преципитация ¦ низкая ¦ низкая ¦трнзиторная ¦
+-------------------+------------+-------------+------------+
¦ Физические: ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Электропорация ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦ Микроинъекция ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦ "Бомбардировка" ¦ ¦ ¦ ¦
¦ частицами золота ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
+-------------------+------------+-------------+------------+
¦Слияние: ¦ ¦ ¦ ¦
¦Липосомы ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦Рецептор-опосредо- ¦ ¦ ¦ ¦
¦ванный эндоцитоз: ¦ ¦ ¦ ¦
¦ДНК-белковый ¦ ¦ ¦ ¦
¦комплекс ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦ДНК-комплекс- ¦ ¦ ¦ ¦
¦вирусная капсида ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
+-------------------+------------+-------------+------------+
¦Рекомбинантные ¦ ¦ ¦ ¦
¦вирусы: ¦ ¦ ¦ ¦
¦Аденовирус ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦Адено-ассоцииро- ¦ ¦ ¦ ¦
¦ванный вирус (AAV) ¦ высокая ¦ низкая ¦длительная ?¦
¦Вирус герпеса (HSV)¦ низкая ¦ низкая ¦слабая ¦
¦Вирус иммуно- ¦ ¦ ¦ ¦
¦дефицита (HIV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦
¦Вирус мышиной лейке¦ ¦ ¦ ¦
¦мии Молони (MoMLV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦
¦Вирус ветряной ¦ ¦ ¦ ¦
¦оспы (Vaccinia) ¦ высокая ¦ низкая ¦слабая ¦
L-------------------+------------+-------------+-------------
Как следует из представленных данных, введение чужерод- ных генов in vitro может быть весьма эффективно как при по- мощи некоторых физических способов доставки (электропоации, бомбардировки частицами золота), так и, практически, при всех вариантах биологической доставки, особенно, с помощью рекомбинантных вирусов. Однако, реально интеграция в геном клетки-реципиента может быть достигнута только в случае рет- ровирусных или адено-ассоциированных векторов, обладающих необходимыми для встраивания в эукариотическую ДНК свойства- ми. При этом отсутствие встраивания в геномную ДНК, как пра- вило, коррелирует с транзиторной (временной) экспрессией ге- на. Следовательно, только вирусные векторы или генетические конструкции, включающие вирусные последовательности способны к активной трансфекции, а в ряде случаев и к длительной экс- прессии чужеродных генов. Следует напомнить в этой связи, что из 100 уже одобренных проектов генотерапии 95 предпола- гают использовать вирусную трансдукцию и 86 из них основаны на применении ретровирусных векторов.
Несмотря на усилия многих генно-инженерных лабораторий,
Центров, а в последнее время и фармацевтических фирм, от- сутствие идеальных векторов, обладающих эффективной (100%) трансфекцией как ex vivo так и in vivo, в сочетании с высо- кой пакующей способностью (включение генетической конструк- ции от 1 до 1 000 тысяч п.о.), интегрирующих в геном или не- интегрирующих, но обеспечивающих длительную и, что особенно важно, регулируемую экспрессию, при отсутствии опасности он- когенных модификаций или иных нежелательных побочных эффек- тов, продолжает оставаться одним из серьезных препятствий на пути внедерения генотерапии (Hodgson, 1995).
Раздел 9.4. Конструирование векторных систем и совер- шенствование методов трансформации клеток человека.
9.4.1. Основные векторные системы.
В Табл.9.1 приведены основные типы векторных систем.
Остановимся подробнее на способах их конструирования, преи- муществах и недостатках, некоторые из которых уже упомина- лись в предыдущем разделе. Как правило, вводимая генетичес- кая конструкция представляет собой полноразмерную кДНК-овую последовательность определенного гена, инсертированную в экспрессионный вектор, то есть находящуюся под действием сильного промотора. Выбор подходящего промотора зависит от многих параметров, главным из которых является необходимый уровень экспрессии гена в клетках-мишенях. Вектор часто со- держит один из маркерных генов, таких как гены neo, бе- та-Gal, ген люциферазы и др., присутствие которых в трансду- цированных клетках может быть легко обнаружено по наличию либо соответствующего белкового продукта (гистохимически для генов бета-Gal и люциферазы), либо маркерных последователь- ностей ДНК. Если в качестве маркера выбран селектируемый ген
(neo), отбор клеток, трансфецированных in vitro, может про- изводиться автоматически на соответвтвующих селективных сре- дах. Существует два типа конструкций; один - на основе плаз- мидной ДНК, другой - на базе вирусов. Плазмидные конструкции удобны для клонирования, генно-инженерных манипуляций и по- лучения большого количества рекомбинантной ДНК. Однако, бак- териальные плазмиды, в отличие от вирусных конструкций, не способны самостоятельно проникать в эукариотические клетки.
Для введения инсертированной в плазмиду экзогенной ДНК в клетки человека необходимо перенести ее в подходящий вирус- ный вектор или применить способ, облегчающий ее прохождение через клеточные мембраны.
9.4.2 Методы физического переноса чужеродной ДНК в клетки эукариот.
Уместно заметить, что чужеродная ДНК может спонтанно проникать в клетки эукариот, благодаря наличию на наружных клеточных мембранах белков, специфически связывающих ДНК.
Путем эндоцитоза (впячивания внутрь клеточной мембраны) чу- жеродная ДНК попадает в цитоплазму в составе эндосом, где обычно быстро разрушается лизосомальными ферментами. Только небольшая часть экзогенной ДНК выходит из эндосом, попадает в ядро и, если не разрушается эндогенными нуклеазами, то мо- жет быть интегрирована в ДНК клетки. Такое, однако, случает- ся достаточно редко. Известное исключение составляют мышцы, в которых благодаря низкой активности эндогенных нуклеаз и низкой пролиферативной активности введенная ДНК долго (до 1 года) может сохраняться и даже экспрессироваться в миофиб- риллах (Hansen et al.,1991).
Эффективная доставка чужеродной ДНК непосредственно в ядро клетки-мишени может быть достигнута путем микроинъекции
(метод применяемый сегодня почти исключительно для создания трансгенных животных путем введения экзогенной ДНК в пронук- леус оплодотворенной яйцеклетки - cм.Главу VIII); при помощи электропорации (кратковременного воздействия сильным элект- рическим полем); путем перфорации клеточных мембран золотыми или вольфрамовыми микрочастицами коньюгироваными с чужерод- ными ДНК и разогнанными до высокой скорости (метод бомбарди- ровки). Эти методы доставки применимы, главным образом, для клеток, культивируемых in vitro. Исключение составляет лишь метод бомбардировки, который при наличии специального генно- го "ружья" с успехом применяется и in vivo (Yang et al., 1990).
Для повышения эффективности переноса обычно используют системы доставки - соединения или группы соединений, взаимо- действующие с ДНК с образованием компактных структур, облег- чающих проникновение ДНК в клетки и защищающих ее от дейс- твия нуклеаз (Власова и др., 1994). Самой простой системой доставки является система кальций-фосфатной копреципитации, широко применяемая для трансфекции клеток in vitro. Более сложный и многообещающий вариант трансфекции представляет собой рецептор-опосредованный транспорт, предусматривающий создание достаточно сложной, обычно трехкомпонентной конс- трукции: ДНК-поликатион + лиганд + вирус (Рис. 9.2). В ка- честве лигандов используются специфические белки, такие как трансферрин, эритропоэтин, асиалоглюкопротеин, коньюгирован- ный с альбумином инсулин и некоторые другие, взаимодействую- щие с клеточными рецепторами и обеспечивающие фиксацию ген- ной конструкции на специфических клетках, то есть адресную доставку чужеродной ДНК в клетки определенного типа (напри- мер асиалоглюкопротеин - в клетки печени, трансферрин и эритропоэтин - в клетки крови и.т.д). Лиганды ковалентно присоединяются к связывающим и компактизующим чужеродную ДНК катионным носителям (полилизину, DEAE-Dextran и др.).
Важным компонентом системы является аденовирус или его
N-концевой фрагмент, выступающие в качестве эффективных фу- зогенных агентов, обеспечивающих выход экзогенной ДНК из эн- досом после попадания ее в цитоплазму клеток-мишеней. Адрес- ная доставка и эффективная защита от лизосомальных ферментов обеспечивают высокую трансфекционную способность таких конс- трукций, их несомненную перспективность для генной терапии in vivo (Hodgson, 1995).
Мы уже упоминали о возможности сочетания векторного и физико-химического подхода при конструировании систем для переноса генов в клетки человека. Одна из таких систем осно- вана на использовании филаментного фага fd для трансфекции эпителиальных клеток. Гены fd, кодирующие белки оболочки фа- га, экспрессируются на его поверхности. В один из них инсер- тируют последовательность, кодирующую поли-L-лизин. Полили- зиновые остатки в составе слитого белка связываются с плаз- мидной ДНК и удерживают ее на поверхности фага. В другой ген оболочки фага инсертируют последовательость ДНК, кодирующую какой-либо агент, специфически связывающийся с апикальной поверхностью эпителиальных клеток и интернализирующий (обес- печивающий проникновение) фага внутрь клетки. С этой целью были апробированы гены белков патогенных бактерий, поражаю- щих кишечный эпителий - интерналин и инвазин, а также после- довательности ДНК, кодирующие пептидные фрагменты вариабель- ного района моноклональных антител Ab11. Было показано, что во всех трех случаях достигается адресная доставка и интер- нализация фага в клетки-мишени, то есть система успешно функционирует.
Направленный перенос генов во многие типы клеток, со- держащие трансферриновые рецепторы, может быть осуществлен при комплексировании ДНК с трансферрином. Использование в этом комплексе аденовирусного вектора существено облегчает прохождение ДНК через эндосомы и попадание её в ядро. Иде- альными белковыми лигандами для специфических клеточных ре- цепторов могут служить моноклональные антитела или их фраг- менты, направленные против тех элементов рецепторов, которые находятся на наружной поверхности клеточной мембраны. Подоб- ная система разработана для рецептор-опосредованного генного переноса в эпителиальные клетки. Она основана на использова- нии противо-секреторных SCFab-фрагментов антител для поли- мерного иммуноглобулинового рецептора pIgR. Этот рецептор транспортирует IgA и IgM в респираторные эпителиальные клет- ки, связывая иммуноглобулины и интернализируя их путем эндо- цитоза. Показано, что в системе in vitro частота трансфекции эпителиальных клеток при использовании SCFab-поли-L-ли- зин-ДНК комплекса такая же, как и при введении экзогенной
ДНК посредством трансферринового рецептора. Аналогичные под- ходы могут быть применены для введения генов и в другие типы клеток.
9.4.3 Липосомный метод трансфекции.
Эффективный внутриклеточный транспорт и защита от дег- радации лизосомальными ферментами достигаются при использо- вании в качестве векторов липосом-липидных пузырьков, обла- дающих выраженными фузогенными свойствами - способностью сливаться с клеточными мембранами. Особенно перспективны в этом отношении липосомы, полученные на основе катионных ли- пидов, обеспечивающих 100% связывание ДНК в конденсированные нуклеолипидные частицы. Положительный заряд на поверхности таких пузырьков обеспечивает их активное слияние с отрица- тельно заряженными клеточной мембранами и прямое попадание чужеродной ДНК в цитоплазму, минуя эндосомы и, соответствен- но, не подвергаясь действию лизосомных гидролаз. Очень эф- фективный перенос высокоочищенных ДНК или РНК-последователь- ностей в соматические, особенно, в мышечные ткани может быть осуществлен с помощью препаратов липофектина или липофекта- мина (Caplen et al., 1994). Гораздо более высокая частота трансфекции по сравнению с липосом-опосредованным переносом получена в экспериментах на культурах клеток при использова- нии ДНК-липидного комплекса с циклическим амфипатическим пептидом грамицидином S.
Особенно перспективными в последнее время представляют- ся комплексы, в которых липосомы коньюгируют с мембранными антителами к определенным белкам-мишеням (иммунолипосомы) либо с белками-лигандами (см.выше). Эти конструкции обеспе- чивают эффективную адресную доставку чужеродной ДНК в клет- ки-мишени. Подобная схема была успешно апробирована для пе- реноса гена сывороточного альбумина человека в гепатоциты линейных крыс Nagase с наследственной дисальбуминемией. До- казано присутствие и экспрессия введенного таким образом ге- на человека в клетках печени крыс. Аналогичные результаты получены в опытах на линейных кроликах Watanabe, дефектных по рецепторам липопротеинов низкой плотности - LDL. Эти жи- вотные моделируют одно из наиболее частых моногенных заболе- ваний человека - семейную гиперхолесеринемию. При внутривен- ной иньекции кроликам липидного асиалогликопротеинового комплекса с плазмидной ДНК, несущей нормальный LDL-ген, уро- вень холестерина в крови животных устойчиво понижался.
Важным преимуществом рецептор-опосредованных систем на основе липосом является их низкая иммунореактивность. Они лишены и многих других недостатков, свойственных вирусным векторным системам. Вместе с тем, до сих пор не решена проб- лема низкой частоты трансформации клеток при липосомном пе- реносе. Это обстоятельство существенно ограничивает примене- ние липосом в генной терапии (Crystal, 1995). Тем ни менее, в настоящее время рецептор-опосредованный вариант передачи генетической информации в клетки эукариот с использованием в качестве лигандов специфических антител, рецепторных белков, а также вирусных последовательностей и липосом позволяет в одной системе совместить преимущества физико-химических ме- тодов переноса ДНК и вирусных векторов и потому представляет один из наиболее перспективных и быстро развивающихся нап- равлений в трансфекции эукариотических клеток.
9.4.4 Рекомбинантные вирусы.
Конструирование векторов на базе вирусов представляет собой наиболее интересный и перспективный раздел генотера- пии. Эволюционно сложившаяся система обеспечения эффективно- го проникновения в клетки-мишени, а в случае ретровирусов и система интеграции в клеточный геном, позволяет рассматри- вать вирусы как естественные векторы чужеродной ДНК для кле- ток млекопитающих. Действительно, только с помощью вирусных векторов пока удается достичь такого уровня трансфекции кле- ток человека in vitro и in vivo, который необходим для про- явления лечебного эффекта. Это доказывают многочисленные эксперименты на животных и первые клинические испытания ут- вержденных программ генотерапии (см. 9.2). Вместе с тем, нельзя недооценивать и вполне реальную опасность патологи- ческих процессов, связанных с использованием вирусных час- тиц. В качестве векторов применяют следующие рекомбинантные вирусы: ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные виру- сы, вирус герпеса, вирус спида (HIV), вирус ветряной оспы и некоторые другие (Anderson, 1992; Culver, 1994; Lowenstein,
1994; Hodgson, 1995; Kay, Woo, 1992). Учитывая большую прак- тическую значимость этих векторов, рассмотрим их более под- робно.
_Ретровирусные векторы. . Генные конструкции на основе ретровирусов (РНК-содержащих вирусов) особенно часто исполь- зуются для трансдукции ДНК ex vivo. Наиболее популярный рет- ровирусный вектор - вирус мышиного лейкоза Molony (MoMLV).
По сравнению с другими типами векторов ретровирусы обладают уникальной способностью эффективно переносить чужеродные ге- ны и стабильно интегрировать их в геном делящихся соматичес- ких клеток. Для безопасности ретровирусные последовательнос- ти модифицируют таким образом, что в инфецированных ими клетках вирусные белки не производятся. Это достигается за счет удаления или инактивации всех кодирующих последователь- ностей вируса. Репликация вирусных векторов может происхо- дить только в специальных "пакующих" клетках, в геном кото- рых встроены все гены, производящие вирусные белки. При вве- дении ретровирусных векторов в эти клетки образуются вирио- ны, несущие векторную РНК и способные лишь проникать в клет- ки-мишени, но не размножаться в них. Недостатком этой систе- мы, также как и других векторных систем на основе вирусов, является возможность контаминации производящей клеточной ли- нии нормальным ретровирусом и получения на этой основе ком- петентного по репликации вектора. Для предотвращения этого необходимо регулярное тестирование "пакующей" линии клеток.
Возможна также контаминация ретровирусного вектора клеточны- ми РНК, некоторые из них могут обратно транскрибироваться и встраиваться в геном трансдуцированных клеток. Последстия такого события могут быть выявлены в экспериментах на живот- ных моделях. Другими серьезными недостатками ретровирусных векторов является: (1) их способность переносить генетичес- кий материал только в пролифирирующие клетки; (2) способ- ность индуцировать мутации при случайной интеграции в геном;
(3) возможность спонтанной активации онкогена; (4) небольшие размеры переносимой ДНК-вставки - до 8 тысяч п.о.; (5) срав- нительно низкий титр -10!6-10!7/мл рекомбинантных вирусных частиц, получаемых для трансдукции; (6) необходимость конс- труирования соответствующих "пакующих" клонов клеток.
_Аденовирусные векторы. . В отличие от ретровирусов адено- вирусы активно инфецируют неделящиеся клетки, обладают боль- шей потенциальной пакующей способностью (ДНК-вставка> 8 кб), имеют высокий титр - 10!11/ мл, однако, не обеспечивают встраивание чужеродной ДНК в геном трансформированной клетки
(Hodgson, 1955). Использование их перспективно для генокор- рекции клеток верхних дыхательных путей, легких и других ор- ганов - мозга, печени, мышц, кожи и пр. Они эффективны при доставке аэрозольным способом, что было использовано в пер- вых клинических испытаниях по генотерапии муковисцидоза
(Crystal et al., 1994). В аденовирусные векторы также инсер- тируют маркерные гены - neo, CAT или бета-галактозидазный ген (бета-Gal) для того, чтобы идентифицировать трансдуциро- ванные клетки. Для конструирования векторов используют де- фектные по репликации аденовирусы, которые получают путем вырезания из вирусной ДНК генов, кодируюших белки (E1a,
E1b)- так называемые аденовирусные векторы 2-го поколения. В настоящее время создаются аденовирусные векторы 3-го поколе- ния, в которых помимо генов Е1а и Е1b удаляют и регуляторный ген Е4. Такая конструкция может поддерживаться только в при- сутствии клеток-хелперов (например, в культуре клеток почек человека). Удаление большего числа аденовирусных генов из векторов часто сопровождается их дестабилизацией. Это один из главных недостатков аденовирусных векторов, так как в ря- де случаев остающиеся гены, трансдуцированные в клетки-мише- ни, способствуют формированию иммунного ответа. Именно выра- женный иммунный ответ при повторных введениях аденовирусного вектора с инсерцией гена CFTR, оказался наиболее серьезным препятствием для успешной генотерапии муковисцидоза (Crystal et al., 1994). Некоторые аденовирусные белки способны оказы- вать цитотоксический эффект на высокоспециализированные клетки человека. Схема поддержания аденовирусных векторов сходна с той, которая используется для производства ретрови- русных векторов. Велика опасность их контаминации хелперным реплицирующимся вирусом. Кроме того, аденовирусы редко ин- тегрируются в геномную ДНК и потому экспрессия переносимых ими генов, как правило, носит временный характер
(Табл. 9.1). Способность инфецировать, практически, любые клетки как in vivo, так и in vitro делает особенно актуаль- ной адресную доставку таких конструкций и введение в их сос- тав тканеспецифических промотров. Например, промотор гена альфа-фетопротеина при необходимости экспрессии гена в клет- ках печени, либо промоторы генов сурфактантных белков В и С для экспрессии чужеродных генов в клетках легких.
_Аденоассоциированные вирусы . обладают значительно мень- шей пакующей способностью (около 5 кб). Однако, в отличие от ранее рассмотренных вирусов не обладают онкогенной актив- ностью, не патогенны, способны интегрироваться в геном, где пребывают в латентном состоянии. Уникальной особенностью AAV является их способность к стабильной неслучайной интеграции в один из районов хромосомы 19. Специфичность интеграции ви- руса определяется наличием в его геноме гена rep. Близко родственные AAV, так называемые, парвовирусы (H1, MVM, Lu-
III), обладают еще меньшей пакующей способностью - около 2 кб и не имеют специфичного встраивания, однако, они также рассматриваются как потенциально перспективные векторы.
_Вирус простого герпеса (HSV). . Крупный (152 кб) ДНК-со- держащий вирус, при трансформации не интегируется в геном, формируя в ядрах эписомные структуры. Уникальная особенность
HSV является его выраженная тропность к клеткам нервной сис- темы. Отсюда его перспективность как векторной системы для лечения опухолей мозга, болезни Паркинсона и многих других.
Его известное преимущество - достаточно большая пакующая способность (>30кб). Важным этапом в создании вектора на ос- нове HSV является удаление из его генома области ICP22, от- ветственной за синтез литических белков, и индукция мутации
1814, вызывающей блок транскрипции вирусной ДНК. В последнее время на основе HSV стали получать искусственные производные вируса, так назывемые ампликон-продукты, лишенные, практи- чески, всех генов HSV, но способные к репликации .
Конструкции векторов, используемых для переноса экзо- генных ДНК в клетки человека, постоянно совершенствуются в зависимости от типа клеток-мишеней. Так, новый тип векторов, сконструированных на основе псевдо-аденовирусов, сочетает в себе все преимущества аденовирусных векторов, но при этом собственные вирусные гены, практически, не оказывают никако- го повреждающего эффекта на трансфецированные клетки-мише- ни, так как содержат очень мало регуляторных элементов и последовательностей, ответственных за упаковку и репликацию аденовируса. Кроме того, псевдо-аденовирусные векторы с ус- пехом переносят чужеродные последовательности ДНК как в де- лящиеся, так и в покоящиеся клетки. Изучаются также перспек- тивы использования для генной терапии других вирусных сис- тем, таких как SV40, вирус иммунодефицита (HIV), вирус вет- ряной оспы и многие другие. В частности, заслуживают внима- ния эписомные (неинтегрирующиеся в геном реципиента) векто- ры, полученные на основе очень крупного вируса Эпштейн-Бар- ра, способного нести вставку размером от 60 до 330 кб (Sun et al., 1994).
9.4.5 Перспективы создания "идеальных" векторных систем.
Обзор существующих данных позволяет придти к заключе- нию, что, несмотря на усилия многих лабораторий мира, все уже известные и испытанные in vivo и in vitro векторные сис- темы далеки от совершенства (Hodgson, 1995). Если проблема доставки чуужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно реша- ется (главным образом, путем создания комбинированных рецеп- тор-опосредованных конструкций), то другие характеристики существующих векторной системы - стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность - все еще нуждаются в серьёзных доработках. Прежде всего, это касается стабильнос- ти экспрессии. Последняя может быть достигнута либо при ин- теграции чужеродной ДНК непосредственно в геном реципиента, либо путем обеспечения длительной персистенции экзогенной
ДНК в ядре. До настоящего времени интеграция в геном дости- галась только при использовании ретровирусных либо адено-ас- социированных векторов (Табл. 9.1). Случайная интеграция трансфектной ДНК в геном происходит достаточно редко, причем в случае ретровирусных векторов это происходит только в де- лящихся клетках. Повысить эффективность стабильной интегра- ции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем (Рис. 9.2). Однако, эти век- торные конструкции должны включать только часть вирусных ге- нов, например, гены обратной транскриптазы, ретровирусной интегразы, некоторые транспазоновые гены, парвовирусные rep-гены (см. 9.4.4). Учитывая возможный мутагенный эффект случайной интеграции, весьма перспективным представляется создание достаточно стабильных эписомных векторов. В част- ности, в последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (Mam- malian Artificial Chromosomes), которые могли бы достататоч- но автономно находиться в ядре, сохраняя способность к реп- ликации и экспрессии. Удобными моделями для этого представ- ляются автономно реплицирующиеся циркулярные микрохромосомы раковых клеток (Hodgson, 1995).
Особенно привлекательной в плане генной коррекции представляется возможность замены всего мутантного гена или его мутировавшей части (например, одного экзона) на нормаль- ный аналог, что может быть достигнуто путем гомологичной ре- комбинации. При этом в идеале можно ожидать не только дли- тельную персистенцию введенного гена, но и сохранение нор- мальной экспрессии. С этой целью в конструкции, используемые для переноса ДНК, включают агенты, повышающие частоту гомо- логичного спаривания, например, бактериальную рекомбина- зу. Показано, что в этих условиях частота гомологичной ре- комбинации может превышать 2.5*10-4. Это достаточно для то- го, чтобы с помощью ПЦР отобрать нужные клоны клеток. Для направленного введения фрагментов гена в строго определенные локусы генома недавно разработана система двойной замены, основанная на использовании HPRT-зависимых эмбриональных стволовых клеток и векторной конструкции содержащей ген HPRT
(гипоксантин-фосфорибзилтрансферазы) и ген тимидин-киназы вируса герпеса (HSV). Двойная селекция трансформантов позво- ляет отобрать клетки, в которых произошла гомологичная ре- комбинация. Такой подход нашел широкое применение при созда- нии искусственных моделей наследственных болезней у человека
(см. подробней Главу VIII). Однако, в клинической практике он еще не используется.
Раздел 9.5 Генотерапия моногенных наследственных забо- леваний.
Вопросы генотерапии наследственных заболеваний подробно рассмотрены в многочисленных обзорах (Ledley, 1987; Ander- son, 1992; Pyeritz, 1993; Breakefield, 1993; Lowenstein,
1994; Kay, Woo, 1994; Brown et al., 1994; Дризе, 1994; Crys- tal, 1995) и достаточно полно суммированы в недавно опубли- кованной монографии (Culver, 1994).
Уже через год после первого введения маркерного гена в организм человека была проведена успешная клеточная сомати- ческая генотерапия наследственного заболевания, обусловлен- ного дефицитом аденозиндезаминазы (ADA) (см. 9.1). При этом заболевании в крови пациентов накапливается в высокой кон- центрации 2'-дезоксиаденозин, оказывающий токсическое дейс- твие на T- и B- лимфоциты, в результате чего у больных раз- вивается серьезный комбинированный иммунодефицит. Для под- держания жизни пациентов проводят переодические гетерологич- ные трансплантации клеток костного мозга, однако, лишь для трети больных могут быть подобраны совместимые доноры. Эн- зим-замещающая терапия также приводит к заметному улучшению состояния пациентов, но, как правило, успех этот носит вре- менный характер. План генной терапии, разработанный сотруд- никами Национального Института Здоровья США (NIH) и одобрен- ный RAC, заключался в назначении больным аутологичных лимфо- цитов, трансдуцированных нормальным ADA-геном. Осуществление этого плана потребовало выполнения следующих процедур: изо- ляции клеток из крови пациента; активации и иммуностимуляции роста T-лимфоцитов в культуре; трансдукции их ретровирусным вектором, несущим нормальный ADA-ген и маркерный ген neo; отбора трансдуцированных клеток на селективной среде; внут- ривенной реинфузии модифицированных T-лимфоцитов пациенту.
Первой пациенткой, подвергшейся этой терапии, была 4-х лет- няя девочка (см.раздел 9.1). На протяжении 10.5 месяцев ей было сделано 8 аутологичных вливаний трансдуцированных
T-лимфоцитов и после полугодового перерыва программу реинфу- зий повторяли каждые 3-5 месяцев. Уже после первого цикла число T-лимфоцитов нормализовалось, концентрация ADA в цир- кулирующих клетках крови увеличилась с 1% до 20 - 25% нор- мального уровня и резко улучшились основные иммунные харак- теристики. Вопреки многим прогнозам, на протяжении более, чем 6 месяцев после прекращения массированных вливаний в кроветоке пациентки устойчиво сохранялось высокое число кор- ректированных T-клеток, что позволило в дальнейшем снизить количество вводимых клеток и значительно увеличить промежут- ки между этими процедурами. Спустя три месяца после первых клинических испытаний была начата программа генной терапии
ADA-дефицита у второй 9-летней пациентки. После 11 инфузий трансдуцированных аутологичных T-клеток состояние этой де- вочки также заметно улучшилось и отмечалась полная нормали- зация соответствующих биохимических и иммунологических пока- зателей. Таким образом, необходимо еще раз отметить, что при лечении обеих пациенток был достигнут очевидный клинический эффект (Anderson,1992; Culver, 1994).
Однако, в обоих случаях не все иммунные функции восста- навливались полностью. По-видимому, это было связано с тем, что коррекция генетического дефекта проводилась в зрелых
T-лимфоцитах. В связи с этим предложены программы генной те- рапии с помощью реинфузии смешанной популяции трансдуциро- ванных T-лимфоцитов и перефирических стволовых клеток крови.
Возможность изоляции и трансдукции таких тотипатентных ство- ловых клеток показана в экспериментах на приматах.
Успех первых клинических испытаний явился мощным стиму- лом для ускорения развития новых генотерапевтических методов применительно к другим наследственным заболеваниям. В
Табл. 92 представлен список болезней, для которых принципи- ально возможен генотерапевтический подход и генокоррекция наследственного дефекта с большой вероятностью будет осу- ществлена уже в обозримом будущем, а также те заболевания, для которых уже имеются официальныо утвержденные протоколы и которые находятся на разных стадиях клинических испытаний.
Таблица 9.2. Наследственные заболевания, генокоррекция кото- рых находится на стадии клинических испытаний (КИ), экспери- ментальных разработок (ЭР) и принципиально возможна (ПВ).
(Сulver, 1994; Lowenstein, 1994)
---T----------------T-----------------------T----------------T----
¬
¦ ¦Болезнь ¦ Дефектный ген ¦ Клетки-мишени ¦Ста-
¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦дия
¦
+--+----------------+-----------------------+----------------+----
+
¦1 ¦Иммунодефицит ¦аденозиндезаминаза ¦лимфоциты ¦ КИ
¦
¦2 ¦Иммунодефицит ¦пуриннуклеозид- ¦лимфоциты ¦ ПВ
¦
¦ ¦ ¦фосфорилаза ¦ ¦
¦
¦3 ¦Семейная гипер- ¦рецептор липопротеинов ¦гепатоциты ¦ КИ
¦
¦ ¦холистеринемия ¦низкой плотности ¦ ¦
¦
¦4 ¦Гемофилия В ¦фактор 1Х ¦фибробласты ¦ КИ
¦
¦5 ¦Гемофилия А ¦фактор Y111 ¦миобласты, ¦ ЭР
¦
¦ ¦ ¦ ¦фибробласты ¦
¦
¦6 ¦Болезнь Гоше ¦в-глюкоцереброзидаза ¦макрофаги, ¦ КИ
¦
¦ ¦(сфинголипидоз) ¦ ¦стволовые клетки¦
¦
¦7 ¦Болезнь Хантера ¦идуронат-сульфатаза ¦макрофаги, ¦ ПВ
¦
¦ ¦ ¦ ¦стволовые клетки¦
¦
¦8 ¦Синдром Гурлера ¦L-идуронидаза ¦макрофаги, ¦ ПВ
¦
¦ ¦ ¦ ¦стволовые клетки¦
¦
¦9 ¦Эмфизема легких ¦альфа-1-антитрипсин ¦лимфоциты ¦ ЭР
¦
¦10¦Муковисцидоз ¦CF-трансмембранный ¦эпителий бронхов¦ КИ
¦
¦ ¦ ¦регулятор ¦ ¦
¦
¦11¦Фенилкетонурия ¦фенилаланингидроксилаза¦гепатоциты ¦ ЭР
¦
¦12¦Гипераммонемия ¦орнитинтранскарбамилаза¦гепатоциты ¦ ПВ
¦
¦13¦Цитрулинемия ¦аргиносукцинатсинтетаза¦гепатоциты ¦ ПВ
¦
¦14¦Мышечная дист- ¦дистрофин ¦миобласты, ¦ ЭР
¦
¦ ¦рофия Дюшенна ¦ ¦миофибриллы ¦
¦
¦15¦Талассемия ¦бета-глобин ¦эритробласты ¦ ЭР
¦
¦16¦Серповиднокле- ¦бета-глобин ¦эритробласты ¦ ЭР
¦
¦ ¦точная анемия ¦ ¦ ¦
¦
¦17¦Респираторный ¦сурфактант ¦эпителий бронхов¦ ЭР
¦
¦ ¦дистресс-синдром¦белок В ¦ ¦
¦
¦18¦Хронический ¦NADPH-оксидаза ¦гранулоциты ¦ ЭР
¦
¦ ¦грануломатоз ¦ ¦ ¦
¦
¦19¦Болезнь ¦белок-предшественник ¦нервные клетки ¦ ЭР
¦
¦ ¦Альцгеймера ¦в-амилоида (ААР) ¦ ¦
¦
¦20¦Болезнь ¦тирозин-гидроксилаза ¦миобласты, ¦ ЭР
¦
¦ ¦Паркинсона ¦ ¦фибробласты ¦
¦
¦ ¦ ¦ ¦нервные клетки ¦
¦
¦21¦Метахромати- ¦арилсульфатаза А ¦стволовые клетки¦ ПВ
¦
¦ ¦ческая лейко- ¦ ¦крови, ¦
¦
¦ ¦дистрофия ¦ ¦нервные клетки ¦
¦
¦22¦Синдром Леш- ¦гипоксантин-фосфо- ¦нервные клетки ¦ ПВ
¦
¦ ¦Нихана ¦рибозил трансфераза ¦ ¦
¦
L--+----------------+-----------------------+----------------+----
-
Как следует данных Таблицы 9.2, на стадии клинических испытаний в 1994г. уже находились 5 моногенных заболеваний.
Для 10 генных болезней проводились экспериментальные иссле- дования и отрабатывались требования, необходимые для получе- ния официального разрешения клинических испытаний (см.9.1).
Исследования по остальным заболеваниям находятся на началь- ных этапах. Список таких заболеваний очень быстро увеличива- ется. Обращает на себя внимание, что первые программы по генной терапии связаны с модификацией гемопоэтических клеток
(Wivel, Walters, 1993). Клетки крови наиболее доступны для генетических манипуляций. После изоляции различные типы кле- ток крови могут быть легко размножены, подвергнуты трансфек- ции in vitro, а затем возвращены пациенту. Генетической мо- дификации могут быть подвергнуты не только зрелые клетки
(лимфоциты, макрофаги), но и их предшественники - стволовые клетки. Важным обстоятельством, в этой связи, является то, что процедура трансплантации клеток костного мозга уже широ- ко используется в клинике. Разработаны и достаточно эффек- тивные методы выделения стволовых гемопоэтических клеток че- ловека (Berardi etal.,1995). В экспериментах на животных по- казано, что модифицированные клетки как миелоидного, так и лимфоидного рядов могут сохраняться в кровотоке на протяже- нии более двух лет после аутологичной пересадки клеток кост- ного мозга, трансдуцированных in vitro. Путем трансфекции клеток крови соответствующими генами можно лечить не только собственно заболевания крови, но и использовать их для лече- ния многих других заболеваний как моногенной природы
(Табл. 9.2), так и различных опухолей и инфекций (см.ниже).
Другими достаточно универсальными реципиентами чужерод- ных генов могут быть фибробласты и мышечные клетки (миоблас- ты, миофибриллы). Они могут быть использованы для тех забо- леваний, где необходима коррекция генов, белковые продукты которых должны поступать в сыворотку крови или дифундировать в соседние клетки. Особенно удобны для целей генной терапии скелетные мышцы, в которых благодаря отсутствию эндонуклеаз- ной активности (см.раздел 9.4.2) принципиально возможен пе- ренос генов in vivo путем прямой иньекции экзогенной ДНК.
Инъецированная в мышцы ДНК способна экспрессироваться в мио- фибриллах находясь в неинтегрированном, эксрахромосомном состоянии. Белковые продукты экспрессии в течение длительно- го времени после трансдукции будут поступать в кровь. Про- должительность экспрессии значительно увеличивается, если генетическую модификацию производят в аутологичных миоблас- тах, которые после этого инъецируют в зрелую мышцу. Эти осо- бенности уже позволили начать эксперименты по генной терапии таких заболеваний как гемофилии А и В, дефицит антитрипсина, диабет, врожденный дефицит гормона роста и даже болезнь Пар- кинсона (Culver, 1994; Lowenstein, 1994). Достаточно удобны- ми для генетических модификаций оказались и фибробласты ко- жи, в первую очередь, благодаря легкости генноинженерных ма- нипуляций ex vivo.
Раздел 9.6. Генотерапия ненаследственных заболеваний: опухоли, инфекции.
Параллельно с развитием исследований в области генокор- рекции наследственных дефектов успешными также оказались по- иски методов терапевтического использования смысловых после- довательностей ДНК для лечения ненаследственных заболеваний и, главвным образом, злокачественных опухолей и вирусных ин- фекций. Существенно, что именно в этих разделах патологии поиски путей генокоррекции проводятся особенно интенсивно, а число уже одобренных протоколов клинических испытаний во много раз превышает число таковых для лечения моногенных бо- лезней (см.Рис. 9.1). Такое положение дел, по-видимому, прежде всего объясняется широкой распространенностью онколо- гических заболеваний и отсутствием достаточно эффективной терапии. В Табл. 9.3 перечислены основные методологические подходы к генотерапии различных опухолей, разработанные и широко используемые уже на современном этапе. Многие из этих подходов вполне приложимы и для борьбы с наиболее серьезными инфекционными заболеваниями, например, со спидом.
Таблица 9.3. Основные методологические подходы в генокоррек- ции онкологических заболеваний.
---------------------------------T-----------------------------¬
¦ П Р И Н Ц И П ¦ ВВОДИМЫЕ ГЕНЫ ¦
+--------------------------------+-----------------------------+
¦1. Повышение иммунореактивности ¦ гены чужеродных ¦
¦ опухоли ¦ антигенов, цитокинов ¦
¦2. Генетическая модификация ¦ гены цитокинов, ¦
¦ иммунных клеток ¦ ко-стимуляторов ¦
¦3. Инсерция генов "чувствитель- ¦ гены тимидин-киназы HSV, ¦
¦ ности" либо генов "самоубийц"¦ цитозин дезаминазы ¦
¦4. Блок экспрессии онкогенов ¦ антисмысловые Ki-ras мРНК, ¦
¦ ¦ гены внутриклеточных антител¦
¦5. Инсерция генов-супрессоров ¦ р53 ¦
¦ опухолей ¦ ¦
¦6. Защита нормальных клеток от ¦ гены лекарственной ¦
¦ химеотерапии. ¦ устойчивости тип 1. ¦
¦7. Индукция синтеза противоопухо¦ гены интерлейкина-2, ¦
¦ левых в-в нормальными клеткам¦ интерферона ¦
¦8. Продукция противопухолевых ¦ вакцины типа БЦЖ, экспресси-¦
¦ рекомбинантных вакцин. ¦ рующей опухолевой антиген ¦
¦9. Локальная радиопротекция нор-¦ гены трансферазы, ¦
¦ мальных тканей с помощью ¦ глутатион синтетазы ¦
¦ антиоксидантов. ¦ ¦
L--------------------------------+------------------------------
Подробный анализ используемых при этом подходов и ре- зультаты первых клинических испытаний выходит за рамки наше- го изложения. Однако, материал этот настолько интересный и многообещающий, что мы позволим себе на нескольких примерах охарактеризовать основные принципы построения таких геноте- рапевтических программ.
Как упоминалось ранее (см. 9.1), перенос гена в орга- низм человека был осуществлен в 1989 году в большей степени в исследовательских, а не в терапевтических целях. Это был маркерный прокариотический ген neo, сообщающий клеткам ус- тойчивость к неомицину. Он был введен пациенту, страдающему злокачественной меланомой, в составе трансдуцированных
TIL-клеток (Т -лимфоцитов, полученных из опухолевых тканей больного). В 1986г. вскоре после идентификации этого нового класса иммунных клеток, была предпринята попытка лечения ме- ланомы путем аутологичной внутривенной инфузии TIL-клеток, предварительно выделенных из опухолей пациентов и интенсивно наращиваемых in vitro в присутствии ростового фактора IL-2.
Примерно у трети пациентов лечение оказалось эффективным, хотя в последующем наблюдали значительное число рецидивов заболевания. Для анализа причин терапевтического эффекта TIL
-клеток и совершенствования методики лечения меланомы необ- ходимо было исследовать устойчивость вводимых T-лимфоцитов и их миграцию в организме больного. С этой целью была произве- дена маркировка используемых для лечения TIL-клеток путем их трансдукции в культуре ретровирусным вектором, несущим ген neo, с последующим отбором неомицин-устойчивых клонов и вы- ращиванием их на среде G418. Результаты исследований показа- ли, что реинфузированные G418-устойчивые TIL-клетки действи- тельно проникают в опухоль и могут быть обнаружены там в не- большом количестве даже спустя 9 недель после введения. Най- дены отличия субпопуляции T-лимфоцитов в опухоли от общей популяции инфузированных TIL-клеток.
После успешного испытания переноса маркерного гена neo в опухолевые ткани путем аутологичной реинфузии трансфециро- ванных T-лимфоцитов лечение меланомы было дополнена введени- ем в вектор мышиного гена, контролирующего продукцию, так называемого фактора некроза опухоли - TNF. Предолагалось, что локальная секреция этого токсичного для клеток белка в опухолевых тканях будет способствовать формированию иммунно- го ответа. Опасность данной терапевтической процедуры обус- ловлена возможностью разрушения TIL-клеток в печени, мозге и легких. Поэтому экспрессия TNF-гена под гетерологичным про- мотором может оказать сильный токсический эффект в этих ор- ганах. Первые клинические испытания описанной схемы лечения начаты в январе 1991 года в Национальном Институте Здоровья
(NIH) США.
Другая программа генной терапии, предложенная для лече- ния меланом, основана на стимуляции противоопухолевого имму- нитета, опосредованного T-лимфоцитами. Для этого в изолиро- ванные опухолевые клетки пациента вводят TNF- или IL2-ген или какие-либо другие гены, секретирующие цитокины, и затем проводят иммунизацию пациента путем подкожного введения трансдуцированных клеток. Эта процедура сама по себе может привести к рассасыванию первичной опухоли или может быть ис- пользована для изоляции более эффективных TIL-клеток из лим- фоузлов, вблизи от места инъекции. Подобная иммунизация мо- жет быть рекомендована для предотвращения рецедивов у паци- ентов, подвергавшихся другим курсам противоопухолевой тера- пии. Первая попытка прямого переноса гена в опухолевые клет- ки пациента без их предварительной изоляции также была предпринята с целью формирования иммунного ответа против злокачественной меланомы. Процедура включала прямую иньекцию в опухоль липосом-плазмидного комплекса с геном, контролиру- ющим отсутствующий у пациента антиген гистосовместимости
HLA-B7. Другой тип модификации опухолевых клеток основан на введении в них гена тимидинкиназы Герпеса. Использованный в работе ретровирусный вектор обеспечивал включение генной конструкции только в активно пролифирирующие клетки, каковы- ми и являются клетки опухоли. Впервые эта схема была апроби- рована при лечении карциномы яичника. После интраперитоне- альной аутологичной иньекции трансдуцированных клеток злока- чественной карциномы пациентам назначали противогерпесный препарат - ганцикловир, избирательно убивающий клетки, экс- прессирующие ген вирусной тимидин-киназы. Противоопухолевый эффект был обусловлен летальным действием токсина, образую- щегося в модифицированных клетках и последующей иммунной ре- акцией организма на опухолевые клетки.
Подходы, используемые для лечения вирусных инфекций пу- тем введения в организм человека специфических нуклеиновых кислот, очень разнообразны и основаны на детальном исследо- вании молекулярных механизмов взаимодействия инфецирующих агентов с клетками-хозяина. Мы лишь коротко перечислим ос- новные принципы, используемые при разработке соответствующих медицинских протоколов. Наибольшее количество противовирус- ных программ генной терапии предложено в рамках борьбы со спидом, хотя аналогичные методы разрабатываются для лечения гепатита, цитомегаловирусных, герпесных и иных вирусных ин- фекций. Одна из первых таких программ была направлена на разрушение регуляторных механизмов репликации вируса иммуно- дефицита - HIV, путем введения в T-лимфоциты от 20 до 50 ко- пий TAR-гена, кодирующего активирующий элемент, критический для переключения генетической программы клетки на вирусную репликацию. Другая программа включала введение в T-лимфоциты гена CD4 вирусного антигена для специфического связывания
HIV и выведения его в русло крови. Ряд программ основаны на введении в T-клетки условно летальных генов, таких как ген вирусной тимидинкиназы, с тем, чтобы предотвратить нежела- тельные побочные эффекты в случае неконтролируемого размно- жения этих клеток или слишком сильного их действия на
HIV-инфецированные клетки. Одним из направлений повышения эффективности терапевтического использования T-лимфоцитов для лечения спида является направленная модификация ex vivo генов главного комплекса гистосовместимости и конструирова- ние на этой основе "универсальных донорских" клеток. Так, лишенные HLA-маркеров гетерологичные модифицированные
T-клетки могут быть трансплантированы пациентам без опасения иммунологической несовместимости. Подобный подход может ока- заться эффективным при необходимости гетерологичной транс- плантации в терапевтических целях любых типов клеток. Прин- ципиально иным способом борьбы с вирусными инфекциями явля- ется введение в пораженные ткани антисмысловых последова- тельностей, способных гибридизоваться с вирусами и, таким образом, их нейтрализовывать (Cohen, Hogan, 1994; Wagner,
1994). Адресность доставки таких последовательностей может быть достигнута путем их комплексирования с соответствующими белковыми лигандами (см. 9.4.2).
Раздел 9.7. Некоторые этические и социальные проблемы генной терапии.
Появление принципиально новых технологий, позволяющих активно манипулировать с генами и их фрагментами, обеспечи- вающими адресную доставку новых блоков генетической информа- ции в заданные участки генома, совершило революцию в биоло- гии и медицине. Как следует из вышеизложенного, сам ген все чаще начинает выступать в качестве лекарства, применяемого для лечения не только моногенных, но и многих других, в том числе и значительно более распространенных недугов (опухоли, инфекции). Не за горами применение генотерапии и для борьбы с мультифакториальными заболеваниями (сердечно-сосудистые, психические, эндокринологические и многие другие). Уже сей- час, на современном уровне наших знаний о геноме человека теоретически вполне возмножны такие его модификации путем генной трансфекции, которые могут быть предприняты с целью улучшения ряда физических (например, рост), психических и интеллекуальных параметров. Таким образом, современная наука о человека на своем новом витке развития вернулась к идее
"улучшения человеческой породы", когда-то постулированной выдающимся английским генетиком Фрэнсисом Гальтоном и разви- той его учениками и последователями (Карл Пирсон, Лионель
Пенроуз, Дж.Халдэйн и мн.др.). Дальнейший ход истории, как известно, полностью дискредитировал саму идею "улучшения" человеческой породы. Однако, грядущее "всевластие" человека над собственным геномом заставляет вновь и вновь возвращать- ся к этой теме, делают ее предметом постоянных оживленных дискуссий в широкой и научной печати (Ledley, 1987; Ander- son, 1992; Wivel, Walters, 1993; Culver,1994). Развернувшая- ся в этой связи дискуссия позволяет подвести некоторые итоги и сделать определенные прогнозы.
Уже сейчас не вызывает сомнения, что первоначальные опасения, связанные с генной инженерией вообще и генной ин- женерией человека в частности были неоправданны. После мно- голетней дискуссии и всестороннего рассмотрения на разных уровнях было признанным целесообразным применение генной те- рапии для лечения многих заболеваний. Единственным и непре- менным ограничением, сохраняющим свою силу и в современных условиях, является то, что все генотерапевтические мероприя- тия должны быть направлены только на конкретного больного и касаться исключительно его соматических клеток.
По глубокому убеждению основных авторитетов генной те- рапии (Фр.Андерсон, Т.Каски, Фр.Коллинс, Дж.Вильсон и мн.др.), а также согласно существующим регламентациям соот- ветствующих "разрешительных" комитетов по генно-инженерным исследованиям (см. 9.1) современный уровень наших знаний не позволяет проводить коррекцию генных дефектов на уровне по- ловых клеток и клеток ранних доимплантационных зародышей че- ловека. Причина этого - реальная опасность засорения гено- фонда нежелательными искусственными генными конструкциями или внесение мутаций с непредсказуемыми последствиями для будущего человечества.
Вместе с тем, по мере совершенствования методов генной терапии, появления новых технологий, связанных с созданием более эффективных и безопасных векторных систем и более со- вершенных генетических конструкций, стремительным ростом объ- ема информации о структуре генома, картировании новых генов в научной литературе все чаще и все настойчивее раздаются при- зывы к возобновлению дискуссии о целесообразности генокоррек- ции зародышевых и половых клеток человека (Wivel, Walters,
1993; Latchman, 1994).
Основным аргументом в пользу таких вмешательств являет- ся тот вполне очевидный факт, что по мере того как все боль- шее число наследственных заболеваний будет доступно эффек- тивной генной терапии, все большее число особей, гомозигот- ных по летальным мутантным генам, будет накапливаться в по- пуляции. Соответственно, тем реальней будут ситуации, когда оба супруга окажутся гомозиготными носителями мутантного ге- на. В этом случае получение здорового потомства потребует генетического вмешательства уже на ранних стадиях и, возмож- но, будет вполне безопасной и реальной трансфекция гамет или ранних зародышей.
Эксперименты на животных по созданию искусственных био- логических моделей наследственных болезней (см.Главу VIII ), а также первые клинические испытания по доимплантационной диагностике генных болезней (Verlinsky, Kuliev, 1993; см.
Главу VI) убеждают в том, что такой генно-терапевтический подход может быть реальным уже в ближайшем будущем. Вполне естественно, что целесообразность его применения должна оп- ределяться не только генно-инженерными возможностями, но и его социальной значимостью и необходимостью. Вот только не- которые вопросы, которые должны быть решены в рамках предла- гаемой генетиками широкой дискуссии:
Сможет ли в будущем генная терапия обеспечить столь полноценную генокоррекцию, которая не представит угрозы для потомства?
В какой мере полезность и необходимость генотерапевти- ческой процедуры для одной супружеской четы перевесят риск такого вмешательства для всего человечества?
Сколь оправданы будут эти процедуры на фоне грядущего перенаселения планеты ?
Как будут соотноситься генно-инженерные мероприятия на человеке с проблемами гомеостаза общества и биосферы?
Таким образом, генетическая революция апофиозом которой явилась генотерапия не только предлагает реальные пути лече- ния тяжелых наследственных и ненаследственных недугов, но и в своем стремительном развитии ставит перед обществом новые проблемы, решение которых необходимо уже в ближайшем обозри- мом будущем.