Введение

Глутаминовая кислота (α-аминоглутаровая) является одной из важнейших аминокислот растительных и животных белков. Не относится к числу незаменимых, однако, тем не менее, служит основой для синтеза многих физиологически активных соединений, необходимых для нормальной жизнедеятельности человеческого организма. Она обладает очень приятными органолептическими свойствами и потому имеет широкое применение в различных областях.

Важной особенностью глутаминовой кислоты является способность служить защитным фактором при различных отравлениях печени и почек, усиливать фармакологическое действие одних и ослаблять токсичность других лечебных средств, поддерживать наряду с другими аминокислотами постоянную реакцию среды. На этих свойствах и основано лечение ряда заболеваний путем введения в организм глутаминовой кислоты.

Не меньшее значение имеет и мононатриевая соль этой аминокислоты – глутамат натрия. Это соединение усиливает вкус многих пищевых продуктов, а также способствует длительному сохранению вкусовых качеств консервированных продуктов. Это обстоятельство позволяет широко использовать моноглутамат натрия в консервной промышленности, особенно при консервировании овощей, рыбы, мясных продуктов. Во многих зарубежных странах глутамат натрия добавляют абсолютно во все продукты при консервировании, замораживании или просто при хранении. В Японии, США и других странах глутамат натрия является такой же обязательной принадлежностью стола, как соль, перец, горчица и другие приправы. Он повышает не только вкусовую ценность пищевых продуктов, но и стимулирует деятельность пищеварительных желез. В настоящее время производство глутаминовой кислоты стало очень крупным. Ведущее место в этом производстве занимают Япония и США. [1]

1. Характеристика конечной продукции производства

По показателям, определяемым органолептически, техническая L-глутаминовая кислота должна соответствовать требованиям, указанным в таблице 1.

Таблица 1

	Показатели, определяемые органолептически
Наименование показателей	Характеристика
Внешний вид	Кристаллическая масса коричневого цвета
Вкус	Кислый специфический
Запах	Специфический
Растворимость	Легко растворима в разбавленных кислотах, щелочах и горячей воде, трудно растворима в холодной воде и концентрированной соляной кислоте, почти нерастворима в этиловом спирте, эфире и ацетоне

По химическим показателям техническая L-глутаминовая кислота должна соответствовать требованиям, указанным в таблице 2

Таблица 2. Химические показатели

Наименование показателей	Нормы
Массовая доля влаги, %, не более	22,0
Массовая доля L-глутаминовой кислоты (в пересчете на сухое вещество), %, не менее	75,0
Массовая доля хлоридов (СГ) (в пересчете на сухое вещество), %, не более	10,0

В соответствии с требованиями МРТУ 18/210–68 глутамат натрия пищевой должен иметь следующий состав (в%):

Основное вещество, не менее – 94;

Хлорид натрия, не более – 5;

Влага, не более – 1;

Общий азот, не менее – 7,02.

2. Химическая схема производства

Известно несколько способов получения глутаминовой кислоты: гидролиз различных белков, синтез химический, ферментативный из α-кетоглутаровой кислоты и микробиологический.

2.1 Получение глутаминовой кислоты гидролизом белков

Гидролиз протеинов является классическим методом получения аминокислот из природных источников. Для выработки глутаминовой кислоты и ее натриевой соли используются животные и растительные белки: казеин молока, клейковина пшеницы, кукурузный глютен, отходы мясокомбинатов, свеклосахарных (сепарационный щелок) и спиртовых заводов (барда).

Метод гидролиза малопроизводителен и довольно дорог из-за значительного образования побочных продуктов и необходимости тщательной очистки глутаминовой кислоты.

Комплексная переработка мелассы позволяет получить наряду с высококачественными сахарными сиропами глутаминовую кислоту, бетаин, холин и другие ценные продукты. [1]

2.2 Химический синтез глутаминовой кислоты

Среди методов химического синтеза наиболее перспективным является использование в качестве исходного сырья акрилонитрила. Согласно этому методу акрилонитрил в результате реакции гидроформилирования превращается в β-формилпропионнитрил и последний через стадию образования α-аминоглутардинитрила переводится в DL-глутаминовую кислоту.

Основным недостатком химического синтеза является получение рацематов аминокислот. Разделение D- и L-изомеров является довольно сложной операцией и требует больших затрат. [1]

2.3 Ферментативный синтез глутаминовой кислоты

Его возможно осуществить из α-кетоглутаровой кислоты с помощью ферментов трансамилазы или глутаматдегидрогеназы в результате следующих превращений.

В каждом из этих процессов α-кетоглутаровая кислота играет роль предшественника. Для осуществления любого из этих превращений необходимы источники α-кетоглутаровой кислоты и соответствующей ферментной системе. Первую из этих задач решают с помощью подбора микроорганизмов, способных продуцировать значительное количество α-кетоглутаровой кислоты из дступных источников сырья. Продуцентами α-кетоглутаровой кислоты могут быть Psedomonas и Esherichia, а при культивировании продуцента Kluyverd citrophila α-кетоглутаровая кислота была получена с 57%-ным выходом. Дрожжи рода Candida при выращивании на н-парафинах продуцируют α-кетоглутаровую кислоту совместно с пировиноградной в соотношении 6:1. Экономический коэффициент процесса биосинтеза достигает 90% от количества потребленных углеводородов.

В роли продуцента фермента трансамидазы могут выступать различные микроорганизмы, например Е. coll. Донором аминогрупп может быть аспарагиновая кислота или аланин.

Восстановительное аминирование возможно осуществить с помощью Pseudomonas (при использовании Ps. ovalis выход L-глутаминовой кислоты составляет 60%) или Aeromonas, причем некоторые штаммы этих микроорганизмов в качестве субстрата могут использовать D, L,-α-оксиглутаровую кислоту, производимую химическим синтезом.

2.4 Микробиологический синтез глутаминовой кислоты

Наиболее перспективным и широко используемым способом производства глутаминовой кислоты является микробиологический синтез. Впервые о возможности получения L-глутаминовой кислоты непосредственно из углеводов с помощью микроорганизмов методом глубинного культивирования сообщили в 1957 г. Японские ученые Киносита, Асаи и др.

К настоящему времени выяснено, что способностью продуцировать глутаминовую кислоту обладают некоторые расы дрожжей, микроскопические грибы, бактерии. Однако практически только бактерии могут синтезировать глутаминовую кислоту с выходом не менее 40% относительно исходного сахара или другого сырья. Поэтому промышленное значение имеют пока только бактерии, относящиеся к родам Micrococcus, Brevibacterium, Microbacterium, Corynebacterium.

Это, главным образом, палочковидные, грамположительные, неподвижные бактерии, не образующие спор. Специфической для них является обязательная потребность в биотине либо в биотине и тиамине. Сырьем для получения глутаминовой кислоты кроме углеводов могут быть также различные углеводороды, начиная от природного газа (метан, этан) и кончая н-парафинами или ароматическими соединениями (бензиловый спирт пирокатехин и пр.). Могут быть также использованы газойль, уксусная, аминомасляная, фумаровая кислоты и ряд других продуктов.

3. Технологическая схема производства

Имеет много общего со схемой производства лизина. Последовательность этапов и требования, предъявляемые к процессу в целом, очень близки. Основные различия заключаются в свойствах микроорганизма-продуцента, условиях его культивирования, составе среды, стадии очистки.

Схема получения глутаминовой кислоты при использовании в качестве источников углерода глюкозы или гидролизата крахмала представлена ниже.

Принципиальная технологическая схема получения глутаминовой кислоты или глутамата натрия складывается из следующих стадий: получение посевного материала; приготовление питательной среды, ее стерилизация, охлаждение и засев готовым посевным материалом; выращивание продуцента в ферментаторе до накопления максимального количества глутаминовой кислоты; выделение глутаминовой кислоты в кристаллическом виде или в виде кристаллов глутамата натрия, сушка кристаллов, фасовка и упаковка.

4. Характеристика сырья материалов и полупродуктов

Состав питательной среды для главной ферментации и для получения посевного материала в значительной степени зависит от используемого продуцента, от его физиологических особенностей. Основным источником углерода в среде чаще всего используются глюкоза, сахароза, гидролизаты крахмала, свекловичная меласса, гидрол. Количество усваиваемого сахара в пересчете на сахарозу должно быть в пределах от 8,5 до 25%. Но следует помнить, что пределы использования мелассы определяются уровнем в ней биотина. Концентрация биотина, по данным большинства исследователей, не должна превышать 2–5 мкг на 1 л питательной среды, иначе вместо глутаминовой кислоты будут интенсивно накапливаться аланин, молочная, янтарная, аспарагиновая кислоты, резко возрастет прирост биомассы продуцента, но снизится выход глутаминовой кислоты. Иными словами, максимум биосинтеза глутаминовой кислоты не совпадает с максимумом образования биомассы, так как потребность в биотине для этих двух процессов различна. Помимо мелассы биотин в среду может быть внесен и с кукурузным экстрактом.

Ингибирующее влияние биотина удается снизить при включении в состав питательных сред различных добавок в виде некоторых спиртов, ПАВ, антибиотиков (пенициллинов, тетрациклинов). Вероятно, это связано с изменением липидного состава клеточных мембран, что способствует увеличению проницаемости клеточных мембран для глутаминовой кислоты. Присутствие такого рода стимуляторов позволяет вести ферментацию с большим выходом глутаминовой кислоты при повышенных концентрациях биотина. Добавки в среду ПАВ в количестве 0,01–0,2% или калиевой соли бензилпенициллина повышают биосинтетическую способность продуцента на 15–45% и выход глутаминовой кислоты достигает 50г/л. [2]

В качестве источника азота в питательных средах чаще всего используют мочевину в количестве до 1,5–2,0% в зависимости от особенностей используемого штамма, но вводится она дробно, по мере потребления ее из среды, и так, чтобы содержание ее в культуралыюй жидкости не превышало 0,8% и рН среды было в пределах от 6,8 до 7,8.

Недостаток азота в среде приводит к снижению синтеза глутаминовой кислоты и к накоплению в среде повышенных количеств α-кетоглутаровой кислоты.

Для нормального роста культуры и образования ею глутаминовой кислоты необходимо вводить в среду соли калия в виде КН2РО4 до 0,1-

для поддержания рН среды на оптимальном уровне – около 7–7,2. Длительность культивирования зависит от содержания сухих веществ в среде, способа введения компонентов среды (единовременно или дробно), степени аэрации среды и, конечно, от физиологических особенностей продуцента. [2]

5. Изложение технологического процесса

5.1 Приготовление питательной среды

Для промышленных штаммов Coryn. glutamicum питательные среды при производстве посевного материала, как правило, содержат следующие компоненты (в%) [2]:

Таблица 3

Состав питательной среды (в%)
Меласса	8
Кукурузный экстракт	0,3
Хлорид аммония	0,5
Калия фосфат двухзамещенный	0,05
Сульфат магния	0,03
Вода	остальное
рН среды	7,0–7,2

Питательные среды на стадии биосинтеза содержат те же компоненты и в том же количестве, только вместо кукурузного экстракта и сульфата аммония присутствует до 2% мочевины, содержание мелассы увеличивают до 20%, дополнительно вводят мел до 1% и 0,1% синтетического пеногасителя. [2]

5.2 Стерилизация питательной среды, аппаратов и коммуникаций

Подготовку ферментаторов (инокуляторов) к работе начинают с промывки использованного оборудования горячей и холодной водой с последующей обработкой аппаратов и коммуникаций острым паром. Стерилизацию питательных сред осуществляют традиционным способом, так же как и подготовку технологического воздуха. Растворяемые компоненты среды нагревают до определенной температуры, затем выдерживают при этой температуре с последующим охлаждением до температуры ферментации.

Питательная среда для выращивания продуцентов глутаминовой кислоты состоит из мелассы, кукурузного экстракта или другого источника ростовых веществ, мела и пеногасителя. Питательная среда готовится и стерилизуется в две стадии с учетом свойств компонентов, входящих в ее состав. Стадия подготовки и стерилизация среды состоят из смешивания компонентов питательной среды в определенной пропорции с помощью специальных дозаторов в реакторе, растворения солей при перемешивании, нагрева до температуры стерилизации, выдержки при этой температуре в течение 1 часа и охлаждения до температуры, при которой проводится культивирование продуцента глутаминовой кислоты.

Термолабильные компоненты среды, например мелассу, содержащую сахарозу стерилизуют отдельно. В реактор, снабженный мешалкой, подают мелассу и нагревают ее при постоянном размешивании до температуры 80°С, с периодическим добавлением к раствору определенного количества воды. Собственно стерилизацию осуществляют путем быстрого разогрева полученного раствора глухим паром до 120–122°С в специальном аппарате и выдерживают при этой температуре определенное время, необходимое для полной гибели всей микрофлоры. Охлажденный раствор сжатым стерильным воздухом передают в предварительно подготовленный ферментатор. Температура стерилизации мелассы выше, а длительность значительно меньше, чем те же параметры при стерилизации остальных компонентов среды.

Пеногаситель, используемый на стадиях культивирования продуцента в посевном аппарате и основном ферментере, особенно в том случае, когда им является масло или жир, стерилизуется отдельно. Режимы стерилизации (температура и длительность) при обработке пеногасителя более жесткие, чем это принято для стерилизации любых питательных сред.

Процесс получения глутаминовой кислоты требует строгих асептических условий, и поэтому особое внимание уделяется стерилизации не только среды, но и всех реакторов, коммуникаций, подаваемого воздуха.

При стерилизации аппаратуры режимы стерилизации зависят главным образом от материала, из которого изготовлено оборудование и его отдельные узлы. Наибольшая эффективность стерилизации аппаратуры и коммуникаций наблюдается при применении острого пара, имеющего температуру 135–140°С. Но отдельные блоки аппаратов, в том числе датчики измерительных приборов, не выдерживают таких условий стерилизации, и потому в этих случаях могут применяться «холодные» способы стерилизации. Для такой обработки могут быть использованы бактерицидные газы (этилен) и растворы химических реагентов (формалина, смеси цитилпиридинового бромида и этанолмеркурихлорида в соотношении 2:1, различные производные фенола и их смеси, аммонийные соли первичных и вторичных алкилсульфатов, хлорсодержащие соединения, |3-пропиоллактон и т.д.).

Степень стерильности среды, оборудования и коммуникаций может быть проверена. Простерилизованную среду или смывы, произведенные стерильной водой с внутренних поверхностей аппаратов и трубопроводов, высевают на агаризованные или жидкие питательные среды и инкубируют в термостате сутки. Если среды остаются стерильными, то стерилизация проведена качественно. Такой анализ проводится при пуске завода, в случае появления инфекции и периодически в профилактических целях. [2]

5.3 Приготовление исходной и посевной культуры

Посевной материал на каждой из стадии его получения (от пробирок до посевного аппарата) выращивают в строго асептических условиях по 24 ч. Состав питательных сред незначительно меняется при переходе от одного штамма к другому и практически остается постоянным на каждой из промежуточных стадий получения посевного материала. Только при выращивании продуцента в посевном аппарате в питательную среду вносят до 0,1% стерильного синтетического пеногаситсля.

Накопление биомассы до 6–8 г. АСВ на 1 л среды производят в аэробных условиях сначала в инокуляторах объемом 2 м3, потом в посевных аппаратах объемом 5 м. Полученный посевной материал в количестве 5–6% (от объема среды производственных аппаратов) стерильно передают в основные ферментаторы на 50 м3. Коэффициент заполнения аппарата 0,7. [2]

5.4 Выращивание продуцента в ферментаторе

Процесс биосинтеза осуществляют в строго асептических условиях в ферментаторах объемом 50 м3 с коэффициентом заполнения аппарата 0,7 в течение 48–52 ч и интенсивной аэрации [80–85 мг Ог/(л-мин)], что соответствует расходу 1 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мин. Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной на уровне 28–30°С. В конце процесса биосинтеза готовая культуральная жидкость содержит до 45 г./л глутаминовой кислоты. Выход глутаминовой кислоты по отношению к потребленным сахарам составляет 45–50%.

Поскольку производство глутаминовой кислоты направлено на получение высокоочищенных препаратов, последующая технологическая схема предусматривает производство продуктов, подготовленных непосредственно к применению в качестве пищевых добавок и в виде лекарственных форм.

Выделение глутаминовой кислоты из культуральной жидкости и последующая очистка ее в соответствии с требованиями фармакопеи

предполагает такую последовательность проведения технологических операций. [2]

5.5 Предварительная обработка культуральной жидкости

Осуществляется в результате добавления к ней определенного количества негашеной извести (или известкового молока) с последующим осаждением избытка ионов кальция фосфорной кислотой. Образующийся при этом осадок способствует лучшему отделению клеток продуцента и других балластных примесей. [2]

5.6 Отделение биомассы от культуральной жидкости

Проводят центрифугированием или фильтрованием под давлением. [2]

5.7 Осветление фильтрата

Состоит в очистке его от пигментных примесей, окрашивающих нативный раствор в темный цвет. Для этого обрабатывают фильтрат активированным углем или подвергают его ионообменной сорбции на анионите ИА-1. [2]

5.8 Концентрирование осветленного раствора глутаминовойкислоты

Проводят путем его вакуум-выпаривания при температуре 40–60 °С, при этом из исходного раствора глутаминовой кислоты отгоняют от 50 до 80% воды. [2]

5.9 Осаждение кристаллов глутаминовой кислоты визоэлектрической точке

Эта стадия осуществляется путем подкисления полученного на предыдущем этапе концентрата соляной кислотой до рН 3,2 (изоэлектрическая точка глутаминовой кислоты) и охлаждения раствора до 4–15°С. Однократное проведение операции обеспечивает кристаллизацию 77% глутаминовой кислоты; при повторном ее проведении выход возрастает до 87%. Чистота получаемых кристаллов достигает 88%.

В результате последующей перекристаллизации чистоту получаемых кристаллов можно увеличить до 99,6%, что удовлетворяет требованиям фармакопеи. [2]

5.10 Отделение кристаллов глутаминовой кислоты отматочника

Это достигается центрифугированием с последующей декантацией и возвратом маточника на стадию вакуум-выпаривания. Полученные кристаллы промывают обессоленной водой и направляют на сушку. [2]

5.11 Сушка кристаллов глутаминовой кислоты

Проводится в вакууме или в токе нагретого воздуха при 60-70°С. [2]

5.12 Получение глутамата натрия

Для получения глутамата натрия влажные кристаллы с содержанием 98–99% глутаминовой кислоты по сухой массе растворяют и нейтрализуют 45–50%-ным раствором NaOH до рН 6,8. Этот раствор концентрируют, и при охлаждении выпадают кристаллы глутамата натрия, которые высушивают. Готовый препарат состоит на 98% из глутамата натрия. Выход готового продукта по глутаминовой кислоте по отношению к ее содержанию в исходной культуральной жидкости составляет 75–80%, максимально достигнутый выход не превышает 90%. [2]

6. Отходы производства и охрана окружающей среды

При производстве L-глутаминовой кислоты, в окружающую среду в составе конденсата и выбросов из ферментера попадают: бутиловый спирт, метилбутиловый кетон, фенол, крезол, пиридин, циклогексиламин, изомасляная кислота, пропионовая кислота и другие вещества.

Технологические стоки и промывные воды, включающие клетки продуцента, аминокислоты и другие компоненты культуральной жидкости, а также следовые количества глутаминовой кислоты, объединяют, упаривают и сушат с наполнителем до остаточной влажности 10%. Получают препарат, который используют как кормовой продукт, он содержит до 40% белковых веществ. [3]

7. Контроль производства

На биосинтез глутаминовой кислоты существенное влияние оказывают степень аэрации среды, перемешивание, рН среды, длительность и температура ферментации, возраст и доза посевного материала. Поэтому на всех стадиях процесса все параметры культивирования строго регламентируются и контролируются (температура, рН, изменение основных компонентов среды, накопление глутаминовой кислоты, аэрация, перемешивание и т.д.).

Уровень рН среды – это очень ответственный параметр процесса. Как известно, продуцентами являются бактериальные штаммы, и потому в большинстве случаев оптимум рН для культивирования лежит в области, близкой к нейтральной или слабощелочной. Для штаммов, используемых в нашей стране, наилучшие результаты по биосинтезу глутаминовой кислоты получаются, если рН среды поддерживается около 7–7,2. Для всех известных продуцентов глутаминовой кислоты рН, обеспечивающей максимальное накопление глутаминовой кислоты и рост культуры, лежит в пределах от 6 до 8,5. [3]

Снабжение растущей культуры кислородом является ответственным и важным фактором, влияющим на рост микроорганизма и образование им лизина. Кислород, используемый бактериальной клеткой, должен быть растворен в питательной среде. Для увеличения растворимости кислорода осуществляют барботирование среды воздухом с одновременным ее перемешиванием.

Контроль за ходом процесса биосинтеза осуществляют на разных этапах его проведения по оптической плотности раствора культуральной жидкости (по содержанию клеток продуцента), по содержанию субстрата в смеси или по сигналам датчиков рН и растворенного кислорода в ферментационной среде. К концу процесса биосинтеза содержание глутаминовой кислоты в культуральной жидкости достигает не менее 45 г./л, концентрация оставшегося субстрата не более 0,5–1,0%. [1]