Москва, 2009

ВВЕДЕНИЕ

Идентификация человека по волосам – одна из важнейших целей судебно-биологической экспертизы. Волосы практически всегда изымаются с места происшествия и часто бывают единственным вещественным доказательством. В настоящее время при исследовании этого объекта доминирует морфометрический метод исследования. При сравнительном исследовании волос, изъятых с места происшествия, и волос подозреваемого лица эксперт выявляет ряд морфометрических признаков (строение сердцевины и кутикулы, особенности пигментации и др.), что позволяет сделать лишь вероятный вывод о принадлежности волос конкретному лицу. Кроме морфометрического метода можно использовать серологический метод определения групповой принадлежности волос по системе АВ0, а при наличии луковицы волоса определять его половую принадлежность и фенотип фермента фосфоглюкомутазы. Однако эти методы не позволяют идентифицировать конкретного человека по волосам, оставленным на месте происшествия.

С этой целью необходимо использовать новый метод исследования волос - метод определения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Известно, что метод определения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов молекулы ДНК с применением цепной реакции полимеризации (амплификация) позволяет увеличивать количество фрагментов выделенной из объекта ДНК в сотни тысяч раз, что делает возможной идентификацию микроследов биологического происхождения, содержащих хотя бы одну ядерную клетку. При выделении ДНК из пятен крови не возникает тех проблем, что при выделении ДНК из волоса. Количество ядерных клеток (лимфоцитов) даже в небольшом пятне крови достаточно велико, волосы содержат существенно меньшее количество ДНК. Особенно мало ДНК в фолликулах выпавших волос (в 10 - 20 раз меньше, чем в живых) и в стержнях волос. В связи с этим специальные методы экстракции ДНК из волос являются важной проблемой и в значительной степени облегчают процесс идентификации волос.

Число зарубежных публикаций по этому вопросу не велико [1 - 3]. Описаны три варианта метода экстракции ДНК из волос: гидролиз ядер клеток луковицы волоса и амплификация без предварительной очистки, очистка гидролизата фенольным методом и с помощью ионообменной смолы Chelex.

Волосы, изъятые с места происшествия, могут либо иметь, либо не иметь целую волосяную луковицу, а также отдельные клетки (остатки) луковицы. Волосы могут быть вырванными, выпавшими или срезанными. Основное количество ДНК в волосе содержится в волосяной луковице, и исследование такого волоса значительно проще, чем исследование стержня волоса без луковичной части.

В настоящей работе описаны две методики выделения ДНК из волоса. Методики модифицированы и апробированы авторами в многочисленных исследованиях на экспериментальных и экспертных образцах волос человека, различающихся по размеру, цвету, наличию клеток луковицы, срокам хранения.

Одна методика проста, но может быть использована только при наличии луковицы вырванного волоса. Вторая методика позволяет выделять ДНК также прикорневой стержневой части волоса и усложнена специальным способом концентрирования и очистки выделенной ДНК перед амплификацией. Оценку количества и эффективности очистки выделенной ДНК определяли методом полимеразной цепной реакции. Процесс оптимизации этой реакции для исследования ДНК волоса не входил в задачи данной работы.

ОСНОВЫ СТРОЕНИЯ ВОЛОСА, МИКРОСКОПИРОВАНИЕ ОБЪЕКТА

Прежде чем приступить к выделению ДНК из исследуемого волоса, необходимо провести его микроскопирование и установить наличие или отсутствие луковицы волоса, а также по виду луковицы определить, живой или отмерший волос представлен на исследование. Кроме этого, в некоторых случаях микроскопирование позволяет установить наличие определенных загрязнений на волосе. Особенно принципиальным является наличие на волосе клеток крови или спермы (других выделений), что может исказить результат определения генотипа ДНК волоса. Загрязненные волосы особенно тщательно моют (см. ниже).

Известно, что волосы, являясь производными кожи, состоят из корня, расположенного в дерме, и стержня, выходящего на поверхность кожи через волосяную воронку. Корень волоса окружен эпителиальными оболочками - это фолликулы волоса. Расширенная часть фолликула называется луковицей волоса. Луковицы вырванного и выпавшего волос различаются по внешнему виду (рис. 1). Больше всего ядерных клеток содержится в луковице волоса, из которой можно выделить достаточное количество ядерной ДНК. Стержень волоса состоит из кутикулы (ороговевшие клетки), коркового слоя (кератиновые структуры) и сердцевины (фибриллярная система).

При исследовании ДНК волос, как показал анализ опубликованных данных, большое значение имеет наличие и количество пигмента волос - меланина. Показано, что меланин ингибирует реакцию амплификации и ее положительный результат зависит от соотношения в образце количества выделенной ДНК и количества меланина.

Меланин содержится в основном в сердцевине волоса и может быть в виде гранул или в диффузном состоянии. Меланины являются полимерами хиноидных соединений и образуются при ферментативном окислении тирозина. Волосы черного цвета содержат эумеланин, имеющий в структуре азот, для волос желтого и красного цвета характерен феомеланин. Меланин в эпителиальных клетках коркового слоя волос образует с белком волос - кератином мелано-кератиновые комплексы, которые имеют повышенную химическую устойчивость по сравнению с кератинами непигментированных волос. Эффект ингибирования реакции амплификации меланином имеет место, как правило, при исследовании ДНК стержня волоса и зависит от его цвета. Однако в описанной ниже методике действие меланина не учитывается, так как экстрагированная ДНК дополнительно очищается, в том числе и от основного количества меланина, с помощью специального устройства для концентрирования и очистки ДНК "Центрикон-100" (далее по тексту "Центрикон-100").

Микроскопирование волоса проводят без применения каких-либо химических реагентов, а именно без фиксации лаком, использования просветляющих жидкостей и т. п. Волос помещают на предметное стекло, добавляют 1 - 2 капли воды, накрывают покровным стеклом и микроскопируют при увеличении 200ґ, 400ґ. Устанавливают наличие или отсутствие целой луковицы. При отсутствии целой луковицы определяют наличие отдельных эпителиальных клеток фолликула волоса, а при отсутствии эпителиальных клеток необходимо установить наличие прикорневой части стержня волоса. В стержне волоса основное содержание ядерных клеток локализовано в прикорневой части. На периферическом конце волоса ядерных клеток нет. Выделение ДНК из перифирического конца волоса рекомендуется использовать как отрицательный контроль для проверки отсутствия загрязнения биологическими примесями.

Кроме того, микроскопированием определяют наличие биологических загрязнений волоса (кровь, сперма, другие выделения), цвет волоса или его искусственную окраску.

ПОДГОТОВКА ВОЛОСА К ИССЛЕДОВАНИЮ, ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ВЫДЕЛЕННОЙ ДНК

Перед началом работы образцы исследуемых волос моют в дистиллированной воде 1 ч при легком покачивании (на качалке, на магнитной мешалке и т. п.). Волосы, загрязненные кровью, спермой или слюной, моют в 1% водном растворе глицина 1 ч при покачивании, затем ополаскивают дистиллированной водой. Глицин, являясь слабым детергентом, повышает растворимость белков и способствует их отмыванию. Кроме того, отмыванию волос от биологических примесей способствует их предварительное выдерживание (1 - 2 ч) при низкой температуре (-20 ё -70 °С), а также в растворе абсолютированного спирта.

Основным критерием того или иного метода экстракции ДНК из волос, как и из других источников, служит количественный выход хорошо очищенной ДНК. Известно, что концентрация ДНК, выделяемой из луковичной части вырванных живых волос, может достигать 200 нг на один волос. В то же время содержание ДНК в фолликулах выпавших волос с отмершей луковицей уменьшается до 10 - 20 нг. Содержание же ДНК в стержневой части волоса практически невозможно измерить известными в настоящее время методами, в том числе методом УФ-спектроскопии или флуориметрии.

В данной работе эффективность метода экстракции ДНК оценивали путем проведения реакции амплификации на мини-сателлиты с парой праймеров системы Д1 S80, дающей после проведения амплификации специфические ДНК-фрагменты размером от 400 до 800 пар оснований.

Амплификацию проводили в следующем режиме:

94 °C - 4 мин;

94 °C ь

60 °C э 30 циклов по 1 мин;

72 °C ю

72 °C - 8 мин.

Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия, нанося по 25 мкл реакционной смеси, визуализировали в УФ-свете и документировали фотографированием. В качестве контроля амплификации использовали фрагменты ДНК с известной молекулярной массой.

Положительный результат реакции амплификации указывает на высокую степень очистки исследуемой ДНК. Особенно это важно при выделении ДНК из стержня волоса, содержащего много меланина. Известно, что значительное количество соединений различной химической природы способны ингибировать реакцию амплификации и даже полностью блокировать синтез ДНК в процессе амплификации. Процесс ингибирования ПЦР носит ярко выраженный концентрационный характер, т. е. увеличение концентрации ингибитора приводит к уменьшению выхода целевого продукта амплификации. Меланин полностью ингибирует ПЦР в концентрации 15 нг в 100 мл реакционной смеси. В хорошо очищенном экстракте не должно быть ингибирующего действия меланина.

МЕТОДИКА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ СТЕРЖНЯ ВОЛОСА

Методика используется при исследовании всех вариантов волос, в том числе и волоса, не имеющего луковичной части. При отсутствии луковичной части волоса исследуют прикорневую часть стержня волоса длиной не менее 3 см и не более 10 см. Последовательность выполнения методики:

1. Волос микроскопируют и отмывают (как описано выше).

2. Волос режут на кусочки длиной около 1 см и помещают в пробирку "Эппендорф" (V = 1,5 мл).

3. В пробирку с волосом добавляют 500 мкл буфера I, 20 мкл 1 М ДТТ и 15 мкл раствора (10 мг/мл) протеиназы К. Пробирку помещают в термостат и выдерживают при температуре 56 °С в течение 6 ч. В процессе выдерживания волос частично растворяется.

4. Пробирку помещают на вортекс (прибор для встряхивания) и встряхивают 30 с при средней скорости.

5. Затем к раствору в пробирке добавляют 20 мкл 1 М ДТТ и 15 мкл раствора (10 мг/мл) протеиназы К. Пробирку помещают в термостат и выдерживают при температуре 56 °С в течение 12 ч (ночь), после чего волос полностью растворяется.

6. Пробирку вновь помещают на вортекс и встряхивают 30 с при средней скорости, затем центрифугируют 1 мин при 10 000 - 15 000 об/мин. После центрифугирования продукты лизиса волоса переходят в супернатант.

7. Супернатант отбирают в чистую пробирку "Эппендорф", добавляют 600 мкл смеси фенол-хлороформ, закрывают крышкой, помещают на вортекс и перемешивают 15 с на средней скорости, а затем центрифугируют 3 - 5 мин при 10 000 - 15 000 об/мин. Наблюдают разделение на две фазы: верхняя водная фаза содержит выделяемую ДНК, нижняя – фенол-хлороформ.

8. Верхнюю водную фазу переносят в чистую пробирку "Эппендорф" (V = 1,5 мл) и добавляют 500 мкл водонасыщенного н-бутанола с целью удаления остатка фенол-хлороформа, который может повредить мембрану "Центрикона-100". Помещают на вортекс, встряхивают 15 с на средней скорости и центрифугируют 1 мин при 10 000 - 15 000 об/мин при комнатной температуре. Водная фаза собирается на дне пробирки, верхний слой – удаляют.

9. "Центрикон-100" собирают по соответствующей инструкции и согласно рис. 3.

10. Нижнюю водную фазу, содержащую экстракт ДНК, фильтруют и концентрируют на "Центриконе-100", фильтрующем примеси с молекулярным весом более 100 000 дальтон. При данной фильтрации меланин волос и его производные, как более низкомолекулярные, проходят через мембрану "Центрикона-100".

11. Добавляют 1,5 мл ТЕ-буфера в верхний резервуар колонки "Центрикона-100". Сверху добавляют около 500 мкл экстракта ДНК. Пробирку закрывают парафильмом и, не касаясь раствора, прокалывают парафильм в нескольких местах тонкой чистой иглой. Центрифугируют на центрифуге с фиксированным углом ротора. Необходимо пересчитать скорость центрифугирования для используемой центрифуги в об/мин так, чтобы она составляла 1000g. Ниже приведена формула пересчета. Нельзя центрифугировать со скоростью более 1000g, во избежание повреждения мембраны "Центрикона-100". Время центрифугирования подбирают опытным путем так, чтобы ДНК сконцентрировалась в объеме 4 - 6 мкл, обычно не более 20 мин при комнатной температуре. После центрифугирования удаляют содержимое нижнего резервуара.

12. В верхний резервуар колонки "Центрикона-100", где концентрируется раствор ДНК в объеме 4 - 6 мкл, добавляют 2 мл ТЕ-буфера и повторяют фильтрацию 2 раза (закрыть парафильмом, проколоть его иглой, центрифугировать со скоростью 1000 g при комнатной температуре до объема 4 - 6 мкл ~20 мин, удалить содержимое нижнего резервуара, добавить 2 мл ТЕ-буфера и т. д.).

13. Профильтровав раствор ДНК 3 раза через мембрану "Центрикона-100", очистив его таким образом от примесей с молекулярным весом ниже 100 000 дальтон и сконцентрировав ДНК в заданном объеме (4 - 6 мкл), переносят раствор ДНК из верхнего резервуара в колпачок "Центрикона-100", который присоединяют к колонке верхнего резервуара и переворачивают. Центрифугируют 5 мин со скоростью 1000g при комнатной температуре. Все операции по фильтрации ДНК проводят с соблюдением максимально возможной чистоты и стерильности.

14. В колпачке "Центрикона-100" собирается выделенная ДНК, готовая к проведению ПЦР. Образец можно хранить при температуре –20 °С.

Для проведения ПЦР берут 4 - 6 мкл супернатанта при суммарном объеме реакционной смеси ПЦР 25 мкл.

Формула пересчета скорости вращения ротора центрифуги при использовании "Центрикона-100":

g = 118 Ч 10-7 Ч n2 Ч r;

где g - центрифужное поле (g=1000);

r - радиус, см (расстояние от центра ротора до оси вращения колонки фильтра, измеряется эмпирически для используемой центрифуги);

n - скорость вращения ротора, об/мин (задается на центрифуге).

Приготовление растворов для выделения ДНК из стержня волоса

Ниже приводятся прописи шести растворов, которые готовят предварительно и затем используют при составлении смесей растворов, необходимых для данного метода. При приготовлении растворов используют деионизированную воду.

Раствор № 1. 1 М раствор трис-HCl, pH 7,5 (1 л):

растворить 121,1 г трис-HCl в 800 мл воды, довести pH раствора до 7,5 концентрированной соляной кислотой (приблизительно 65 мл), добавить воду до объема 1 л.

Раствор № 2. 0,5 М раствор ЭДТА, рН 8,0 (1 л):

растворить 186,1 г двузамещенной соли ЭДТАґ2Н2О в 800 мл воды, довести рН раствора до 8,0 едким натром (динатриевая соль ЭДТА не растворяется до тех пор, пока рН раствора не будет 8,0), добавить воду до объема 1 л. Хранить при комнатной температуре.

Раствор № 3. 5 М раствор NaCl (1 л):

растворить 292,2 г NaCl в 800 мл воды и довести объем раствора до 1 л. Разлить по 100 мл.

Раствор № 4. 20% раствор натрия додецилсульфата SDS (100 мл):

растворить 20 г SDS в 80 мл воды при 60 °С, довести объем раствора до 100 мл.

Раствор № 5. 1 М раствор ацетата Na, рН 5,2 (100 мл):

растворить 13,6 г CH COONaґ3H2O в 80 мл воды, довести рН раствора до 5,2 уксусной кислотой (примерно 2 мл), добавить воду до объема 100 мл.

Раствор № 6. 1 М раствор трис-НСl (1 л):

растворить 121,1 г трис-HCl в 800 мл воды, довести рН раствора до 8,0 концентрированной соляной кислотой (приблизительно 45 мл), добавить воду до объема 1 л.

С помощью растворов № 1 - 6 готовят следующие смеси, используемые в методике:

Буфер 1.

10 мМ трис-НСl, рН 7,5;

10 мМ ЭДТА;

50 мМ NaCl;

2% SDS.

Смешать 1 мл 1 М трис-НСl (рН 7,5), 2 мл 0,5 М ЭДТА, 1 мл 5 М NaCl, 10 мл 20% SDS и 86 мл воды. Хранить при температуре 4 °С.

1 М ДТТ.

Растворить 770 мг детиотреитола в 5 мл воды и добавить 50 мкл 1 М ацетата натрия. Хранить в аликвотах не более 200 мкл при температуре –20 °С.

10 мг/мл протеиназа К.

Растворить 10 мг протеиназы К в 10 мл воды. Хранить в аликвотах не более 200 мкл при температуре –20 °С.

Фенол-хлороформ.

Смешать10 частей фенола, насыщенного 1 М трис-НСl (рН 7,5), с 9 частями хлороформа. Хранить при температуре 4 °С не более двух месяцев, в темной емкости.

н-Бутанол.

Добавить 100 мл воды к 100 мл н-бутанола, перемешать. Бутанол находится в верхней фазе. Хранить при температуре 4 °С.

ТЕ-Буфер.

10 мМ трис-НСl, рН 8,0;

0,1 мМ ЭДТА.

Смешать 10 мл 1 М трис-НСl (рН 8,0) с 200 мкл 0,5 М ЭДТА и 990 мл воды. Хранить при температуре 4 °С.

МЕТОДИКА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ЛУКОВИЦЫ ВОЛОСА

Данная методика используется при исследовании волоса, на корневой части которого присутствуют влагалищные оболочки; это, как правило, бывает у вырванных жизнеспособных волос (см. рис. 1). Используют 20% взвесь ионообменной смолы Chelex, приготовленную в стерильной дистиллированной воде. Принцип метода заключается в гидролизе, "растворении" волоса при кипячении с ионообменной смолой Chelex, которая сорбирует различные примеси, и в том числе примеси белков.

Волос микроскопируют, отмывают (как описано выше), отрезают луковицу волоса с 2 - 3 мм стержня и помещают в пробирку "Эппендорф". В пробирку добавляют 100 мкл 20% взвеси ионообразной смолы Chelex. Выдерживают в термостате при температуре 56 °С в течение 12 ч (ночь). Встряхивают 5 - 10 с на вортексе при высокой скорости. Затем помещают пробирку с волосом в кипящую воду на 8 мин. Волос должен быть полностью погружен в раствор. Опять помещают на вортекс для встряхивания в течение 5 -10 с при высокой скорости.

Гидролизат волоса центрифугируют 2 - 3 мин при 10 000 - 15 000 об/мин. Супернатант используют для постановки реакции ПЦР. В реакцию берут не более 15 мкл образца при суммарном объеме реакционной смеси ПЦР 25 мкл.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При разработке методики выделения ДНК из волоса с использованием ионообменной смолы Chelex исследовали многочисленные образцы волос, различающихся по длине, цвету, срокам хранения, наличию большего или меньшего количества эпителиальных клеток луковицы, загрязнению волос биологическими примесями (кровь, сперма и др.). Преимуществом данной методики является простота ее использования. Волос выдерживают во взвеси ионообменной смолы Chelex в термостате в течение 12 ч (ночь) и затем в течение ~15 мин (8 мин кипятят) получают гидролизат волоса, содержащий очищенный раствор ДНК, готовый к амплификации. На получение положительного результата (выделенная ДНК амплифицирована) не влияют такие факторы, как длина, цвет, сроки хранения волос. Недостатком методики является необходимое наличие луковицы волоса, что сужает круг исследования волос, поступающих на экспертизу. Волосы, имеющие загрязнение биологическим материалом, требуют специальной обработки раствором глицина и параллельного контрольного исследования периферического конца стержня волоса.

Методика выделения ДНК путем хлороформ-фенольной экстракции и последующих концентрирования и фильтрации экстракта на "Центриконе-100" является более совершенной и более трудоемкой. С использованием этой методики возможно исследовать различные образцы волос, в том числе и стержень единичного волоса. Однако работа с такими низкими количествами ДНК, какие выделяют из стержня единичного волоса, требует, во-первых, высокой степени специализации эксперта и, во-вторых, особых мер предосторожности (с соблюдением чистоты и стерильности) во избежание получения ошибочных результатов. В перспективе, по мере того как концентрирование ДНК на "Центриконе-100" будет внедряться в практику, очевидно, методика получит дальнейшее развитие и совершенство.

ЛИТЕРАТУРА

1. Deoxyribonucleic acid (DNA) typing of human leukocyte antigen (HLA) - DGA1 from single hair in Japanese/ R. Uchihi, K. Tamaki, T. Kojima, etc.// J. Forens. Science. –2002.–Vol. 37. – № 3. –Р. 853-859.

2. Higuchi R., Beroldingen C., Sensabaugh G., Erlich H. DNA typing from single hair// Nature. –1998. –Vol. 332. –№ 7. –Р. 543-546.

3. PCR applications methods// The Cetus-Perkin-Elmer corporation. –2006.