НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

ЛІТВІНОВА ЛІЛІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

УДК: 615.361.018.8.013.014.41:617.7.

ВПЛИВ КРІОКОНСЕРВОВАНИХ ФЕТАЛЬНИХ НЕРВОВИХ КЛІТИН НА РЕПАРАТИВНІ ПРОЦЕСИ В ПАТОЛОГІЧНО ЗМІНЕНІЙ СІТКІВЦІ

14.01.35 – кріомедицина

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття

наукового ступеня кандидата медичних наук

Харків – 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Дьомін Юрій Альбертович, Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, завідувач кафедри офтальмології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Юрченко Тетяна Миколаївна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріоморфології, м. Харків

доктор медичних наук, професор Шепітько Володимир Іванович, Вищій державний навчальний заклад України „Українська медична стоматологічна академія ” МОЗ України, завідувач кафедри гістології, цитології і ембріології, м. Полтава

Захист відбудеться "20" травня 2008 р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)

Автореферат розіслано "18" квітня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

член-кореспондент НАН України,

доктор медичних наук,

професор

Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На даний час розроблено біотехнологічні процеси заготівлі, консервування клітин і тканин ембріофетоплацентарного походження в умовах низьких температур (Грищенко В.І., Снурніков О.С., Дьомін Ю.А. 2000; Грищенко В.И., 2001; Гольцев А.Н., 2005).

Вивчено вплив холоду на біологічні об'єкти, розроблена спеціальна кріогенна техніка, яка забезпечує оптимальну програму заморожування, запропоновано захисні засоби, що забезпечують цілість клітин і тканин у життєздатному стані (Грищенко В.И., 2000, 2003; Гольцев А.Н., Бабенко Н.М., 2003; Грищенко В.И. 2006), а також численні кріоконсервовані препарати і схеми їх використання (Anthony D. et al., 1999; Fuchs E. et al., 2000, Сметанкин И.Г., 2000; Bianco P. et al., 2001; Турчин И.С., 2003; Бабенко В.И., Грищенко В.И., 2005; Бичко С.В., Дунаева О.В., 2005; Ващенко В.И., 2005).

Процес кріоконсервування багато в чому визначає функціональну повноцінність біологічного матеріалу і відповідно успіх у практичному його застосуванні.

В останні десятиліття інтенсивно розвивається новий напрямок медицини – клітинна терапія, суть якої полягає в використанні кріоконсервованих клітин і тканин ембріофетоплацентарного комплексу з метою активації компенсаторних ресурсів ушкоджених клітин і тканин реципієнта, стимуляції механізмів регенерації, заміщення утрачених клітинних і тканинних структур при подальшому відновленні функцій органа, тканини (Akpek E.K. et al., 1999; Бабенко Н.Н. и соавт., 1999; Высеканцев И.П., Гурина Т.М., 2001; Демин Ю.А. и соавт., 2001; Ватутин Н.Т., Гринь В.К., 2003).

Однак на даний час залишаються маловивченими механізми дії клітинних препаратів після їх деконсервування і введення в організм реципієнта при різних патологіях. Використання фетальних нервових клітин має виражений позитивний вплив на клінічні синдроми патологічних процесів із ураженням нервової тканини (Линник Л.А., 2001).

Одним з патологічних проявів ураження нервової тканини в офтальмології є центральна хоріоретинальна дистрофія (ЦХРД).

Центральна хоріоретинальна дистрофія – одна найбільш розповсюджена причина слабобачення, яка займає лідируюче місце інвалідності по зору (Линник Л.А., 2001; Абдулаева Э.А.,2002; Александрова М.А., Ревищин А.В., 2003).

За даними вітчизняних вчених ЦХРД складає 14% від усіх випадків судинних захворювань ока, а в осіб старше 50 років – 49% (Бездетко П.А., 2001; Абдулаева Э.А. и соавт., 2002; Александрова М.А. и соавт., 2003). Інвалідність внаслідок дистрофічних захворювань сітківки протягом останніх 5 років залишається високою та складає 24-25% від загальної кількості первинної інвалідності (Логай И.М., Сергиенко Н.М., 2003).

Вибір терапії залежить від форми і стадії ЦХРД. З урахуванням різноманіття патогенетичних факторів захворювання основні методи лікування спрямовані на покращення гемодинаміки і нормалізацію обмінних процесів у судинній оболонці та сітківці. Однак існуючі терапевтичні методи лікування ЦХРД не забезпечують повноцінного і стабільного відновлення утраченого зору і у більшості випадків не мають бажаних задовільних результатів.

Тому актуальним залишається подальший пошук патогенетично обґрунтованих методів лікування ЦХРД, серед яких перспективним є використання препаратів фетоплацентарного комплексу (ПФПК) на основі всебічного вивчення механізмів їх дії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках науково-дослідної теми Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України: № 7 «Вивчення морфофункціональних особливостей регіональних стовбурових клітин ембріонів, їх кріочутливості та механізмів реалізації біологічної активності в умовах культивування та на моделях деяких патологічних станів» (№ ДР 0102U002026).

Мета і задачі дослідження. Визначити закономірності дії кріоконсервованих фетальних нервових клітин в експерименті і вивчити їх вплив на функціональні показники органа зору в клініці.

Для реалізації поставленої мети необхідно вирішити наступні задачі:

Вивчити розподіл кріоконсервованих фетальних нервових клітин (КФНК) в організмі експериментальних тварин після застосування і визначити тимчасові параметри їх функціонування при експериментальній моделі ушкодження сітківки.

Оцінити вплив КФНК на морфологічну структуру сітчастої оболонки експериментальних тварин після лазерного опіку ока.

Вивчити закономірності впливу КФНК на окремі аспекти молекулярної регуляції процесів репарації сітківки кроля після лазерного опіку.

Розробити схему введення КФНК, а також визначити основні верифікаційні параметри для вибору тактики лікування в комплексній терапії ЦХРД.

Вивчити динаміку змін основних клініко-функціональних показників органа зору після застосування КФНК у комплексному лікуванні ЦХРД.

Об'єкт дослідження: Процеси репарації ушкодженої сітківки після введення КФНК.

Предмет дослідження: Механізми дії КФНК, які обумовлюють терапевтичну ефективність при лікуванні дистрофічних захворювань та пошкоджень сітківки.

Методи дослідження: У роботі використовували методи морфологічного аналізу, імуноферментний (імуносорбентний) метод для аналізу нейротрофічних факторів (фактора росту нервів (FGN) і трансформуючого фактору росту β-1 (TGF β-1)), молекулярний метод (полімеразно ланцюгова реакція (ПЛР) для дослідження розподілу КФНК в організмі по Y–хромосомі – генетична мітка), метод суправітального фарбування за допомогою флюоресцентного зонда DDC (3,3-'dioctadecyloxacarbocyanine bromide). Також були використані офтальмологічні методи (візометрія, періметрія, електроокулографія, HRT- томографія) і методи статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше досліджені шляхи міграції і встановлені тимчасові параметри функціонування КФНК після їх введення при наявності модельної патології сітківки.

Вивчено вплив КФНК на продукцію нейротрофічних факторів при репарації сітківки у кролів в експерименті.

На основі отриманих експериментальних результатів доповнено знання про механізми дії КФНК, про процеси репаративної регенерації при модельній патології сітківки, а також сформульовані концепції механізмів дії КФНК.

Уперше науково обґрунтовано патогенетично орієнтоване застосування КФНК при лікуванні сухої форми центральної хоріоретинальної дистрофії, та на основі проведених експериментальних досліджень розроблена й обґрунтована схема лікування.

Практичне значення одержаних результатів. При використанні кріоконсервованих фетальних нервових клітин стало можливим одержати позитивні результати лікування дистрофічних захворювань сітківки, які підтверджені статистичними даними. Застосування КФНК сприяє поліпшенню медико-соціальної реабілітації пацієнтів.

На підставі проведених досліджень розроблено методичні рекомендації «Застосування імунобіологічного препарату «Кріоцелл» для лікування дистрофічних захворювань ока», які затверджені МОЗ України, а також оформлено патент „Спосіб комплексного лікування дистрофій сітківки ока”.

Даний метод лікування може бути рекомендований до широкого використання в клінічній офтальмологічній практиці. Отримані нами експериментальні і клінічні дані використовуються на кафедрі офтальмології Харківської медичної академії післядипломної освіти і Харківського національного медичного університету.

Результати досліджень впроваджені в МКЛ №14 ім. Л.Л. Гіршмана (м. Харків), Запорізькій обласній клінічній лікарні, Запорізькому центрі відновлення зору ООО „Візус”, Дніпропетровській обласній клінічній офтальмологічній лікарні.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно проведено патентно-інформаційний пошук та аналіз даних літератури з використанням Internet за темою дисертації, отримано результати експериментальних досліджень, виконано їх первинний аналіз і статистичну обробку.

Автор приймала безпосередню участь у всіх клінічних дослідженнях. Разом із науковим керівником проведено планування експериментальної і клінічної роботи, інтерпретовано отримані результати і сформульовано остаточні висновки.

Експериментальні дослідження проведено самостійно на базах віварію і лабораторій ІПКіК НАН України, ХМАПО. Консультативна допомога при проведенні експериментів була надана професором, д.м.н. Дьоміним Ю.А., с.н.с. Т.М. Шарлай, професором, д.б.н. О.Ю. Петренко, с.н.с., к.б.н. Рязанцевим В.В., к.б.н. Ю.Є. Микулинським, к.б.н. О.А. Щегельською, к.б.н. В.З. Гертман.

Клініко-діагностичні дослідження і лікування хворих дисертант провів самостійно на базі МКЛ № 14 ім. Л.Л. Гіршмана, кафедри офтальмології Харківської медичної академії післядипломної освіти.

В опублікованих разом із співавторами роботах особистий внесок дисертанта полягає:

у роботах [1,4] в оцінці критеріїв клінічної ефективності застосування КФНК при дистрофічній патології органа зору;

у роботі [2] у дослідженні розподілу КФНК після введення в ранній термін спостереження за результатами генетичної мітки при експериментальному лазерному ушкодженні сітківки;

у роботах [3,13] у вивчені та оцінці впливу КФНК на деякі аспекти молекулярної регуляції на основі нейротрофічних факторів (TGF β-1 і GNF) на процеси репаративної регенерації при модельній патології ока у кроля;

у роботі [5] у дослідженні розподілу КФНК, мічених флюоресцентним зондом DDC, при експериментальній травмі ока in vivo протягом тривалого терміну спостереження;

у роботі [6] у морфологічній характеристиці сітківки протягом періоду встановлення після лазерного опіку і введення КФНК;

у роботі [7] у запропонуванні і застосуванні тактики лікування дистрофічної патології органа зору.

у роботі [8] у систематизації клінічного матеріалу.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались та обговорювались на наукових форумах: засіданні Харківського наукового суспільства офтальмологів; IV Українсько-польській конференції офтальмологів (Київ, 2003); конференції «Cryo Biomol 2003, Society for Cryobiology» (Коімбра, Португалія, 2003); науково-практичній конференції «Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології» Київ-Луганськ-Харків, 2003 (Луганськ, 2003); конференції „Федоровські читання”, (Москва, 2004, 2005); науково-практичній конференції, присвяченій 130-річчю з Дня народження В.П.Філатова (Одеса, 2005); науково-практичній конференції «Сучасні проблеми глаукоми і патології сітківки» (Запоріжжя, 2006); конференції «Cryo 2006, Society for Cryobiology» (Гамбург, Німеччина, 2006); конференції «Актуальні питання фармакотерапії в офтальмології» (Харків, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 робіт, з яких: 6 статей у наукових фахових виданнях, 7 тез доповідей на наукових конференціях, 1 патент на корисну модель та 1 методичні рекомендації МОЗ України.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 142 сторінках друкованого тексту, складається з введення, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків і списку використаних джерел. Робота містить 8 таблиць, 38 мікрофотографій. Список використаної літератури містить 274 джерел та складає 30 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження

У роботі були використані 88 статевозрілих кролів породи Шиншила масою 1,5-2,5 кг, які утримувались в стандартних умовах віварію Харківської медичної академії післядипломної освіти при нормальному освітленні і годівлі ad libitum. Дослідження проводилися відповідно до «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах» (29.09.01.), що узгоджуються з положеннями «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985).

Для вивчення впливу застосування КФНК на репаративно-регенеративні процеси в сітківці була обрана модель лазерного опіку сітківки (Ченцова Е.В. та співавт., 2005). Лазерне ушкодження сітківки здійснювали за допомогою аргонової лазерної установки Visulas-532 (CARL ZAISS, Німечіна). На нижню половину очного дна кожного експериментального ока через грань 3-дзеркальної лінзи наносили по 10-15 коагулятів. Ушкодженню піддавали праві очі, а контроль здійснювали на лівих очах тварин. Середня потужність випромінювання 400мВт, тривалість експозиції 0,1 сек., діаметр плями 100 мкм. За класифікацією L'еsреrаnсе світловий опік відповідав III ступеню (Ченцова Е.В., Пак Н.В., Иванов А.Н., Сухих Г.Т., 2005).

Для досліджень використали імунобіологічний препарат «Cryocell», розроблений в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків (Грищенко В.І. та співавт., 2001). Сертифікат про державну реєстрацію імунобіологічного препарату «Cryocell» № 371/03-3002 00 000 від 29.05.2003 р. та № 604/06-300200000 від 04.07.2006 р.

Вивчали вплив нейротрофічних факторів на репаративні процеси в сітківці після лазерного опіку.

Неспецифічним ростовим фактором вважали рівень продукції TGF β-1, а специфічним ростовим фактором для нервової тканини – рівень продукції GNF.

Показники продукції нейротрофічних факторів у плазмі крові кролів досліджували на 3, 7, 14, 21-шу добу і у віддалений термін спостереження (один та шість місяців).

Нейротрофічні фактори визначали за допомогою тест – систем: SPECIAL INFORMATION REGARDING BIOTRAK TGF β-1 (Transforming Growth Factor Beta-1) and GNF (Growth Neural Factor) human, ELISA System фірми Аmersham Pharmacia Biotech.

Експерименти проводили на 36 кролях, які розподілили на три групи: 1) перша – інтактна; 2) друга – основна; 3) третя – контрольна.

Інтактна група – кролям не виконували лазерного опіку сітківки. Основна група – внутрішньовенне і парабульбарне введення КФНК після лазерного опіку сітківки. Контрольна група – кролі з мимовільним загоєнням лазерного опіку та група кролів, яким лікування проводили за стандартною схемою: внутрішньовенне введення препаратів милдронату і тренталу, а також їх місцеве введення разом з емаксипіном.

Шлях і час міграції КФНК визначали за допомогою генетичної мітки методом ПЦР. Було використано 21 кроль.

Приготовували зразки клітин, які містять у геномі локус гена SRY, що визначає стать. Спочатку визначали в зразках методом ПЛР присутність локусу гена SRY, і клітини позитивні по Y-хромосомі далі використовували для введення лабораторним самкам кролів.

Клітини, що містять Y-хромосому, вводили кролям парабульбарно в дозі 0,5 мл, з кількістю 20-30Ч106 ядерних клітин. Проводили забій кролів експериментальних груп через 6, 12, 24 години і на третю добу після застосування КФНК.

За наявністю специфічного фрагмента ампліфікації розміром 336 пар нуклеотидів судили про присутність фетальних клітин з Y-хромосомою в досліджуваних тканинах.

Для ідентифікації і визначення шляхів міграції КФНК після введення використовували метод суправітального фарбування при використанні флюоресцентного зонда DDC, розробленого в НТК „Інститут Монокристалів НАН України (Егоров М.І., Дюбко Т.С., Ліннік Т.П. та співав., 2005; Боровой И.А., Малюкин Ю.В., Семиноженко В.П. , 2006).

У цьому експерименті було використано 15 кролів, по три кроля у кажному періоді спостереження. Перед введенням КФНК проводили суправітальне фарбування клітин розчином барвника DDC і вводили клітини кролям парабульбарно з лазерним опіком в дозі 0,5 мл, з кількістю 20-30Ч106 ядерних клітин. Забій кролів проводили через 24 години, на 3-, 7-, 14- та 21-шу добу.

Було проведено патоморфологічне дослідження сітківки після ушкодження протягом періоду відновлення у двох експериментальних груп (16 кролів). Попередньо усім тваринам зроблено опік сітчастої оболонки правого ока. Дослідження гістологічних препаратів проводили на 1-, 3-, 7- і 14-ту доби.

Гістологічні препарати виготовляли з парафінових зрізів і фарбували гематоксилін-еозином. Вивчали препарати за допомогою світлової мікроскопії при довжині хвилі 380 нм., на мікроскопі PZO № 21940 (Німечіна) з об'єктивом 20, при окулярі Ч15.

Клінічні спостереження. Ми спостерігали за 37 пацієнтами з дистрофічною патологією органа зору (60 очей), внаслідок сухої форми ЦХРД.

Хворі були розподілені на дві групи: контрольна група – 18 пацієнтів (29 очей), у яких лікування проводилось традиційним методом, основна група – 19 пацієнтів (31 око), лікування проводилось з застосуванням КФНК на фоні стандартної терапії.

Усім пацієнтам проводили повне офтальмологічне обстеження: візометрія, периметрія з визначенням сумарного поля зору і центральних скотом, офтальмоскопія очного дна, электроокулографія і ретинальна томографія, які повторювали через 10 діб, один, три і шість місяців.

Для більш детального огляду центральних і периферичних відділів очного дна застосовували налобний офтальмоскоп „Скепенс” його вітчизняний аналог НВО-2 з набором асферичних лінз, ретинальний томограф HRT-II. Для аналізу стану макули використовували програму HRT-II Macula Edema Software (конфокальна лазерна скануюча система для зйомки та аналізу трьохмірних зображень заднього сегмента ока).

Гостроту зору з корекцією та без неї визначали за таблицями Головіна-Сивцева на апараті Рота, сумарне поле зору і площу центральних скотом – на проекційно-реєстраційному периметрі ПРП – 60.

Границі поля зору на біле світло діаметром 3 мм визначали при постійній швидкості пересування об'єкта 1-2 см/сек, у восьми меридіанах із інтервалом 45°.

Окулографію проводили методикою G.B. Arden (1962) при використанні спеціальної камери для обстеження хворого в незатемненій кімнаті. Електроокулографія дозволяє дослідити й оцінити функціональний стан пігментного епітелію і свідчить про рівень кровообігу в хоріокапілярному шарі.

Результати вимірів усіх досліджених показників статистично обробляли за методом Стьюдента, за допомогою критерію Стьюдента визначали рівень вірогідності середнього значення (р<0,95; >0,95; >0,99; >0,999).

Обстежені групи хворих після лікування різними способами представляли у виді дисперсійних комплексів, за допомогою двохфакторного дисперсійного аналізу визначали ступінь впливу різних факторів на результати дослідження.

За допомогою кореляційного аналізу була встановлена наявність і сила зв'язку між парами досліджених показників у процесі лікування і відновного періоду, тобто ступінь зв'язку між рядами регресії, що відбивають динаміку досліджених показників.

Статистичну обробку результатів досліджень робили з використанням комп'ютерних програм “STATGRAPHICS Plus” і “Microsoft Office Excel”.

Використані в дисертаційній роботі матеріали і методи були розглянуті та узгоджені з комісією з біоетики ІПК і К НАН України.

Результати досліджень та їх обговорення

Найбільш інформативним критерієм оцінки функціональної повноцінності та розподілу КФНК є їх ідентифікація після введення в організмі реципієнта.

Для ідентифікації, вивчення шляху і часу міграції клітин у ранній термін спостереження використовували генетичну мітку, яка досить консервативна, тому що не піддається розпаду, і для неї не характерні явища обміну між клітинами.

Така генетична мітка залишається в дочірніх клітинах і при розподілі в організмі доказує присутність утримуючих Y-хромосому клітин у патологічному осередку.

В експериментальному оці при парабульбарному введенні КФНК через шість годин, клітини що містять Y-хромосому, визначаються в склері, радужці, зоровому нерві, у судинній і сітчастій оболонці ока, тоді як у тканинах контрольного ока в цей термін спостереження клітини не визначаються.

До 12-ї години спостереження картина змінилася. У судинній, сітчастій оболонці і зоровому нерві експериментального ока зберігаються клітини, які утримують Y-хромосому. На цьому етапі спостереження, клітини, що утримують У-хромосому з'являються в головному, довгастому мозку, мозочку, кістковому мозку, а також у судинній і сітчастій оболонках контрольного ока.

Через 24 години після введення клітин, що містять Y-хромосому, визначаються тільки у судинній і сітчастій оболонках експериментального ока, а також зберігаються в структурах головного, довгастого мозку, мозочку і кістковому мозку, тоді як у контрольному оці клітки утримуючі Y-хромосому відсутні. Через 72 години спостереження картина залишається без змін.

У результаті проведених досліджень встановлено, що введені нервові клітини володіють високою тропністью до патологічного осередку і вірогідно визначаються в травмованому оці протягом 3-х діб. Отримані нами дані свідчать про розподіл нервових клітин протягом 72 годин після введення. Однак, важливо встановити, чи зберігають вони свою функціональну активність і як розподіляються в організмі КФНК у більш тривалий період спостереження. Для цього ми провели експериментальні дослідження з використанням флюоресцентного зонда DDC.

В проміжки спостереження від 3 до 21-ї доби відзначалося скупчення мічених клітин, що мають інтенсивне зелене світіння, це свідчить про проникнення нервових клітин через гематоофтальмічний бар'єр та про їх спрямованість до осередку поразки і проникнення в сітчасту оболонку реципієнта. Найбільш інтенсивне зелене світіння сітчастої оболонки спостерігалось у препаратах з 3-ї до 7-ї доби, тоді як до 21-ї доби відзначалася тенденція до зниження його інтенсивності.

Даний метод дозволяє реєструвати високий рівень флюоресценції у осередку поразки, що може свідчити про наявність в ньому нервових клітин протягом тривалого часу.

Безумовним об'єктивним доказом ефективності проведеної терапії є патоморфологічне дослідження органів, клітин і тканин. Гістологічне дослідження показало, що після лазерного впливу в 1-шу добу відновного періоду відзначаються альтеративні зміни в шарі пігментного епітелію і мембрані Бруха. Гранули пігменту виходять у шар фоторецепторів і судинну оболонку і щільність зерен пігменту стає неоднорідною.

Між паличками і колбочками розташовуються еритроцити, що вийшли із судин, визначається набряклість міжуточної речовини, яка має вигляд порожніх щілин.

Також у цьому періоді відзначаються тромбоз судин хоріоідеї, часткове руйнування пігментного епітелію і шарів сітківки.

Доведено, що утворення істинного хоріоретинального зрощення пов'язано з утворенням фіброзних волокон у зоні ушкодження.

Через 3-и доби після введення КФНК спостерігаються розсмоктування крововиливів, зменшення набряку міжуточної речовини сітківки.

Зміни, характерні для часткового відновлення сітківки, спостерігаються вже через тиждень. Так, пігментний епітелій проліферує в один чи декілька шарів сітківки; пігментні клітини розташовуються навколо ретинальних судин або мігрують у внутрішні шари сітківки, де утворюють скупчення.

У тварин основної групи на 7-му добу після введення КФНК у сітчастій оболонці відзначаються зменшення набряку міжуточної речовини, перерозподіл гранул пігменту з тенденцією до нормалізації анатомічної структури, тоді як у контрольній групі в цей термін спостереження зберігаються альтеративні зміни з набряком межуточної речовини сітківки, крововиливами, аномальним перерозподілом пігменту.

До 14-ї доби після введення КФНК у тварин дослідної групи зберігається тенденція до нормалізації морфологічної структури сітчастої оболонки. Визначаються мінімальні альтеративні зміни.

Результатом фотокоагуляції сітківки є проліферація пігментного епітелію й утворення хоріоретинального зрощення, що на очному дні при лазерній скануючій томографії має вигляд дистрофічних осередків блідо-жовтого чи білого кольору.

У тварин контрольної групи у відповідний термін спостережень у зоні ушкодження зберігався набряк і перерозподіл пігменту.

Застосування КФНК стимулює репаративні процеси при лазерному ушкодженні сітківки ока в кролів і є високоефективним методом структурного відновлення сітківки.

Ми вивчили вміст окремих нейротрофічних факторів (GNF, TGF β-1), що беруть безпосередню участь у репарації сітківки (рис. 1 та 2).

З отриманих даних видно, що на 3-тю добу після лазерного опіку сітківки у всіх групах піддослідних тварин відзначалося різке підвищення рівня вмісту TGF β-1 у плазмі крові. При цьому мали місце виразні і достовірні розходження в ступені підвищення вмісту даного фактора між групами тварин, що не одержували клітинну терапію (мимовільне загоєння опіку сітківки і лікування за стандартною схемою), і тварин, яким вводили КФНК (внутрішньовенно і парабульбарно).

У контрольній групі відзначено підвищення показника тільки в 2 – 2,5 рази, що склало при спонтанному загоєнні після лазерного опіку сітківки 255%, а за стандартною схемою лікування 239% (p<0,01), відповідно до норми (інтактні кролі -100%). У тварин дослідних груп, із застосуванням КФНК рівень вмісту TGF β-1 підвищувався відповідно норми в 4-5 разів, при внутрішньовенному введенні складав 562%, при парабульбарном введенні 436% (p<0,001) і був у середньому в 2 рази вище показників у контрольній групі.

На 3-ю добу після опіку були зафіксовані розходження рівня вмісту TGF β-1 у залежності від шляху введення КФНК. У групі тварин, яким КФНК вводили внутрішньовенно, вміст ростового фактора TGF β-1 в плазмі крові був достовірно вище у 1,3 рази (p<0,05), ніж у кроликів з парабульбарным введенням (рис. 1.).

Отримані дані свідчать, що травматичне ушкодження сітківки ока викликало різкий викид ростового фактора репарації TGF β-1.

На 3-ю добу після травми в плазмі крові тварин, що одержували клітинну терапію, відзначається більш високий рівень TGF β-1, тому можна припустити, що введені фетальні нервові клітини стимулюють продукцію біологічно активних речовин, необхідних для репаративних процесів у сітчастій оболонці. Більш високий вміст досліджуваного TGF β-1 у плазмі крові тварин, якім внутрішньовенно вводили клітинний препарат, може вказувати на те, що частина клітин залишається в загальному циркуляторному руслі і не відразу досягає осередку поразки.

На 7-му добу після ушкодження вміст TGF β-1 значно знижувався у всіх групах. У кролів з мимовільним загоєнням опіку сітківки визначався дефіцит TGF β-1 і складав 78,3%, тобто досліджуваний показник був нижче на 22% (p <0,05), ніж у інтактних кролів. У кролів, яких лікували за стандартною методикою, вміст TGF β-1 значно перевищував нормальні показники в 1,7 рази (Р<0,05) і складав 172%.

На 7-му добу спостережень найбільш високі показники TGF β-1 були у кролів, що одержували клітинну терапію. Вміст TGF β-1 перевищував нормальне значення в 3,6-3,8 рази і складав при внутрішньовенному введенні КФНК – 381%, при парабульбарному – 363% (p<0,001), а також перевищував вміст TGF β-1 у контрольній групі кролів в цей термін спостереження.

При цьому до 7-ї доби спостереження достовірних розходжень між показниками вмісту TGF β-1 у групах тварин, яким вводили КФНК різними шляхами, не спостерігалося.

На 14-ту добу спостережень вміст ростового фактора TGF β-1 у нелікованих кролів був на 20% нижче норми і складав – 79,5%. В групі кролів зі стандартним лікуванням TGF β-1 складав – 104,5%. У групах кролів, що одержували КФНК, вміст TGF β-1 перевищував нормальний у 2,5-2,7 рази (p<0,01) і складав при внутрішньовенному введенні КФНК 247%, а при парабульбарному 270%.

На 21-шу добу спостережень у тварин із спонтанним загоєнням опіку сітківки і яких лікували за стандартною схемою, рівень вмісту досліджуваного показника нормалізувався.

У тварин після проведення клітинної терапії на 21-шу добу на тлі практично повного загоєння ранового дефекту відзначалося підвищення значення TGF β-1 у 1,7-2 рази (p<0,05), що складало при внутрішньовенному введенні КФНК – 175,6%, при парабульбарному – 196%.

До кінця першого місяця після нанесення лазерного опіку сітківки дослідних тварин усіх груп рівень TGF β-1 у плазмі крові цілком нормалізувався і залишався таким до шести місяців спостереження.

В якості специфічного ростового фактора для клітин нервової тканини ми вивчали рівень вмісту GNF (рис. 2.).

Представлені дані свідчать про те, що на 3-тю добу після нанесення лазерного опіку сітківки підвищення вмісту GNF у плазмі крові (у 3-4 рази відповідно до норми – 100%) відзначалося тільки у тварин, які одержували КФНК, що складало при внутрішньовенному введенні КФНК – 461%, а при парабульбарному – 351%.

Відзначено, що вміст GNF у плазмі крові при внутрішньовенному введенні КФНК у 1,3 рази вище (p<0,05), ніж при парабульбарному. Ці факти можуть свідчити про те, що препарат КФНК стимулює вироблення GNF і що частина клітин протягом 3-х діб залишається в загальному кровоносному руслі.

Відсутність підвищеного рівня GNF на 3-тю добу в крові тварин, які не одержували клітинну терапію, може свідчити про слабкі синтетичні можливості власних клітин, які продукують даний ростовий фактор.

На користь останнього припущення свідчить підвищення рівня продукції GNF у тварин дослідних груп на 7-му добу після травми сітківки. У тварин контрольної групи зі спонтанним загоєнням опіку відзначено підвищення показника в 1,56 рази (p<0,05), що складало – 156,8%. При стандартній схемі лікування рівень показника підвищувався в 1,84 рази (p<0,01) в порівнянні з нормою і складав – 183%.

У кролів, що одержували КФНК, на 7-му добу відзначалося найвище за весь період спостереження значення GNF, яке перевищує норму в 4,6-5 рази (p<0,001) та складало при внутрішньовенному введенні КФНК 518,1%, а при парабульбарному – 463,4%.

На 14-ту добу спостереження в контрольній групі тварин із спонтанним загоєнням опіку сітківки вміст GNF у плазмі крові перевищував нормальні значення в 1,4 рази (p <0,05) і складав – 138%.

При стандартному лікуванні в цей період спостереження зберігалося помірне підвищення показника GNF в 1,5 рази (p<0,05) у порівнянні з нормальним значенням, що склало 148,5%. У групі тварин, які одержували КФНК, вміст GNF зберігався на більш високому рівні, перевищував норму в три рази (p<0,001) і складав при внутрішньовенному введенні КФНК 452%, при парабульбарному – 434,4%.

На 21-шу добу спостереження в контрольних групах вміст GNF цілком нормалізувався. У тварин дослідної групи після лікування КФНК ще зберігалися підвищені значення GNF у сироватці крові відносно контрольних значень в 3 рази (p<0,001), що склало при внутрішньовенному введенні КФНК 333,5%, при парабульбарному – 316,3%.

Через місяць після нанесення лазерного опіку вміст GNF у плазмі крові всіх дослідних тварин цілком відповідав нормальним значенням і зберігався на цьому рівні до шести місяців спостереження.

Таким чином, репарація сітківки після лазерного опіку супроводжується підвищенням вмісту GNF у плазмі крові, можливо, у фазі активного відновлення іннервації в зоні ранового дефекту. Активація системного кровообігу і локальної мікроциркуляції в зоні травми при традиційному лікуванні приводила до деякого підвищення вмісту GNF у плазмі крові за рахунок активації пластичних потенцій усього клітинного пула, що стимулює продукцію GNF. Введення КФНК приводило до різкого підвищення рівня GNF у плазмі крові дослідних тварин. Можливо це свідчить про те, що КФНК активно стимулюють продукцію даного ростового фактора, необхідного для репаративних процесів сітківки у відновний період після ушкодження протягом трьох тижнів спостережень.

Виражений позитивний ефект КФНК залежить від оптимальної схеми їх введення препарата. Ми вивчили різні способи введення КФНК в експерименті (внутрішньовенний і парабульбарний). При модельній патології лазерного опіку сітківки критерієм ефективності застосованої терапії були показники вмісту нейротрофічних факторів (TGF β-1 і GNF). Найбільш оптимальними виявили парабульбарне введення КФНК з використанням системної лікарської терапії.

Отримані дані свідчать, що лікування ЦХРД повинно бути системним з використанням КФНК і алопатичної терапії. На підставі успішно проведених експериментальних досліджень ми запропонували спосіб лікування ЦХРД із використанням КФНК.

Під нашим спостереженням знаходилися дві групи пацієнтів із ЦХРД: 1) основна – традиційна терапія сумісно з препаратом КФНК; 1) контрольна – звичайне алопатичне лікування.

Ефективність проведеного лікування у всіх групах оцінювалась на протязі шести місяців.

Аналіз динаміки гостроти зору в процесі лікування протягом відновного періоду показує, що в контрольній групі хворих гострота зору підвищилась на 15%, в основній – на 31% відносно норми (рис. 3.).

За результатами двохфакторного дисперсійного аналізу встановлено, що на зміну гостроти зору в пацієнтів з ЦХРД після проведеного лікування найменш за все впливають досліджувані фактори і залежить від методу лікування на 11%, та строку відновного періоду на 6 %.

Поряд з аналізом гостроти зору у хворих були оцінені зміни показників електроокулографії (коефіцієнт Ардена) (рис. 4.).

При аналізі коефіцієнт Ардена електроокулографічного показника – протягом відновного періоду встановлено, що коефіцієнт Ардена до проведення лікування в контрольній групі складав 130%, в основній 132%. Після лікування і відновного періоду (шість місяців) коефіцієнт Ардена підвищився в контрольній групі хворих до 158% (p<0,001) (84% від норми), в основній до 171% (p<0,001) (92% від норми), тобто показник електроокулографії в основній групі вище рівня цього показника в контрольній – на 8%.

Також досліджували межі периферичного поля зору (рис.5.). Отримані результати вказують на те, що до лікування в контрольній і основній групах хворих межі периферичного поля зору складали 392 – 397° (норма – 500°). Після лікування традиційним методом через шість місяців спостереження в контрольній групі встановлено розширення меж поля зору до 448° (90% від норми), а після застосування КФНК до 483° (97% від норми). Наприкінці спостережень даний показник в основній групі був на 8% вищим, ніж в контрольній (рис. 5.).

Була досліджена площа центральних скотом (рис.6.). Після проведеного лікування в більшості хворих основної і контрольної груп відзначено достовірне зменшення площі центральних скотом (p<0,001). Однак в основній групі цей показник був значно вище, ніж у контрольній.

Площа відносних скотом в контрольній групі зменшується з 263 ммІ до 125 ммІ (в 2,1 рази), а в основній – з 256 ммІ до 85 ммІ (в 3,0 рази). У підсумку площа скотом в основній групі хворих на 32% менше площі скотом у контрольній (рис. 6.).

Проведений двохфакторний дисперсійний аналіз свідчить, що досліджувані показники ока в більшості пацієнтів основної групи залежать від методу лікування. Доведено, що лікування з застосуванням препаратів КФНК більш ефективне, ніж традиційне.

Двохфакторний дисперсійний аналіз дозволив установити, що успіх проведеної терапії, з одного боку, залежить від методу лікування, а з іншого – від часу його проведення.

Результати кореляційного аналізу свідчать, що між досліджуваними показниками існує взаємозв'язок, який обумовлює кореляційні зміни протягом лікування і відновного періоду.

Динаміка показників функціонального стану органа зору підтверджується об'єктивними даними офтальмологічної картини очного дна. Початкова картина очного дна в основній і контрольній групах була ідентичною. Однак в основній групі пацієнтів до одного місяця спостереження після операційного періоду картина очного дна значно змінювалася (збільшення кровонаповнення судин, зменшення кількості і площі дистрофічних осередків), у контрольній групі після алопатичного лікування відзначається тенденція до прогресу дистрофічного процесу в макулярній області (набряк сітківки, збільшення площі дистрофічних осередків).

До кінця терміну спостереження (6 місяців) в основній групі пацієнтів після введення КФНК спостерігається зменшення кількості дистрофічних осередків, картина очного дна нормалізується, а у контрольній групі спостерігається тенденція до злиття дистрофічних осередків, що свідчить про прогрес процесу.

Препарат КФНК, крім клінічного ефекту, впливає на загально соматичний статус пацієнтів, покращує їх психоемоційний стан і підвищує якість життя.

ВИСНОВКИ

Актуальною проблемою сучасної кріомедицини є вивчення механізмів дії кріоконсервованих фетальних клітин. Пошук багатофакторних терапевтичних засобів, які впливають на репаративні процеси в нервових клітинах сітківки, є важливою актуальною проблемою в офтальмології. Саме такою дією володіють кріоконсервовані препарати фетального походження, зокрема нервові клітини.

У дисертації досліджені механізми дії кріоконсервованих фетальних нервових клітин, а також теоретично обґрунтована можливість їх використання для лікування центральній хоріоретинальній дистрофії, що є актуальною задачею сучасної офтальмології, а також має важне медичне і соціальне значення.

За допомогою генетичної мітки (У-хромосома) встановлена тропність до патологічного осередку кріоконсервованих фетальних нервових клітин, в якому вони реалізують терапевтичний ефект у ранній термін спостереження.

При фарбуванні кріоконсервованих фетальних нервових клітин зондом 3,3-DDC встановлено високий рівень флюоресценції при люминісцентній мікроскопії. Високий рівень флюоресценції в патологічно зміненій сітчастій оболонці визначається протягом 21 доби, що також може свідчити про цільову спрямованість міграції кріоконсервованих фетальних нервових клітин до патологічного осередку.

Застосування кріоконсервованих фетальних нервових клітин експериментальним тваринам є високоефективним методом структурного відновлення патоморфологічно зміненої будови сітчастої оболонки.

Введені кріоконсервовані фетальні нервові клітини впливають на процеси репаративної регенерації в клітинах сітківки через активацію вироблення нейротрофічних факторів: трансформуючий фактор росту (TGF β-1) і фактор росту нервів (GNF), які сприяють значному прискоренню термінів загоєння лазерного опіку сітківки в експерименті.

Найбільш ефективним є парабульбарне введення препарату кріоконсервованих фетальних нервових клітин на тлі проведеної консервативної терапії. Доведено, що терапію необхідно починати в більш ранній термін виникнення патологічного процесу, про що свідчить зміна показника нейротрофічних факторів (TGF β-1 і GNF) у плазмі крові кролів при парабульбарному і внутрішньовенному введенні.

Після введення кріоконсервованих фетальних нервових клітин підвищуються функціональні показники органа зору, що підтверджує ефективний вплив фетальних препаратів на основні патогенетичні ланки дистрофічної патології. Кореляційний аналіз довів, що підвищення функціональних показників органа зору пов'язано з проведеним лікуванням і часом реабілітації пацієнтів. Установлено, що до 6-ти місяців спостереження гострота зору в основній групі підвищилася на 16% відносно контрольної групи; площа відносних скотом в основній групі хворих на 32% менш площі скотом в контрольній; показник електроокулографії в основній групі вище на 8%, ніж в контрольній; границі периферичного поля зору розширилися на 8% у порівнянні з контрольною групою.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ, ЗА ТЕМОЮ ДИССЕРТАЦІЇ

Демин Ю.А., Петренко А.Ю., Литвинова Л.В. Эффективность применения криоконсервированных эмбриональных нейрональных клеток в комплексном лечении склеротических макулодистрофий // Пробл. криобиологии. – 2004. – №2. – С. 89-94.

Демин Ю.А., Литвинова Л.В., Рязанцев В.В. Распределение донорских криоконсервированных эмбриональных нервных клеток при модельной патологии органа зрения по результатам генетической метки клеток // Актуальні питання медичної науки та практики. – 2006. – № 69, Кн. 2. – С. 290-294.

Демин Ю.А., Литвинова Л.В. Влияние трансплантации криоконсервированных нервных клеток на секрецию трансформирующего фактора роста бета-1 после экспериментальной травмы сетчатки // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологичексих наук и практического здравоохранения . – 2006. – Т. 142, Ч. 6. – С. 25-27.

Дьомін Ю.А., Літвінова Л.В. Терапевтична ефективність застосування кріоконсервованих ембріональних нервових клітин у лікуванні хворих із центральною хоріоретинальною дистрофією // Клінічна фармація. – 2007. – Т. 11, № 2. – С. 29-30.

Демин Ю.А., Литвинова Л.В. Распределение эмбриональных нервных клеток после введения in vivo при экспериментальной травме глаза // Пробл. криобиологии. – 2007. – № 2. – С. 186-190.

Демин Ю.А., Литвинова Л.В. Морфологическая характеристик сетчатки в восстановительный период после лазерного ожога и введения криоконсервированных фетальных нервных клеток // Вісник проблем біології і медицини. – 2008. – № 1. – С. 11-15.

Патент № 23129 Україна, МПК А 61F 9/00, А61К35/12. Спосіб комплексного лікування дистрофій сітківки ока // Дьомін Ю.А., ЛітвіноваЛ.В. Заявлено.11.12.2006; Опубл. 10.05.2007. – Бюл. № 6.

Застосування імунобіологічного препарату «Кріоцелл» для лікування дистрофічних захворювань ока. Метод. рекомендації МОЗ України. Сост.: Грищенко В.І., Риков О.С., Сергієнко А.М., Дьомін Ю.А., Літвінова Л.В., Петренко О.Ю., Рязанцев В.В. Харків, 2006. – 16 с.

Demin Yu., Litvinova L. and Goncharuk E.I. Fetal cells for treatment of age-related macular degeneration: Proc. Of Abstracts. CRYOBIOMOL-2003. – Portugal. – 2003. – P. 101.

Демин Ю.А., Литвинова Л.В. Эффективность применения препарата «Гемонейронал» в комплексном лечении сосудистой патологии органа зрения: Тези доповідей «Регенеративная медицина и трансплантация тканей в офтальмологии». – Москва. – 2005. – С. 98-99.

Демин Ю.А., Литвинова Л.В., Петренко А.Ю., Семенченко О.А. Среда для гипотермического хранения клеток и тканей человека. Научно-практическая конференция, посвященная 130-летию со дня рождения академика В.П.Филатова. – Одесса. – 2005. – С. 19-20.

Демин Ю.А., Литвинова Л.В. Клиническое обоснование использования криоконсервированных нервных клеток в лечении сосудистых и дистрофических заболеваний органа зрения. «Современные аспекты сосудистых и дистрофических заболеваний органа зрения»: Первая научно–практическая конференция молодых ученых – офтальмологов Украины.– Харьков, – 2006. – С. 76-78.

Demin Yu., Litvinova L. Neurotrophic factors as possible effective agent in therapy of experimental retina burn with using cryopreserved embryonic nerve cells: Cryo-2006. Hamburg. – 2006. – Р. 159.

АНОТАЦІЇ

Літвінова Л.В. Вплив кріоконсервованих фетальних нервових клітин на репаративні процеси в патологічно зміненій сітківці. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.35 – кріомедицина. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.

У роботі досліджена дія кріоконсервованних фетальних нервових клітин після введення в процесі лікування ЦХРД. Доведена можливість КФНК сприяти відновленню анатомічних структур сітчастої оболонки.

Вивчена репаративна регенерація в ушкодженій сітчастій оболонці на молекулярному рівні регуляції процесів на підставі вивчення виробки окремих нейротрофічних факторів (TGF β-1 і GNF), які безпосередньо беруть участь у репаративній регенерації.

Показано, що введені нервові клітини володіють високою тропністью до патологічного осередку і визначаються в осередку поразки тривалий час (до 21 доби).

На підставі отриманих експериментальних даних показана висока ефективність в офтальмологічній практиці в лікуванні сухої форми ЦХРД.

Даний метод може бути впроваджений у повсякденну офтальмологічну практику і сприяти соціальній реабілітації хворих.

Ключові слова: кріоконсервування, фетальні нервові клітини, репарація, сітківка, застосування.

Литвинова Л.В. Влияние криоконсервированных фетальных нервных клеток на репаративные процессы в патологически измененной сетчатке. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.35 – криомедицина. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2008.

Диссертация посвящена изучению механизмов действия криоконсервированных фетальных нервных клеток после введения в организм реципиента в процессе лечения дистрофической патологии органа зрения. Изучены некоторые аспекты молекулярной регуляции процессов репаративной регенерации в поврежденной сетчатке на основании изучения выработки отдельных нейротрофических факторов (TGF β-1 и GNF), участвующих в репаративной регенерации. Полученные в работе данные показывают, что при самопроизвольном заживлении лазерного ожога сетчатки наблюдается выраженное содержание как неспецифических цитокинов репарации TGF β-1, так и более специфического цитокина для нервной ткани GNF. При этом содержание TGF β-1 значительно повышается в более ранний период заживления лазерного ожога с 3 суток, чем GNF. Уровень GNF в плазме крови экспериментальных животных повышался с 7 до 14 суток в фазе активного восстановления и иннервации в зоне раневого дефекта. Увеличение или уменьшение нейротрофических факторов в плазме крови экспериментальных животных имеет четкую временную зависимость, регулирующую последовательность репаративних процессов.

Полученные нами результаты позволяют предположить, что КФНК активно стимулируют продукцию данных ростовых факторов на протяжении 3-х недель наблюдения, что способствует интенсификации репаративных процессов нервных клеток в сетчатке.

Полученные данные дают основание предполагать, что введение КФНК стимулирует продукцию ростовых факторов собственными компетентными клетками организма реципиента.

Проведенные экспериментальные исследования распределения, пути и времени миграции нервных клеток при модельной патологии лазерного ожога сетчатки показали, что введенные нервные клетки обладают высокой тропностью к патологическому очагу и определяются в очаге поражения длительный период.

Данные гистологического исследования сетчатой оболочки экспериментальных животных указывают на нормализацию анатомической структуры поврежденной сетчатки после введения КФНК.

Можно предположить, что клеточные препараты при центральном и периферическом введении оказывают мощное стимулирующее позитивное действие на сетчатую оболочку. Вероятно, такое позитивное воздействие опосредовано нейротрофическими факторами, источники которых фетальные клетки. Нейротрофические факторы являются полифункциональными регуляторами, контролирующими процесс созревания, дифференцировки и образования нейрональных сетей, поддерживают функциональную активность зрелых нейронов центральной нервной системы и периферической нервной системы и участвуют в регенерации аксонов проводящих путей.

Одним из основных механизмов действия КФНК является нейротрофическое влияние и модуляция эндогенных факторов роста. Эндогенное образование нейропептида происходит в ответ на какое-либо высвобождение других пептидов, для которых первый является индуктором. Это усиливает и пролонгирует действие пептидов. По-видимому, препарат КФНК способен регулировать содержание нейротрофинов, повышать пластичность и выживаемость нейронов в условиях гипоксии, усиливать передачу нервных импульсов в синапсах, оказывать влияние на уровень нейротрансмиттеров или других физиологически важных соединений, принимающих участие в функционировании нейронов.

Результаты экспериментальных введений КФНК и изучения механизмов их действия на организм реципиента позволили нам применять КФНК в клинической офтальмологической практике для лечения ЦХРД.

В работе показано, что введение КФНК позволяет добиться положительного результата при дистрофической патологии органа зрения, значительно улучшая функциональное состояние глаза, и способствует медико-социальной реабилитации больных. Следовательно, данный метод и схема его использования могут быть рекомендованы для широкого применения в клинической офтальмологической практике.

Ключевые слова: криоконсервирование, фетальные нервные клетки, репарация, сетчатка, применение.

Litvinova L.V. Effect of cryopreserved fetal neural cells on reparative process in pathologically changed retina. – Manuscript.

Thesis for obtaining scientific degree of the candidate of medical sciences

(PhD equivalent) on specialty 14.01.35 – Cryomedicine. - Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2008.

The thesis covers studying the effect of cryopreserved fetal neural cells after being introduced during treatment of dystrophic pathology of vision organ. The possibility of participation of cryopreserved fetal neural cells in recovery of anatomic retina structures has been shown.

Reparative regeneration in the damaged retinal membrane at molecular level of regulation of the processes: based on studying the production of some neurotrophic factors (TGF b-1 and GNF) directly participating in reparative regeneration has been investigated.

It has been shown that the introduced neural cells are highly pathological focus-seeking and found in the damage focus within a long period up to 21 days.

As the matter of the record on obtained experimental data a high efficiency in ophthalmologic practice during treatment of dry form of central chorioretinal dystrophy has been demonstrated.

This method may be introduced into daily ophthalmologic practice and contribute to social rehabilitation of the patients.

Key words: cryopreservation, fetal nerve cells, reparation, retina, application

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ

ЦХРД – центральна хоріоретинальна дистрофія

КФНК – кріоконсервовані фетальні нервові клітини

ПФПК – препарати фетоплацентарного комплексу

TGF β-1 – трансформуючий фактор росту бета-1

GNF – фактор росту нервів

ПЛР – полімеразно ланцюгова реакція

DDC – 3,3 -'dioctadecyloxacarbocyanine bromide DDC

Відповідальний за випуск Г.О. Бабійчук

Підписано до друку 8.04.08р. Формат 60Ч84 1/16

Папір офсетний. Друк ризографія.

Умов. друк. арк. 0,9. Тир. 100 прим. Замовлення № 121

Надруковано ПКФ «Яна».

м. Харків, пр. Леніна, 38. Т. (057) 714-06-66.