НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

САВУСТЬЯНЕНКО АНДРІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ

УДК 616-002-018.2; 616.831

ВПЛИВ ВЕГЕТАТИВНОЇ РЕГУЛЯЦІЇ НА ПЕРЕБІГ

СИСТЕМНОЇ ЗАПАЛЬНОЇ ВІДПОВІДІ

14.03.04-патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Центральній науково-дослідницькій лабораторії Донецького національного медичного університету ім. М. Горького

Науковий керівник: доктор медичних наук, старший науковий співробітник

Зінкович Ігор Іванович,

завідувач Центральної науково-дослідницької лабораторії

Донецького національного медичного університету

ім. М. Горького МОЗ України

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Гуляр Сергій Олександрович,

провідний науковий співробітник відділу експериментальної кардіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

доктор медичних наук, професор

Хара Марія Романівна,

завідувач кафедри патологічної фізіології

Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України

Захист дисертації відбудеться “4” березня 2008 року о “14” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розіслано “1” лютого 2008 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук

Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Велика кількість захворювань у своїй основі має такий типовий патологічний процес, як запалення (Beck G.C. et al., 2004). Звичайно запальна реакція починається з локальних проявів, в основі яких лежать специфічні і неспецифічні реакції клітинного і гуморального імунітету, вивільнення цитокинів та ін. (Титов В.М., 2003).

У випадку, коли компенсаторні сили організму виявляються недостатніми для обмеження запалення в місці первинної локалізації, медіатори запалення виходять у кров'яне русло, сприяючи генералізації запального процесу (Shapiro N. et al., 2006; Lagan A.L. et al., 2007). Як наслідок, розвивається синдром системної запальної відповіді, що клінічно характеризується збільшенням частоти серцевих скорочень (більше 90 уд/хв), зміною температури тіла (нижче 360С або вище 380С), збільшенням частоти дихальних рухів (більше 20 разів/хв) чи зниженням парціального тиску вуглекислого газу в крові (менше 32 мм. рт. ст.), різкою зміною вмісту лейкоцитів (менше 4000 кліток/мм3 або більше 12000 кліток/мм3) чи присутністю більше 10% незрілих нейтрофілів (Лейдерман І.М., 1999).

При порушеннях у системах регуляції і погано корегуємому перебігу синдрому системної запальної відповіді розвивається одне з найбільш грізних його ускладнень – поліорганна недостатність (Єльський В.М. і ін., 2002; Wheeler A.P., 2007). У загальній структурі смертності хворих реанімаційного профілю клінічні ознаки поліорганної недостатності складають 50 - 80% (Weigand M.A. et al., 2004). Крім того, показано, що наявність двох симптомів синдрому системної запальної відповіді приводить до розвитку органної дисфункції в 1,8% пацієнтів із гнійно-запальною патологією, а при виявленні трьох і більш симптомів протягом доби частота розвитку тяжкого сепсису зростає до 22,5%, летальність складає 2% (Leclerc F. et al., 2005).

Таким чином, пошук і уточнення патогенетичних механізмів розвитку синдрому системної запальної відповіді, шляхів його корекції є важливою задачею, оскільки саме цей початковий етап генералізації запалення є вирішальним у подальшому розвитку септичного шоку і смерті хворого.

В останні роки на культурах імунних кліток була показана можливість регуляції запалення через холінергічний протизапальний механізм (Czura C.J. et al., 2003). Доведено, що при впливі ацетилхоліну на N-холінорецептори макрофагів і гліальних кліток зменшується синтез і вивільнення прозапальних цитокинів - головне значення має зниження продукції TNF-α, HMGB1. У подальших дослідженнях з’ясували, що за реалізацію такого шляху пригнічення запалення відповідальна альфа-7 субодиниця N-холінорецепторів (Pavlov V.A. et al., 2006; Wang H. et al., 2003).

Відомо, що однаково несприятлива як недостатня запальна відповідь, що веде, наприклад, до вторинної інфекції, так і надлишкова, що веде до системних ушкоджень. Вважають, що виявлений холінергічний протизапальний механізм може регулювати величину запальної відповіді, утримуючи її у визначених межах (Czura C.J., Tracey K.J., 2005).

Отже, вивчення ефективності холінергічного протизапального шляху в цілісному організмі, з'ясування тонких механізмів даної регуляторної ланки може внести вагомий вклад у розуміння закономірностей розвитку синдрому системної запальної відповіді.

Необхідність одержання таких знань обумовлена і тим, що принципи холінергічної регуляції запальної реакції можуть бути покладені в основу розробки прямої й опосередкованої N-холінорецептор-орієнтованої терапії синдрому системної запальної відповіді.

Ймовірно, у цілісному організмі холінергічний протизапальний ефект вегетативної нервової системи приводить до гальмування розвитку системного запального процесу. Тому представляється перспективним одночасне вивчення змін в активності вегетативної нервової системи та її N-холінергічних ефектів в експерименті. Тим більше, що в даний час став доступний метод неінвазивної оцінки виразності вегетативних впливів за допомогою спектрального аналізу варіабельності серцевого ритму (Malik M. et al., 1999).

Проблема, однак, полягає в тому, що стандарти використання спектрального аналізу розроблені тільки для клінічного застосування (Коркушко О.В. і ін., 2003). При роботі з експериментальними тваринами згаданий метод також застосовують, але його використання вимагає додаткової адаптації (Яблучанський М.І. і ін., 2005; Хара М.Р., 2003).

Таким чином, досить актуально більш глибоко вивчити вплив вегетативної регуляції на перебіг системної запальної відповіді in vivo і з'ясувати, чи опосередковані ці ефекти N-холінорецепторним протизапальним механізмом.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках планової науково-дослідницької роботи Центральної науково-дослідницької лабораторії Донецького національного медичного університету ім. М. Горького „Визначити роль вегетативної нервової, гуморальної регуляції та особливості окислювального метаболізму у забезпеченні індивідуальної стійкості організмів в екстремальних умовах” (державний реєстраційний номер 0104U010590).

Ціль дослідження: виявити закономірності впливу вегетативної нервової системи на перебіг синдрому системної запальної відповіді.

Для досягнення поставленої мети були сформульовані такі задачі дослідження:

1. Модифікувати метод спектрального аналізу варіабельності серцевого ритму для застосування у щурів.

2. Вивчити взаємозв'язок між похідним станом вегетативної нервової системи, її реактивністю у відповідь на стимуляцію α-адренорецепторів і виживаністю щурів при розвитку синдрому системної запальної відповіді.

3. Визначити зміни вегетативної регуляції при розвитку синдрому системної запальної відповіді і їхній взаємозв'язок із виживаністю.

4. Оцінити біохімічні зміни в тканинах внутрішніх органів щурів в умовах синдрому системної запальної відповіді й установити їхній взаємозв'язок з параметрами активності вегетативної нервової системи.

5. З'ясувати можливості управління перебігом синдрому системної запальної відповіді шляхом стимуляції N-холінорецепторів.

Об'єкт дослідження: синдром системної запальної відповіді.

Предмет дослідження: стан вегетативної регуляції у щурів із синдромом системної запальної відповіді.

Методи дослідження: фізіологічний експеримент (моделювання синдрому системної запальної відповіді за допомогою перев'язки і пункції сліпої кишки), функціональні (ЕКГ), математичні (спектральний аналіз варіабельності серцевого ритму), біохімічні (спектрофотометричне визначення активності катепсину Д, лактатдегідрогенази, вмісту малонового діальдегіду, α-токоферолу, активності каталази в тканинах внутрішніх органів), статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше виявлено, що до відтворення моделі системної запальної відповіді високостійкі тварини характеризуються вираженим приростом активності парасимпатичного відділу вегетативної нервової системи у відповідь на фармакологічну стимуляцію α-адренорецепторів.

Вперше описані особливості перебудови вегетативної регуляції у щурів при розвитку синдрому системної запальної відповіді. У високостійких щурів, на відміну від загиблих, у перші години експерименту спостерігається ріст потужності обох ланок вегетативної регуляції.

Виявлено характер змін біохімічних процесів у внутрішніх органах щурів у перші години розвитку синдрому системної запальної відповіді. Зростає внутрішньотканинна активність катепсину Д, причому найбільш рання і виражена активація даного ферменту має місце в печінці і нирках. Активність лактатдегідрогенази збільшується пропорційно давності патологічного процесу; приріст активності даного ферменту в групі високостійких тварин менш виражений, а в тканині легень і нирок - був відсутній. Ріст вмісту малонового діальдегіду поєднується з підвищенням активності каталази. У групі низькостійких тварин виснажуються запаси ендогенного α-токоферолу в печінці.

Вперше виявлено, що ріст активності катепсину Д и лактатдегідрогенази, вмісту малонового діальдегіду і α-токоферолу, активності каталази у внутрішніх органах після моделювання синдрому системної запальної відповіді зворотно корелює з активністю парасимпатичної нервової системи.

Вперше показано, що селективна фармакологічна стимуляція N-холінорецепторів в умовах синдрому системної запальної відповіді гальмує активацію лактатдегідрогенази і катепсину Д у всіх внутрішніх органах, частково запобігає інтенсифікації перекісного окислювання ліпідів і активізації антиоксидантної системи, поліпшує показники виживаності щурів в умовах моделі синдрому системної запальної відповіді.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів полягає в тому, що додатково до вже вивчених гуморального і клітинного механізмів запуску і розвитку системного запалення необхідно враховувати і нервовий, вегетативний компонент, який в значній мірі обумовлює наслідки даного патологічного процесу.

Розгляд механізмів синдрому компенсаторної протизапальної відповіді необхідно доповнити N-холінергічним протизапальним шляхом, в ініціюванні роботи якого істотна роль приділяється вегетативній нервовій системі.

Отримані дані щодо протективної ролі парасимпатичної нервової системи під час розвитку синдрому системної запальної відповіді служать патофізиологічним обґрунтуванням для пошуку фармакологічних засобів, що знижують інтенсивність запалення за допомогою прямої стимуляції вагуса чи вибірково N-холінорецепторів.

Проведене комплексне дослідження з адаптації технології спектрального аналізу варіабельності серцевого ритму для застосування у лабораторних тварин дозволило розробити стандартні вимоги до використання даного методу при оцінці активності вегетативної нервової системи у щурів: визначена оптимальна тривалість ділянок кардіоритмограми, що аналізуються; рекомендовані частотні діапазони для оцінки симпатичних і парасимпатичних впливів; доведені можливість і доцільність оцінки спектрального аналізу варіабельності серцевого ритму під загальним наркозом; визначені особливості впливу різних анестетиків на показники спектрального аналізу варіабельності серцевого ритму.

Дані про різну реактивність вегетативних відділів у відповідь на стимуляцію α-адренорецепторів у щурів зі сприятливим і несприятливим прогнозом дозволяють проводити подібну класифікацію тварин при проведенні досліджень синдрому системної запальної відповіді.

Одночасно, завдяки наявності кореляційних зв'язків між станом вегетативної регуляції і біохімічних показників у внутрішніх органах дослідник одержує можливість прогнозувати вагу органних ушкоджень при відтворенні синдрому системної запальної відповіді за допомогою перев'язки і пункції сліпої кишки.

Щоб одержати можливість вивчати репаративні процеси при сприятливих наслідках системного запального процесу, дослідник може загальмовувати розвиток запалення за допомогою стимуляції N-холінорецепторів шляхом одночасного введення неостигміну (100 мкг/кг п/к) і атропіну (50 мкг/кг п/к).

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно виконав інформаційний пошук, сформулював мету і задачі дослідження, вибрав методи дослідження, спланував і виконав експерименти, провів статистичну обробку результатів дослідження, узагальнив отримані дані й оформив рукопис.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були повідомлені на на ІV Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Чернівці, травень 2004 р.), III-му конгресі патофізіологів Росії (Москва, жовтень 2004 р.), науково-практичній конференції «Нейроендокринні і імунні механізми регуляції гомеостазу в нормі та патології» (Запоріжжя, травень 2005 р.), науково-практичній конференції «Эндотоксикоз: природа, диагностика, принципы коррекции» (Волгоград, травень 2005 р.), IV-х читаннях ім. В.В. Підвисоцького (Одеса, травень 2005 р.), науково-практичній конференції «Комп’ютерна медицина - 2005» (Харків, червень 2005 р.), науково-практичній конференції «Гомеостаз: физиология, патология, фармакология и клиника» (Одеса, вересень 2005 р.), ІІІ-й конференції Українського товариства нейронаук (з міжнародною участю), присвяченій 75-річчю Донецького державного медичного університету ім. М. Горького (Донецьк, вересень 2005 р.), 5th International Congress of Pathophysiology (Beijing, China, June 28 – July 1, 2006), науково-практичній конференції «Актуальні питання патофізіології” (Ялта, жовтень 2006 р.), науково-практичній конференції «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы» (Донецьк-Слов’янськ, травень 2007 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 13 наукових робіт, у тому числі 6 статей у фахових журналах ВАК України, 7 тез доповідей на наукових конференціях.

Структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, 7 розділів, висновків і списку використаної літератури, викладена на 168 сторінках друкованого тексту. Робота містить 13 таблиць на 7 сторінках, 55 рисунків на 24 сторінках. Список літературних джерел включає 199 вітчизняних і іноземних найменувань на 20 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Реалізація задач даного дослідження проведена на 183 білих щурах-самцях лінії Вістар, яких утримували в стандартних умовах віварію. В експерименти включали тварин масою 200 – 300 г без ознак захворювань. Перед проведенням досліджень щурів протягом тижня адаптували до лабораторних умов і персоналу.

Перша серія досліджень була присвячена модифікації технології спектрального аналізу варіабельності серцевого ритму до роботи з щурами. Така необхідність обумовлена відсутністю на сьогоднішній день єдиних стандартів по використанню даного методу у малих лабораторних тварин.

У цілому у 20 тварин зареєстрували 164 десятихвилинних записи ЕКГ, що послужили матеріалом для оцінки прийнятності підходів до оцінки стаціонарності процесів, вибору адекватного математичного методу спектрального перетворення, розрахунку оптимальної довжини аналізованої ділянки і визначення діапазонів частот для оцінки вегетативних впливів.

Для попередження реєстрації перехідних процесів у стані вегетативної регуляції щурів, і, отже, підвищення відтворюваності результатів спектрального аналізу варіабельності серцевого ритму, у цих тварин у різні дні реєстрували кардіоритмограми в стані наркотичного сну. Використано наступні анестетики: кетамін 75 мг/кг в/м, тіопентал-натрій 75 мг/кг в/п і галотан 0,5%. Щоб визначити, чи зберігається в цих умовах реактивність вегетативної нервової системи, в окремих експериментах анестезованим тваринам проводили пробу з фармакологічною стимуляцією α-адренорецепторів – однократно внутришньом’язово вводили фенілефрин у дозі 2 мг/кг.

В другій серії експериментів у 29 щурів вивчали залежність між станом і реактивністю різних відділів вегетативної нервової системи і виживаністю щурів в умовах моделі синдрому системної запальної відповіді. З використанням технології спектрального аналізу варіабельності серцевого ритму вивчили похідний стан вегетативної регуляції та її реакцію у відповідь на стимуляцію α-адренорецепторів за допомогою фенилефрину в тій самій дозі. Потім моделювали синдром системної запальної відповіді за допомогою загальноприйнятого методу перев'язки і пункції сліпої кишки. Через 2 години після закінчення операції знову оцінювали вегетативний статус тварин. Після цього за тваринами спостерігали, реєструючи їхню 10-добову виживаність.

У третій серії експериментів вивчали індивідуальні особливості виразності метаболічних порушень у внутрішніх органах щурів, що розрізняються станом і реактивністю вегетативної нервової системи. На підставі результатів, отриманих у попередніх серіях, за допомогою спектрального аналізу варіабельності серцевого ритму тварин третьої серії (54 щура) попередньо поділяли на контрольну групу (12 тварин) і групи зі сприятливим і несприятливим прогнозом для життя в моделі синдрому системної запальної відповіді (20 і 22 тварин відповідно). Після того, як модель відтворювали, через кожні 2 години методом декапітації виводили по три особі для відстеження динаміки зміни активності катепсину Д, лактатдегідрогенази, каталази, концентрації малонового діальдегіду, α-токоферолу в тканинах серця, легень, печінки і нирок. На 8 годину спостереження з експерименту виводили по 10 щурів зі сприятливим і несприятливим прогнозом для вивчення кореляційних зв'язків між біохімічними показниками і спектральними характеристиками варіабельності серцевого ритму.

В експериментах четвертої серії на 20 щурах були підібрані такі дози неостигміну (100 мкг/кг п/ш) і атропіну (50 мкг/кг п/ш), щоб при одночасному введенні вони були фізіологічно еквівалентними у відношенні М-холінорецепторних ефектів – частота серцевих скорочень і артеріальний тиск мінялися не більше ніж на 5%., що дозволяло вибірково стимулювати N-холінорецептори.

Для з'ясування впливу N-холінорецепторного протизапального шляху на прогноз для життя в 21 щура в моделі синдрому системної запальної відповіді через кожні 2 години повторювали одночасні ін'єкції неостигміну й атропіну протягом 8 годин. Виживаність оцінювали протягом 10 діб (п'ята серія експериментів).

Дослідження біохімічних показників у внутрішніх органах при стимуляції N-холінорецепторів виконали в 39 щурів з несприятливим прогнозом за даними СА ВСР. З них 19 щурів – основна група, що одержувала через кожні 2 години підшкірні ін'єкції неостигміну й атропіну, 20 щурів – плацебо-група, що одержувала в ті ж терміни замість вегетотропних препаратів підшкірні ін'єкції фізіологічного розчину в еквівалентних об'ємних дозах (шоста серія експериментів).

Результати дослідження та їх обговорення. В результаті модифікації спектрального аналізу варіабельності серцевого ритму до застосування у щурів були розроблені стандартні вимоги до використання даного методу для оцінки активності вегетативної нервової системи в цього виду тварин. Зокрема, оптимальна тривалість ділянок кардіоритмограми - 2 хв. Потужність симпатичних впливів необхідно оцінювати в діапазоні від 0,08 до 0,6 Гц, а парасимпатичних – у діапазоні від 0,6 до 3,0 Гц. Застосування загальних анестетиків поліпшує відтворюваність одержуваних результатів.

При введенні щурів у загальний наркоз вегетативна нервова система зберігає здатність відповідати на впливи, що подразнюють її. Прикладом може служити ріст потужності вегетативної регуляції у всіх діапазонах частот у відповідь на введення фенілефрину 2 мг/кг в/м (рис. 1).

Аналіз виживаності щурів в умовах моделі перев'язки і пункції сліпої кишки показав, що протягом 10 днів спостереження гине біля ѕ тварин, причому головним чином - у ранній термін (1-2 доба) експерименту (рис. 2).

Стійкість тварин у розглянутій моделі системної запальної відповіді статистично зв'язана з їхньою похідною чутливістю до адреноміметиків. До моделювання в обох підгрупах тварин у відповідь на введення фенілефрину ростуть показники спектральної потужності в обох виділених нами діапазонах частот. Причому, для стійких до операції перев'язки і пункції сліпої кишки тварин характерна більш виражена реакція високочастотних регуляторних впливів, що відбивають переважно парасимпатичну модуляцію серцевого ритму (табл. 1, 2).

Таблиця 1

Спектральні показники варіабельності серцевого ритму

у щурів, що вижили після операції перев'язки і пункції сліпої кишки

(M ± m; n=6)

Показники	Похідні умови	Після введення фенілефрину	Після виконання операції
PLF, мс2	0,113 ± 0,009	0,542 ± 0,067*	0,356 ± 0,028*
PHF, мс2	1,350 ± 0,116	5,924 ± 0,536*	2,681 ± 0,212*
PLF/PHF	0,087 ± 0,005	0,091 ± 0,004	0,137 ± 0,009

* p<0,05 у порівнянні з похідними показниками

Таблиця 2

Спектральні показники варіабельності серцевого ритму

у щурів, що загинули після операції перев'язки і пункції сліпої кишки

(M ± m; n=23)

Показники	Похідні умови	Після введення фенілефрину	Після виконання операції
PLF, мс2	0,105 ± 0,008	0,502 ± 0,057*	0,208 ± 0,014*0
PHF, мс2	1,548 ± 0,178	4,504 ± 0,492*0	1,127 ± 0,0920
PLF/PHF	0,103 ± 0,007	0,118 ± 0,009	0,283 ± 0,020*

* p<0,05 у порівнянні з похідними показниками

0 p<0,05 у порівнянні з підгрупою тварин, що вижили (табл. 1)

Після моделювання системної запальної відповіді відбуваються виражені зміни спектральних характеристик стану нейрогуморальної регуляції. У підгрупі щурів, що вижили, наявність гострого бактеріального запалення в черевній порожнині супроводжується зростанням показників потужності регуляції в обох виділених діапазонах частот. Для підгрупи загиблих тварин характерна менша реакція з боку симпатичних впливів, а з боку парасимпатичних механізмів спостерігається тенденція до ослаблення регуляторних впливів. В результаті, у нестійких до впливу тварин спостерігається виражений ріст показника симпатовагального балансу (табл. 1, 2).

При системному запаленні в групі тварин з несприятливим прогнозом після операції перев'язки і пункції сліпої кишки спостерігається збільшення активності і вмісту практично всіх досліджених показників, що характеризують як виразність ушкодження тканин внутрішніх органів, так і інтенсивність перекісного окислювання ліпідів, напругу антиоксидантної системи. Швидше всього й в більшій мірі відзначається ріст вмісту малонового діальдегіду й активності каталази в печінці в порівнянні з іншими органами. У легенях активність катепсину Д вірогідно не змінюється (табл. 3, 4).

При проведенні кореляційного аналізу між біохімічними показниками виразності ушкодження тканин внутрішніх органів, інтенсивності перекісного окислювання ліпідів, напруги антиоксидантної системи, з одного боку, і показниками варіабельності серцевого ритму, з іншого боку, в обох підгрупах тварин виявлені тісні зворотні зв'язки (R = -0,61 – -0,91). При цьому, в кореляційні пари входять практично всі досліджені біохімічні показники, у той час як з показників варіабельності серцевого ритму беруть участь переважно показники потужностей парасимпатичних впливів інтактних щурів і після введення фенілефрину.

Після моделювання системної запальної відповіді в групі із сприятливим прогнозом багато біохімічних показників тканин органів перевищують значення контрольної групи, але разом з тим нижче значень, отриманих для групи з несприятливим прогнозом після операції перев'язки і пункції сліпої кишки. Вміст α-токоферолу в жодному з органів вірогідно не відрізняється від значень контрольної групи. Не збільшується активність катепсину Д в легенях і серці. У легенях, крім того, відсутні достовірні зміни активності лактатдегідрогенази. Перераховане відрізняє групу тварин із сприятливим прогнозом не тільки від контрольної групи щурів, але й від групи з несприятливим прогнозом (табл. 3 - 5).

Таблиця 3

Біохімічні показники у внутрішніх органах

контрольної групи щурів

(M ± m; n=12)

Показники	Серце	Легені	Печінка	Нирки
Катепсин Д, О/хв*100 г тканини	12,2 ± 1,08	22,1 ± 1,93	18,0 ± 1,26	7,74 ± 0,68
Лактатдегідрогеназа, нкат/10 г тканини	57,1 ± 4,89	31,0 ± 2,76	29,1 ± 2,05	64,5 ± 5,80
Малоновий діальдегід, нмоль/г тканини	9,72 ± 0,56	23,4 ± 2,11	13,8 ± 1,38	16,9 ± 1,24
α-токоферол, нмоль/г тканини	33,7 ± 2,90	35,7 ± 3,24	78,8 ± 6,57	38,2 ± 3,71
Каталаза, мкат/г тканини	233,1 ± 21,52	107,5 ± 8,36	92,7 ± 8,72	211,1 ± 20,45

Проведені дослідження показали, що при моделюванні септичного варіанта синдрому системної запальної відповіді на фоні одночасної фармакологічної терапії неостигміном і атропіном виживаність тварин збільшувалася приблизно в 2,5 рази в порівнянні з нелікованими тваринами (рис. 3).

Підвищення стійкості тварин до відтвореної моделі зв'язане з тим, що при стимуляції N-холінорецепторів одночасним введенням розчинів неостигміну й атропіну у всіх внутрішніх органах було менш виражене перекісне окислювання ліпідів, про що свідчать більш низькі рівні внутрішньотканинного вмісту малонового діальдегіду в порівнянні з тваринами без фармакологічної терапії (табл. 6).

Таблиця 4

Біохімічні показники у внутрішніх органах у групі щурів з несприятливим прогнозом після операції перев'язки і пункції сліпої кишки на 8 годину експерименту

(M ± m; n=19)

Показники	Серце	Легені	Печінка	Нирки
Катепсин Д, О/хв*100 г тканини	277,4 ± 26,51*	195,0 ± 18,41*	247,5 ± 23,82*	267,2 ± 26,13*
Лактатдегідрогеназа, нкат/10 г тканини	17,8 ± 1,67*	66,5 ± 6,49*	151,9 ± 15,07*	89,4 ± 8,74*
Малоновий діальдегід, нмоль/г тканини	31,3 ± 3,25	35,3 ± 3,38	32,2 ± 3,10*	66,7 ± 6,26*
α-токоферол, нмоль/г тканини	168,3 ± 15,83*	48,9 ± 4,61*	50,0 ± 5,17*	85,1 ± 8,35*
Каталаза, мкат/г тканини	20,5 ± 1,98*	19,5 ± 1,84	31,1 ± 2,88*	30,8 ± 2,94*

* p<0,05 у порівнянні з контрольною групою (табл. 3)

Таблиця 5

Біохімічні показники у внутрішніх органах у групі щурів із сприятливим прогнозом після операції перев'язки і пункції сліпої кишки на 8-му годину експерименту

(M ± m; n=19)

Показники	Серце	Легені	Печінка	Нирки
Катепсин Д, О/хв*100 г тканини	256,2 ± 25,04*0	175,1 ± 16,79*0	201,5 ± 19,83*0	246,4 ± 24,560
Лактатдегідрогеназа, нкат/10 г тканини	13,5 ± 1,31*0	46,3 ± 4,28*0	91,9 ± 9,07*0	59,7 ± 5,79*0
Малоновий діальдегід, нмоль/г тканини	33,9 ± 3,44	35,1 ± 3,38	77,2 ± 7,520	36,5 ± 3,590
α-токоферол, нмоль/г тканини	98,7 ± 9,91*0	31,9 ± 2,960	42,3 ± 4,15*0	65,4 ± 6,480
Каталаза, мкат/г тканини	11,9 ± 1,070	21,5 ± 1,99	23,1 ± 2,17*0	20,3 ± 2,13*0

* p<0,05 у порівнянні з контрольною групою (табл. 3)

0 p<0,05 у порівнянні з групою тварин з несприятливим прогнозом після операції перев'язки і пункції сліпої кишки (табл. 4)

Таблиця 6

Біохімічні показники у внутрішніх органах у групі щурів, що одержували після операції перев'язки і пункції сліпої кишки одночасну терапію неостигміном і атропіном на 8-му годину експерименту

(M ± m; n=12)

Показники	Серце	Легені	Печінка	Нирки
Катепсин Д, О/хв*100 г тканини	260,3 ± 25,92*	156,9 ± 15,37*0	150,2 ± 14,85*0	250,2 ± 25,21*
Лактатдегідрогеназа, нкат/10 г тканини	13,5 ± 1,30*0	30,9 ± 2,89*0	78,7 ± 7,51*0	67,3 ± 6,28*0
Малоновий діальдегід, нмоль/г тканини	15,8 ± 1,46*0	35,5 ± 3,26	77,2 ± 7,840	36,5 ± 3,320
α-токоферол, нмоль/г тканини	121,1 ± 12,36*0	28,9 ± 2,630	36,1 ± 3,41*0	64,0 ± 6,220
Каталаза, мкат/г тканини	11,7 ± 1,030	20,7 ± 1,94	18,1 ± 1,750	14,8 ± 1,30*0

* p<0,05 у порівнянні контрольною групою (табл. 3)

0 p<0,05 у порівнянні з групою тварин з несприятливим прогнозом після операції перев'язки і пункції сліпої кишки без фармакологічної терапії (табл. 4)

Крім того, відзначили менше залучення антиоксидантної системи, що випливає з більш низьких цифр активності каталази і практично незмінного вмісту α-токоферолу, слабкіше виражені явища тканинної гіпоксії, через що активність лактатдегідрогенази перетерплювала відносно невеликі зміни, в меншій мірі було виражене ушкодження тканин, що випливало з мало змінної активності лізосомального ферменту катепсину Д.

Таким чином, можна зробити висновок, що саме стимуляція N-холінорецепторів приводить до меншої виразності синдрому системної запальної відповіді і підвищенню виживаності тварин.

Цей феномен може бути частково пояснений виходячи з недавно проведених in vitro досліджень, у яких на ізольованих макрофагах і нейтрофілах було продемонстровано, що фармакологічна стимуляція N-холінорецепторів приводить до зниження продукції в них прозапальних цитокинів, таких як TNF-?, HMGB1, IL-1, IL-6 (Borovikova L.V. et al., 2000; Pavlov V.A., Tracey K.J., 2004). Показано також, що за ці ефекти відповідальна переважно альфа-7 субодиниця N-холінорецепторів (Pavlov V.A. et al., 2006; Wang H. et al., 2003).

Як відомо, прозапальні цитокини роблять тригерний вплив на розвиток запального процесу шляхом регулюючого впливу на функціональний стан імунних кліток організму (Martins P.S. et al., 2006; Guo R.F. et al., 2006; Sugita S. et al., 2002), активізують гіпоталамо-гіпофізарно-надниркову вісь стресорної відповіді шляхом впливу на аферентні волокна блукаючого нерва (Borovikova L.V. et al., 2000), ініціюють механізми апоптозу в ушкоджених клітках (Liu M. et al., 2006) і т.д.

Тому обмеження сумарної фракції вивільнення цитокинів при розвитку синдрому системної запальної відповіді шляхом фармакологічного впливу на N-холінорецептори макрофагів і нейтрофілів оказує інгібуючий вплив на розвиток патологічного процесу, знижує інтенсивність запальної реакції, відстрочує її розвиток, що в багатьох випадках дозволяє захисним механізмам обірвати патогенетичні ланки і вивести організм на шлях одужання.

ВИСНОВКИ

Спектральний аналіз варіабельності серцевого ритму дозволяє кількісно оцінити стан і реактивність різних ланок вегетативної регуляції у щурів при дотриманні наступних умов: реєструвати 2-х хв. стаціонарні ділянки ритмокардіограми, симпатичні впливи оцінювати в діапазоні низьких (від 0,08 до 0,6 Гц), а парасимпатичні – у діапазоні високих (від 0,6 до 3,0 Гц) частот. Застосування загальних анестетиків поліпшує відтворюваність кількісних оцінок стану і реактивності вегетативної регуляції.

При моделюванні синдрому системної запальної відповіді за допомогою перев'язки і пункції сліпої кишки гине 79% щурів. Причому, у похідних умовах високостійкі тварини відрізняються вираженим (у 4,4 рази) приростом потужності регуляції парасимпатичного відділу вегетативної нервової системи у відповідь на фармакологічну стимуляцію α-адренорецепторів.

Розвиток синдрому системної запальної відповіді у високостійких щурів, на відміну від загиблих, протягом 2 годин експерименту приводить до закономірного росту потужності вегетативної регуляції, причому тонус парасимпатичного відділу збільшується в 2 рази, а симпатичного – у 3,2 рази.

Модель синдрому системної запальної відповіді приводить до ушкодження внутрішніх органів - росте активність протеолітичного ферменту катепсину Д, причому найбільш рання (перші 2-4 години) і виражена (у середньому 2,5 рази) активація даного ферменту має місце в печінці і нирках.

Синдром системної запальної відповіді супроводжується інтенсифікацією перекісного окислювання ліпідів у внутрішніх органах: внутрішньотканинний вміст малонового діальдегіду росте в середньому в 4,3 рази; активність каталази підвищується в середньому в 1,6 рази; у групі низькостійких тварин запаси ендогенного α-токоферолу в печінці на 8-й годині експерименту знижуються в 2,4 рази.

Розвиток синдрому системної запальної відповіді в групі низькостійких щурів приводить до активування лактатдегідрогенази в тканинах внутрішніх органів у середньому в 1,9 рази, причому ступінь активування пропорційний давнині патологічного процесу. Приріст активності внутришньотканинної лактатдегідрогенази в групі високостійких тварин менш виражений, а в тканині легень і нирок - був відсутній.

Щури, що відрізняються у похідних умовах низьким тонусом парасимпатичної нервової системи і низькою реактивністю даного відділу на стимуляцію α-адренорецепторів, характеризуються більшою активацією катепсину Д и лактатдегідрогенази, більш вираженими змінами перекісного окислювання ліпідів і антиоксидантної системи (коефіцієнти парної кореляції Спірмена склали від -0,61 до -0,91).

Селективна фармакологічна стимуляція N-холінорецепторів при моделюванні синдрому системної запальної відповіді частково запобігає інтенсифікації перекісного окислювання ліпідів і антиоксидантних механізмів, гальмує активацію лактатдегідрогенази і катепсину Д у всіх внутрішніх органах, що супроводжується збільшенням показника 10-добової виживаності щурів на 46%.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Статті:

Савустьяненко А.В., Хрипаченко И.А., Зинкович И.И., Городецкий О.Ю., Вислый А.А. Влияние общей анестезии на вариабельность сердечного ритма в эксперименте // Український журнал екстремальної медицини ім. Г.О. Можаєва. – 2004. – Т. 5, №1 (додаток). – С. 100 – 104.

Хріпаченко І.А., Савустьяненко А.В., Кеденко Л.А., Зінкович І.І. Аналіз варіабельності серцевого ритму в оцінці барорефлекторної чутливості наркотизованих щурів // Фізіол. журн. - 2005. - Т. 51, №2.- С. 46 - 50.

Савустьяненко А.В., Хрипаченко И.А., Кеденко Л.А., Зинкович И.И. Вегетативная регуляция устойчивости к экстремальным факторам // Запорожский медицинский журнал. - 2005. - № 4. - С. 44 - 46.

Хрипаченко И.А., Савустьяненко А.В., Бессмертный С.А., Зинкович И.И. Стандартизация подходов к спектральному анализу вариабельности сердечного ритма у крыс // Збірник статей “Питання експериментальної та клінічної медицини”. - Донецьк. - 2005. - вип. 9, Т. 1. - С. 166 - 170.

Савустьяненко А.В., Хрипаченко И.А., Курганская Л.Л., Зинкович И.И. Состояние вегетативной регуляции при системном воспалительном ответе // Питання експериментальної та клінічної медицини. - 2007. – вип. 11, Т. 1. – С. 159 – 164.

Савустьяненко А.В., Оленич В.В., Ковальчук Л.Н., Копач Е.В., Зинкович И.И. Влияние стимуляции N-холинорецепторов на выживаемость крыс и повреждение органов при синдроме системного воспалительного ответа // Питання експериментальної та клінічної медицини. - 2007. – вип. 11, Т. 2. – С. 77 – 82.

Тези доповідей:

Хрипаченко И.А., Зинкович И.И., Савустьяненко А.В., Бессмертный С.А., Бурда И.Ю. Вариабельность сердечного ритма в модели септического шока // Первая международная дистанционная научно-практическая конференция «Новые технологии в медицине». - Санкт-Петербург. - 2004. – С. 66 – 67.

Хрипаченко И.А., Зинкович И.И., Савустьяненко А.В. Наркозные средства как модуляторы вариабельности сердечного ритма // Тезисы докладов 2 международной научной конференции «Гомеостаз: физиология, патология, фармакология и клиника». – Одесса. - 2005. - С. 209 - 212.

Хрипаченко И.А., Савустьяненко А.В., Зинкович И.И., Бессмертный С.А. Нейрогуморальная регуляция при экспериментальном эндотоксикозе // Материалы Всероссийского симпозиума «Эндотоксикоз: природа, диагностика, принципы коррекции». - Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН и Администрации Волгоградской области .- 2005.- №1.- С. 38 - 39.

Khripachenko I., Savustyanenko A., Zinkovych I. Role of autonomic nervous system in systemic inflammatory response syndrome // 5th International Congress of Pathophysiology. - Chinese Journal of Pathophysiology. - 2006. - V. 22, №13 (Suppl.). - P. 99 - 100.

Савустьяненко А.В., Зинкович И.И. Спектральный анализ вариабельности сердечного ритма в практике патофизиологических исследований // Материалы конференции «Актуальні питання патофізіології». - Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения. – 2006. – Т. 142, часть III. – С. 247.

Савустьяненко А.В., Курганская Л.Л., Пата О.Г., Таран А.С. Влияние вегетативной нервной системы на выраженность септического повреждения печени // Материалы международной конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы». – Нейронауки: теоретичні та клінічні аспекти. - 2007. – Т. 3, №1 (додаток). – С. 38.

Хрипаченко И.А., Савустьяненко А.В. Роль вегетативной регуляции в развитии системного воспалительного ответа // Материалы международной конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы». – Нейронауки: теоретичні та клінічні аспекти. - 2007. – Т. 3, №1 (додаток). – С. 54.

АНОТАЦІЯ

Савустьяненко А.В. Вплив вегетативної регуляції на перебіг системної запальної відповіді. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за фахом 14.03.04 – патологічна фізіологія. Інститут фізіології ім. акад. А.А. Богомольця НАН України, Київ, 2008.

У дисертаційній роботі представлені теоретичне узагальнення і нове рішення наукової проблеми, що полягає в розкритті N-холінергічного шляху управління системною запальною відповіддю.

Дослідження виконане на 183 щурах-самцях лінії Вістар з використанням спектрального аналізу варіабельності серцевого ритму для оцінки активності вегетативної нервової системи і спектрофотометрії для визначення внутрішньотканинної активності ферментів. Було виявлено, що до відтворення моделі системної запальної відповіді за допомогою перев'язки і пункції сліпої кишки високостійкі тварини характеризуються вираженим приростом активності парасимпатичного відділу вегетативної нервової системи у відповідь на фармакологічну стимуляцію α-адренорецепторів. При розвитку системного запалення у високостійких щурів, на відміну від загиблих, у перші години експерименту спостерігається ріст потужності обох ланок вегетативної регуляції.

У перші години розвитку синдрому системної запальної відповіді росте внутрішньотканинна активність катепсину Д, причому найбільш рання і виражена активація даного ферменту має місце в печінці і нирках. Активність лактатдегідрогенази збільшується пропорційно давнині патологічного процесу; приріст активності даного ферменту в групі високостійких тварин менш виражений, а в тканині легень і нирок - був відсутній. Ріст вмісту малонового діальдегіду поєднується з підвищенням активності каталази. У групі низькостійких тварин виснажуються запаси ендогенного α-токоферолу в печінці. Усі зареєстровані біохімічні порушення зворотно корелювали з активністю парасимпатичної нервової системи.

Було показано, що селективна фармакологічна стимуляція N-холінорецепторів в умовах синдрому системної запальної відповіді гальмує активацію лактатдегідрогенази і катепсину Д у всіх внутрішніх органах, частково запобігає інтенсифікації перекісного окислювання ліпідів і активізацію антиоксидантної системи, поліпшує показники виживаності щурів в умовах моделі синдрому системної запальної відповіді.

Ключові слова: синдром системної запальної відповіді, вегетативна нервова система, N-холінергічний протизапальний шлях, щури.

АННОТАЦИЯ

Савустьяненко А.В. Влияние вегетативной регуляции на течение системного воспалительного ответа. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04 – патологическая физиология. Институт физиологии им. акад. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2008.

В диссертационной работе представлено теоретическое обобщение и новое решение научной проблемы, которое заключается в раскрытии N-холинергического пути управления системным воспалительным ответом.

Исследование выполнено на 183 белых крысах-самцах линии Вистар, содержавшихся в стандартных условиях вивария. В шести сериях экспериментов были изучены зависимость между состоянием и реактивностью симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы и выживаемостью крыс в условиях модели синдрома системного воспалительного ответа, индивидуальные особенности выраженности метаболических нарушений во внутренних органах у крыс при данной патологии, вклад N-холинорецепторного противовоспалительного пути в прогноз для жизни животных с системным воспалением.

Анализ выживаемости крыс после перевязки и пункции слепой кишки показал, что в течение 10 дней наблюдения погибает около ѕ особей, причем главным образом - в ранние сроки (1-2 сутки) эксперимента.

До воспроизведения модели системного воспалительного ответа с помощью перевязки и пункции слепой кишки высокоустойчивые животные характеризуются выраженным приростом активности парасимпатического звена вегетативной нервной системы в ответ на фармакологическую стимуляцию α-адренорецепторов. При развитии системного воспаления у высокоустойчивых крыс, в отличие от погибших, в первые часы эксперимента наблюдается рост мощности обоих звеньев вегетативной регуляции.

В первые часы развития синдрома системного воспалительного ответа растет внутритканевая активность катепсина Д, причем наиболее ранняя и выраженная активация данного фермента имеет место в печени и почках. Активность лактатдегидрогеназы увеличивается пропорционально давности патологического процесса; прирост активности данного фермента в группе высокоустойчивых животных менее выражен, а в ткани легких и почек - отсутствовал. Рост содержания малонового диальдегида сочетается с повышением активности каталазы. В группе низкоустойчивых животных истощаются запасы эндогенного α-токоферола в печени.

При проведении корреляционного анализа между биохимическими показателями выраженности повреждения тканей внутренних органов, интенсивности перекисного окисления липидов, напряжения антиоксидантной системы, с одной стороны, и показателями вариабельности сердечного ритма, с другой стороны, в обеих группах животных обнаружены тесные обратные связи. При этом в корреляционные пары входят практически все исследованные биохимические показатели, в то время как из показателей вариабельности сердечного ритма участвуют преимущественно показатели мощностей парасимпатических влияний интактных крыс и после введения фенилэфрина.

Было показано, что селективная фармакологическая стимуляция N-холинорецепторов в условиях синдрома системного воспалительного ответа тормозит активацию лактатдегидрогеназы и катепсина Д во всех внутренних органах, частично предотвращает интенсификацию перекисного окисления липидов и активизацию антиоксидантной системы, улучшает показатели выживаемости крыс в условиях модели синдрома системного воспалительного ответа. В группе животных, получавших сочетанную нагрузку неостигмином и атропином, показатель 10-суточной выживаемости после операции перевязки и пункции слепой кишки был в 2,39 раза выше, чем в сравниваемой группе крыс без фармакологического воздействия.

Результаты работы позволили уточнить требования к использованию спектрального анализа вариабельности сердечного ритма при оценке активности вегетативной нервной системы у крыс: определена оптимальная длительность анализируемых участков кардиоритмограммы; рекомендованы частотные диапазоны для оценки симпатических и парасимпатических влияний; доказана возможность и целесообразность оценки спектрального анализа вариабельности сердечного ритма под общим наркозом.

Ключевые слова: синдром системного воспалительного ответа, вегетативная нервная система, N-холинергический противовоспалительный путь, крысы.

ANNOTATION

Savustyanenko A.V. Effects of autonomic regulation on the intercourse of systemic inflammatory response. – Manuscript

PhD thesis for acquiring PhD degree in medical sciences in speciality 14.03.04 – pathologic physiology. Acad. Bogomolez A.A. Institute of physiology, Kiev 2008.

Thesis shows theoretical general conclusion and new approach in solving a scientific problem: N-cholinergic pathway of systemic inflammatory response management.

183 rats were used for research. The rats are of Wistar line. Spectral analysis of heart rate variability was used for evaluation of autonomic nervous system condition. Spectrophotometry was used for determination of level of enzyme’s intra-tissue activity. It was discovered that highly-resistant animals are characterized by high growth rate of parasympathetic activity in response to pharmacologic stimulation of α-adrenoreceptors before the model of systemic inflammatory response is developed. Method of cecum ligation and puncture was applied for development of systemic inflammatory response.

Strengthening of both parts of autonomic nervous system’s influence was observed during first hours of the experiment in case of systemic inflammatory response development in highly-resistant rats in contrast to those rats who died.

First hours of systemic inflammatory response are characterized by growth of intra-tissue activity of cathepsin D, the most early and the most noticeable activation of this enzyme occurs in kidney and liver tissues. Activity of lactatdehydrogenase increases progressively to the remoteness of the onset of pathologic process. Group of highly-resistant animals showed low growth of this enzyme activity and no growth in lung and kidney tissues. Growth of malone dialdehyde quantity is observed together with growth of catalase activity. Group of low-resistant animals showed exhaustion of endogenic α-tocopherol reserve in liver. All registered biochemical shifts had negative correlation with activity of parasympathetic part of autonomic nervous system.

It was proved that selective pharmacological stimulation of N-cholinereceptors in terms of syndrome of systemic inflammatory response inhibits activation of lactatdehydrogenase and cathepsin D in every internal organ; it also partially prevents intensification of lipid peroxidation and energization of antiozidant system; improves probability of rat survival.

Key-words: systemic inflammatory response syndrome, autonomic nervous system, N-cholinergic anti-inflammatory pathway, rats.

Підписано до друку 01.02.2008. Формат 60х84 1/16

Ум. друк. арк. 0,9. Друк лазерний. Зам. № 147. Тираж 100 прим.

Віддруковано в типографії ТОВ “Норд Комп’ютер”

Україна, м. Донецьк, 83003, вул. Разенкова, 6.

Тел.: (062) 389-73-82, 389-73-80