Г.Н. Чупахина, А.В. Добычина, Н.Ю. Чупахина, И.Е. Ломова (Калининградский государственный университет, Московская Академия химического машиностроения)
Химизм биосинтеза аскорбиновой кислоты (АК) в растениях до сих пор не достаточно ясен. Известно, что новообразование АК стимулируют гексозы, из которых предпочтение отдается галактозе [1, с. 271]. Метаболизм гексоз в АК может идти или через образование промежуточных триоз, или без разрыва углеродного скелета исходной молекулы углевода. Во втором случае ряд исследователей (2) допускает возможность инверсии углеродной цепи, другие [3] отрицают ее наличие. Необходимость образования триоз из исходных гексоз при биосинтезе АК нами проверялась в опытах с использованием экзогенного диоксиацетона в качестве субстрата для АК. Действие диоксиацетона сравнивалось с С6-субстратами - глюкозой и галактозой.
Объект и методы исследования
В качестве объектов исследования использовались 6-дневные зеленые, этиолированные и альбиносные проростки ячменя ярового (Hordeum vulgare L.) сорта Роланд. Альбиносные проростки получали из обработанных 0,25% раствором стрептомицина семян. Проростки выращивали при естественном освещении и комнатной температуре. Содержание аскорбиновой кислоты и ее дериватов - дегидроаскорбиновой кислоты (ДАК) и дикетогулоновой (ДКГК) - определяли колориметрически [4, с. 17]. Диоксиацетон, используемый в опытах, был получен методом биотрансформации глицерина с помощью Gluconobacter oxydans [5]. Освещение проростков в опытах проводилось в установке “Флора” с люминесцентными лампами ЛДЦ-40. Интенсивность света равнялась 33 тыс. эрг см-2 с-1, экспозиция - 24 часа. Опыты выполнялись в двух биологических повторностях и воспроизводились 2-3 раза. В работе приводятся средние значения из всех опытов и средние ошибки измерений.
Результаты и обсуждение
С целью изучения возможности использования шестиуглеродных соединений (глюкозы, галактозы) в качестве субстрата в биосинтезе АК использовались листья ячменя с различной пигментацией: зеленые, этиолированные, альбиносные, с тем чтобы решить вопрос об источнике используемых углеводов (фотосинтетические или запасные) и определить зависимость биосинтеза АК из углеводов от энергетических процессов - фотосинтеза и дыхания.
Масштаб биосинтетического процесса, ведущего к накоплению АК, характеризует не только образование восстановленной формы АК, но и ее дериватов, так как наряду с новообразованием АК идет ее активное использование с образованием ДАК и ДКГК. Поэтому в опытах по изучению возможности использования С6-углеводов - глюкозы и галактозы в биосинтезе АК одновременно определялось содержание АК, ДАК и ДКГК.
Как видно из рисунка, при освещении листьев ячменя, находящегося на воде и 1% растворах глюкозы и галактозы, уровень восстановленной формы АК повышался по сравнению с исходным содержанием во всех вариантах, но превышение контрольного значения (листья на воде) отмечено только при использовании в качестве субстрата глюкозы.
Освещение зеленых листьев ячменя привело к снижению уровня дегидроаскорбиновой кислоты по сравнению с исходным содержанием только в контроле; в листьях, находящихся на растворах углеводов, содержание ДАК превзошло и контрольное и исходное содержание. Следовательно, дополнительное снабжение листьев шестиуглеродными углеводами активизировало использование восстановленной формы АК, причем в равной мере и в опыте с глюкозой, и с галактозой.
Дальнейшая метаболизация ДАК с образованием ДКГК активнее была в листьях, находящихся на 1% растворе глюкозы по сравнению с галактозой.
Таким образом, С6-углеводы (глюкоза и галактоза) стимулируют накопление АК в листьях ячменя на свету. Причем глюкоза активизирует образование и восстановленной и окисленной формы АК, галактоза - только дегидроформы.
В этиолированных листьях (рис. 2) свет активно стимулировал накопление АК и в листьях, находящихся на воде, и особенно в листьях, помещенных в 1% растворы глюкозы и галактозы. Однако стимуляция биосинтеза АК глюкозой была выше, чем галактозой.
Уровень окисленной формы АК, а также продукта ее необратимого окисления - ДКГК при освещении этиолированных листьев снизился по сравнению с исходным, что говорит о пониженном использовании АК в этиолянтах. Возможно, это и является одной из причин более активного накопления восстановленной формы АК в этиолированных проростках на свету по сравнению с зелеными.
Еще в большей степени, чем в этиолированных проростках, блокированы процессы, связанные с функционированием фотосинтетического аппарата, однако у альбиносов их реакция на освещение была ближе к зеленым проросткам, чем к этиолированным (рис. 3). Исходный уровень АК в зеленых проростках был выше, чем в альбиносных, но характер изменения содержания АК и в контрольных листьях (на воде), и в листьях, находящихся в растворах углеводов, был одинаковым: свет стимулировал повышение уровня АК во всех вариантах, но превышение контрольного значения было отмечено только на глюкозе. У альбиносных проростков, так же, как и у этиолированных и зеленых, содержание ДАК на свету повысилось по сравнению с контрольным значением в присутствии экзогенных углеводов, особенно галактозы. Содержание ДКГК при этом не превышало контрольный уровень.
Таким образом, анализ реакции на освещение листьев ячменя, находящихся на 1% растворе глюкозы и галактозы, показывает, что глюкоза стимулирует накопление восстановленной формы АК и в зеленых, и в разной степени депигментированных проростках. Активация биосинтеза АК галактозой имела место только у этиолянтов.
Свет понижал уровень ДАК у всех типов проростков. Добавление экзогенных углеводов стимулировало накопление окисленной формы АК и мало отражалось на содержании ДКГК.
Учитывая масштаб накопления АК и ДАК в присутствии экзогенных углеводов, можно сделать вывод о том, что в проростках ячменя экзогенная глюкоза в большей степени стимулирует биосинтез АК и АК+ДАК, чем галактоза.
В опытах по выяснению возможности использования в качестве субстрата в биосинтезе АК трехуглеродных углеводов использовался диоксиацетон. Зеленые, этиолированные и альбиносные листья ячменя основанием помещались в 1% раствор диоксиацетона, и его действие сравнивалось с контролем (листья на воде) и с 1% глюкозой, стимуляция биосинтеза АК которой показана в предыдущих исследованиях (рис.1-3).
В опытах с зелеными листьями было показано (рис. 4), что в присутствии 1% диоксиацетона на свету начинается необыкновенно активный синтез - сверхсинтез АК: содержание АК повысилось по сравнению с контрольным в 12 раз и по сравнению с глюкозой - в 9 раз. Наряду с резким возрастанием уровня восстановленной формы АК, шло активное накопление окисленной формы и ДКГК.
Аналогичный феномен выявлен и у этиолированных проростков, у которых в присутствии диоксиацетона в 16 раз увеличилось содержание АК по сравнению с контролем, в 9 раз повысился уровень ДАК и в 11 раз - ДКГК (рис. 5).
Несколько меньшее увеличение уровня АК, ДАК и ДКГК под действием диоксиацетона наблюдалось у альбиносных проростков, но и в этом случае уровень АК превосходил контрольный в 4 раза, ДАК - в 12 раз, ДКГК - более чем в 8 раз, тогда как в варианте, где в качестве субстрата использовалась глюкоза, эти цифры были соответственно: 1,2; 1,2 и 1 (рис. 6).
Из сравнения действия диоксиацетона, глюкозы и галактозы на биосинтез АК в проростках ячменя, отчетливо видно преимущественное использование трехуглеродного углевода по сравнению с шестиуглеродными, что дает основание поддерживать мнение о том, что биосинтез АК из углеводов предполагает на определенном этапе разрыв исходной гексозы на триозы. Но поскольку диоксиацетон в опытах стимулировал активное накопление не только восстановленной формы АК, но и продуктов ее окисления - ДАК, ДКГК - можно считать, что в его присутствии начинается быстрое использование АК. Такое явление может иметь место тогда, когда растения находятся в неблагоприятных условиях и активное новообразование и использование АК является ответной реакцией на стресс [6, с.21]. Поэтому при оценке роли диоксиацетона как субстрата в биосинтезе АК, вероятно, нельзя не учитывать и возможное негативное воздействие самого диоксиацетона в 1% концентрации на растения.
Использование углеводов экзогенного и эндогенного пула в растениях идет не одинаково [7]. Учитывая наши данные по влиянию экзогенной глюкозы и галактозы на биосинтез АК в проростках ячменя, можно сделать вывод о том, что глюкоза экзогенного пула может использоваться в биосинтезе АК зелеными, этиолированными и альбиносными проростками. Преимущественного использования галактозы в биосинтезе АК, как указывается в литературе [1], в наших опытах не выявлено.
Стимулирующее действие экзогенной глюкозы и диоксиацетона на биосинтез АК не связано с фотосинтетическим процессом, так как оно наблюдалось не только в зеленых проростках, но и в депигментированных.
Таким образом, экзогенный диоксиацетон в 1% концентрации вызывает активное накопление АК, ДАК и ДКГК в листьях ячменя с различной пигментацией, значительно превосходящее данный процесс в листьях, обеспеченных глюкозой, что поддерживает мнение о том, что биосинтез АК из гексоз включает этап образования триоз. Сравнительный анализ действия глюкозы и галактозы на биосинтез АК показывает преимущественное использование в данном процессе глюкозы.
1. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М.: Мир, 1986. Т.1. С.392.
2. Isherwood F.A., Chen Y.T., Mapson L.W. Synthesis of l-ascorbic acid in plants and animals // Biochem. Journ. 1954. Vol. 56. N 1. P.11-15.
3. Loewus F.A., j. P.F.G. Hesper. Metabolism l-ascorbic acid in plants // American chemican society. Washington, 1982. P.249-261.
4. Чупахина Г.Н. Количественное определение АК, ДАК и ДКГК в растительных тканях // Специальный практикум по биохимии и физиологии растений. Калининград, 1981. 37 с.
5. Еронин В.А., Кустова Н.А., Махоткина Г.А., Ломова И.Е., Николаев П.И. Способ получения диоксиацетона: А.с. № 1218687 // БИ. 1985. № 24.
6. Чупахина Г.Н. Светозависимые изменения системы АК растений: Дис. ... д-ра биол. наук. СПб., 1992. 48 с.
7. Щугаева Н.А., Выскребенцева Э.И. Принципиальные различия окислительного метаболизма экзогенного и эндогенного сахара // Физиология растений. 1985. Т. 32. Вып. 6. С.1188-1196.