Доктор биологических наук, профессор В.А. Рогозкин Кандидат биологических наук И.В. Астратенкова Бакалавры А.М. Дружевская , О.Н. Федоровская, Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт физической культуры, Санкт-Петербург
Успешная реализация многолетней международной программы "Геном человека" оказала огромное влияние на фундаментальную и прикладную медико-биологическую науку, на многие социальные аспекты жизни. Она позволила выявить специфические гены, тесно связанные с развитием и проявлением наследственных болезней, а также определить гены, ответственные за выполнение нормальных физиологических и метаболических функций человека. В частности, возникла возможность выявить генетические маркеры, или гены предрасположенности, тесно ассоциированные с развитием и проявлением различных физических качеств [1, 2]. Основным генетическим маркером, связь которого со спортивными результатами в разных видах спорта убедительно доказана в исследованиях последних лет, остается ген ангиотензин превращающего фермента (ACE) [3, 6]. Наряду с этим наиболее вероятными кандидатами на роль генетических маркеров в спорте являются гены, определяющие функции сердечно-сосудистой системы: ангиотензиногена (AGT), ангиотензин-II -рецептора 1-го типа (AGT2R1), b2-рецептора брадикинина (b2BKR) и эндотелиальной NO-синтазы (eNOS). Определенные генотипы этих генов в той или иной степени ассоциированы с проявлением качества выносливости и указывают на предрасположенность к выполнению длительной физической работы. В то же время поиск генетических маркеров, определяющих предрасположенность человека к выполнению скоростно-силовых физических нагрузок, пока не привел к убедительным и достоверным результатам.
Цель исследования состояла в выявлении и анализе полиморфизма трех генов: a-актинина-3, АМФ-дезаминазы и ангиотензин превращающего фермента у представителей скоростно-силовых видов спорта
Методика . Работа выполнена на образцах геномной ДНК 97 учащихся ГУСПО СПбУОР № 2, специализирующихся в пяти скоростно-силовых видах спорта: дзюдо, вольной борьбе, греко-римской борьбе, боксе, тяжелой атлетике, а также конькобежцев-спринтеров и гребцов на короткие дистанции. ДНК выделяли из клеток букального эпителия ротовой полости. Полученную ДНК использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР) в присутствии двух-трех праймеров. После амплификации генов продукты ПЦР подвергали расщеплению эндонуклеазами рестрикции. Затем проводили разделение фрагментов ДНК с использованием вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии маркерных красителей. Для визуализации полученных фрагментов ДНК после электрофореза их окрашивали флюоресцентным красителем - бромистым этидием и просматривали в ультрафиолетовом свете в трансиллюминаторе. Регистрацию полученных результатов проводили после фотографирования фрагментов ДНК. В качестве популяционного контроля использовали образцы ДНК, полученные у 111 жителей Санкт-Петербурга.
Результаты и обсуждение. Первым изученным геном у спортсменов был ген a-актинина-3 (ACTN3). Известно, что в скелетных мышцах существуют две изоформы белка a-актинина: изоформа a-актинин-2 (ACTN2) и изоформа a-актинин-3 (ACTN3), которые имеют высокую степень гомологичности, но различаются по локализации в мышечных волокнах. Все мышечные волокна содержат a-актинин-2, тогда как белок a-актинин-3 локализован только в быстросокращающихся волокнах скелетных мышц. Оба гена a-актининов (ACTN2 и ACTN3) экспрессируются в скелетных мышцах человека. Ген a-актинина-3 - ACTN3 находится в длинном плече 11-й хромосомы (11q13-q14).
Результаты анализа показали, что в скелетной мышце a-актинины-2 и -3 относятся к главным компонентам Z-дисков, где они связывают тонкие актиновые филаменты. Эти белки выполняют статическую функцию в организации тонких филаментов и взаимодействии между саркомерным цитоскелетом и саркоплазмой, тем самым обеспечивая упорядочение массива миофибрилл. Изоформы a-актининов в скелетных мышцах кроме статической выполняют и регуляторную функцию, принимая участие в регуляции дифференциации и сокращении миофибрилл. Дефицит a-актинина-3 в быстросокращающихся мышечных волокнах может снижать скоростно-силовые показатели физической работоспособности человека. Причиной такого недостатка ACTN3 у человека является однонуклеотидная замена цитозина на тимин в 577-м нуклеотиде кодирующей последовательности, который находится в 16-й экзоне. В результате этого кодон, кодирующий аминокислоту аргинин, превращается в стоп-кодон и останавливается синтез полипептидной цепи белка a-актинина-3. Нуклеотидная форма записи этой мутации - R577X. Наличие полиморфизма в гене ACTN3 позволяет выявить три генотипа: RR-гомозиготы по нормальному аллелю, RX-гетерозиготы, XX-гомозиготы по мутантному аллелю. Около 16% мировой популяции гомозиготны по X-аллелю, и их мышцы не содержат белка a-актинин-3. Однако патологии мышц у таких людей не наблюдается, так как a-актинин-2 компенсирует его отсутствие в Z-дисках быстросокращающихся мышечных волокон. Вместе с тем наличие 577R аллеля, свидетельствующего о присутствии в скелетных мышцах белка a-актинина-3, дает индивидуумам преимущество в проявлении скоростно-силовых физических качеств.
На первой стадии настоящего исследования необходимо было получить информацию о распределении полиморфизма гена АСТN3 в нормальной популяции жителей г.Санкт-Петербурга и провести сравнение с популяцией жителей Европы. Как показывают результаты исследований, частоты встречаемости полиморфизмов гена АСТN3 у жителей Санкт-Петербурга распределились следующим образом: по Х-аллелю - 40 %, по R-аллелю - 60%, а частоты встречаемости генотипа ХХ составляют 17%. Как в российской, так и в европейской популяции доминирующим оказался R-аллель (60%), что хорошо согласуется с аналогичными показателями для жителей других стран [5]. Затем было проведено сравнение генотипов гена АСТN3 среди жителей Санкт-Петербурга и спортсменов. Различия между частотой встречаемости R- и Х-аллелей в популяции жителей Санкт-Петербурга и спортсменов оказались недостоверными. Частота мутантного аллеля Х в контрольной группе составила 40%, а в группе спортсменов - 37%. При рассмотрении трех вариантов генотипа гена АСТN3 обнаружены отличия между группами. Среди спортсменов выявлено достоверное снижение частоты встречаемости гомозигот генотипа ХХ (7%) по сравнению с контрольной группой (17%) (р < 0,05). Смещение распределения генотипов в сторону ХХ произошло не за счет увеличения частоты генотипов RR, указывающего на наличие в мышечных волокнах II типа полноценного белка a-актинина 3, а вследствие более высокой частоты встречаемости гетерозиготного генотипа RX (60%). При сравнении этих данных с частотой обнаружения RX у жителей Санкт-Петербурга (45%) также выявлено достоверное различие (p<0,05). Анализ распределения генотипов гена АСТN3 среди спортсменов, специализирующихся в различных скоростно-силовых видах спорта, позволил выявить наличие мутантного генотипа ХХ у нескольких человек.
Мы сочли возможным в группу "борьба" включить спортсменов, занимающихся дзюдо, вольной борьбой и греко-римской борьбой, что повысило надежность результатов благодаря увеличению численности исследованной выборки.
Наличие генотипа ХХ у спортсменов свидетельствует об отсутствии у них структурного белка a-актинина-3 в быстросокращающихся мышечных волокнах. Этот факт существенно снижает показатели скоростно-силовой работы и ограничивает возможности достижения высоких результатов в скоростно-силовых видах спорта. Выявленная в результате исследования сравнительно невысокая частота генотипа ХХ гена АСТN3 у спортсменов указывает на естественный спортивный отбор в процессе многолетней подготовки спортсменов.
Таким образом, высоких спортивных результатов в скоростно-силовых видах спорта добиваются спортсмены, имеющие генотипы RR и RX гена ACTN3, тогда как спортсмены с генотипом ХХ будут существенно ограничены в достижении высоких спортивных результатов. Следовательно, тестирование RR аллеля гена АСТN3, равно как и анализ на наличие генотипа ХХ гена АСТN3, уже сегодня можно рекомендовать в качестве прогностического теста на выявление предрасположенности к скоростно -силовой работе.
Вторым изученным у спортсменов геном был ген аденозин-монофосфат дезаминазы (АМФД). Известно, что существует три изоформы АМФД: изоформа М (мышечная, ген АМФД1), изоформа L (печеночная, ген АМФД2), изоформа Е (эритроцитарная, АМФД3). Изоформы АМФД различаются молекулярной массой, иммунологическими, каталитическими и регуляторными свойствами. По данным иммунофлюоресцентного анализа изоформа М АМФД локализована в быстросокращающихся мышечных волокнах скелетных мышц. Эта изоформа АМФД кодируется геном АМРД1, локализованным в коротком плече первой хромосомы (1p13.1).
Результаты анализа активности АМФД в скелетных мышцах показали, что индивидуумы, имеющие пониженную активность фермента, испытывают слабость, быструю утомляемость или мышечные судороги даже после средней по интенсивности физической нагрузки. Недостаток фермента в скелетных мышцах является одной из наиболее распространенных причин метаболической и вызванной физическими упражнениями миопатий у человека. Причиной такого недостатка АМФД у человека является однонуклеотидная замена цитозина на тимин в 34-м нуклеотиде кодирующей последовательности, которая находится во втором экзоне. В результате этого глутаминовый кодон превращается в стоп-кодон и прекращается синтез полипептидной цепи. Нуклеотидная форма записи этой мутации - С34Т, а форма записи мутации с использованием однобуквенного аминокислотого кода - Q12X. В случае присутствия в последовательности гена этой точечной мутации происходит терминация цепи белка и продукт становится каталитически неактивным. Это определяет существование полиморфизма гена АМРД1. Методами молекулярной биологии можно проанализировать ДНК на наличие С34Т полиморфизма в гене АМРД1 и выявить три генотипа: СС - гомозиготы по нормальному аллелю, СТ - гетерозиготы, ТТ - гомозиготы по мутантному аллелю. Результаты анализа полиморфизма С34Т в гене АМPД1 показали, что среди обследованных спортсменов 75% принадлежали к генотипу СС, 22,6% являлись носителями гетерозигот СТ и лишь у 2 человек была выявлена принадлежность к мутантному аллелю-ТТ. Спортсмены, принадлежащие к генотипу СС, доминируют в тяжелой атлетике (92%), в борьбе (92%) и гребле (70%). Спортсмены, принадлежащие к гетерозиготному генотипу СТ, в большей степени представлены среди боксеров (36%) и конькобежцев (36%). Наконец, спортсмены, принадлежащие к мутантному генотипу ТТ, обнаружены (по одному человеку) только среди гребцов и тяжелоатлетов. Наличие генотипа ТТ у спортсменов свидетельствует о низкой активности фермента АМФД в быстросокращающихся мышечных волокнах и будет ограничивать рост спортивных результатов в избранном спортсменами виде спорта. Следует отметить, что такое небольшое количество спортсменов с наличием принадлежности к мутантному аллелю гена АМРД1 свидетельствует о весьма эффективном отборе для занятий такими скоростно-силовыми видами спорта.
Третьим изученным у спортсменов геном был ген ангиотензин превращающего фермента (ACE). Это ключевой фермент ренин-ангиотензиновой системы - важнейшего гуморального регулятора артериального давления. ACE катализирует превращение ангиотензина I в ангиотензин II - наиболее активный сосудосуживающий гормон, кроме того ACE способен катализировать деградацию брадикинина - важнейшего сосудорасширяющего гормона. Ген ACE локализован в 17-й хромосоме, локус q23. Структурный полиморфизм гена ACE носит название инсерционно-делеционного (I/D) и заключается в наличии (insertion) или отсутствии (deletion) фрагмента ДНК длиной 287 пар нуклеотидов в 16-м интроне. Применение реакции ПЦР позволяет выявить в гене ACE три генотипа: II-гомозиготы по I-аллелю, ID-гетерозиготы, DD-гомозиготы по D-аллелю. Существует тесная связь между генотипом ACE и активностью фермента, который регулирует содержание ангиотензина II. Этот гормон не только регулирует состояние гемодинамики человека, но и как фактор роста усиливает синтез структурных белков в клетках миокарда, что приводит к гипертрофии сердечной мышцы.
На основе анализа полиморфизма гена ACE популяция обследуемых может быть распределена на три группы: носители генотипа II, генотипа ID и генотипа DD. В начале работы с геном ACE было проведено сравнение генотипов среди жителей Санкт-Петербурга и спортсменов. Результаты анализа частоты распределения по генотипам среди жителей города (16% - II, 51% - ID, 33% - DD) и спортсменов (14% - II, 39% - ID, 47% - DD) были весьма близки. В то же время в группе спортсменов можно отметить увеличение частоты встречаемости гомозигот генотипа DD, которое произошло за счет снижения количества генотипа гетерозигот ID. Анализ распределения генотипов гена ACE среди спортсменов, специализирующихся в различных скоростно-силовых видах спорта и видах спорта с длительной физической нагрузкой, позволил выявить существенные различия в частоте I- и D-аллелей. Так, у представителей скоростно-силовых видов спорта частота D-аллеля составила 0,72, а I-аллеля - 0,28. У спортсменов, выполняющих длительную физическую работу, это соотношение было изменено и частота I-аллеля была 0,63, а D-аллеля - 0,37 [6].
Таким образом, полученные результаты доказывают наличие достоверной корреляции развития определенных физических качеств с различными генотипами гена ACE. Спортсмены, имеющие генотип DD гена ACE, в большей степени предрасположены к развитию скоростно-силовых физических качеств. Носители другого генотипа - II, напротив, в большей степени предрасположены к выполнению длительной физической работы [4]. Следовательно, тестирование X-аллеля гена ACTN3, равно как и анализ на наличие T-аллеля гена AMPD1, наряду с определением DD генотипа гена ACE уже сегодня можно рекомендовать в качестве прогностического теста на выявление генетической предрасположенности к развитию и проявлению у спортсмена скоростно-силовых физических качеств.
На основании результатов настоящего исследования впервые получена развернутая картина генетической предрасположенности человека к выполнению скоростно -силовой физической работы и определен спектр генов, которые могут быть использованы в диагностическом комплексе для отбора в скоростно-силовые виды спорта. Использование полученных данных в практической работе тренеров позволит повысить результативность спортивного отбора и сохранит здоровье спортсменов при реализации учебно-тренировочной программы подготовки и в стрессовых ситуациях, с которыми сопряжены занятия спортом.
Авторы благодарят д.п.н. В.И. Криличевского и к.п.н. И.И. Комарова (ГУСПО СПб УОР-2) за плодотворное научное сотрудничество и помощь в организации исследования
1. Рогозкин В.А. Расшифровка генома человека и спорт //Теория и практика физ. культуры. 2001, № 6, с. 60-63.
2. Рогозкин В.А. Спортивная генетика: состояние и перспективы // VII Международный научный конгресс "Современный олимпийский спорт и спорт для всех". М., 2003, т. 3, с. 265-269.
3. Рогозкин В.А., Назаров И.Б., Казаков В.И. Генетические маркеры физической работоспособности человека //Теория и практика физ. культуры. 2000, № 12, с. 33-36.
4. Рогозкин В.А., Назаров И.Б., Казаков В.И. //Способ выявления предрасположенности к длительной физической работе. Патент РФ № 2194982, выдан 20.12.2002. Бюл. № 35.
5. Mills M.A.; Nan Yang, Weinberger R.P. // Differential expression of the actinbindind proteins, a-actinin-2 and-3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy// Human Molecular Genetics. 2001. v. 10(13) p.1335-1346.
6. Nazarov I., Woods D., Montgomery H., Schneider O., Kazakov V., Tomilin N., Rogozkin V.// The angiotensin converting enzyme 1/D polymorphism in Russian athletes. Europian Journal of Human Genetics. 2001. - V .9. - P. 797-801.
Для подготовки данной работы были использованы материалы с сайта http://lib.sportedu.ru