Введение
Drosophila melanogaster, иначе плодовая, или уксусная муха - маленькое,
около 3 мм в длину, насекомое семейства Drosophiliadae из отряда Diptera.
Этих мушек можно наблюдать около испорченных фруктов.
Дрозофила стала одним из самых ценных для биологических исследований организмов, в частности, в области генетики. Она используется, как модельный организм для различных исследований уже почти сто лет, и сегодня многие учёные продолжают работать над различными проблемами дрозофилы. Её важность для здоровья человека была признана Нобелевской премией, вручённой медикам-физиологам Ed Lewis, Christiane Nusslein-Volhard and Eric Wieschaus в 1995 г.
Есть несколько причин, тому, что дрозофила - один из излюбленных объектов изучения. Дрозофила - маленькое животное с коротким жизненным циклом длительностью лишь около двух недель, она недорога для размножения и выведения даже большого количества особей. Мутантные особи с дефектами в любых из нескольких тысяч генов доступны для экспериментов, и весь геном мухи в целом уже известен.
Дрозофила изначально использовалась для генетических исследований,
например, для изучения закономерностей различных типов наследственности.
Сейчас муха используется также как объект изучения других разделов биологии
(особенно, биологии развития: здесь изучается развитие целого организма из
относительно простого оплодотворённого яйца), и как учебный объект.
Короткий период развития от яйца до имаго, исключительное богатство
мутационных рас с характерно чётким фенотипическим проявлением, малое число
хромосом и ряд других важных преимуществ делают её незаменимой для
практической проработки основных закономерностей наследственности.
Распространение. Морфология. Биология развития дрозофилы.
Дикий тип дрозофилы имеет ярко-красные глаза и "серое" тело (термин
"gray", что означает "серый", не совсем уместен, но прочно прижился в
обозначении цвета дикого типа мухи; она не является серой). Крылья
нормально развиты, превышают длину тела. Питается ферментированными
фруктами или овощами, но в лаборатории её разводят на специальной
питательной среде.
Родиной Drosophila melanogaster считают Индо-Малайскую область; в
настоящее время муха распространена очень широко, в том числе на Кавказе и
Украине.
Морфологически, самки и самцы отличаются друг от друга по целому ряду признаков. Самки несколько крупнее самцов, хотя величина и тех, и других может сильно колебаться в зависимости от условий питания, особенно на это влияет личиночный период развития. Брюшко у самки несколько округлое, с заострённым концом; у самца оно цилиндрическое, с притуплённым
концом. Также самца можно легко отличить от самки по нескольким последним сегментам, которые у него сплошь пигментированы. Верхние хитиновые щитки груди у насекомых называются тергитами (они вместе со стернитами и плейритами участвуют в движении крыльев). Половой диморфизм у дрозофилы проявляется в том, что у самки имеется восемь хорошо развитых тергитов, а у самца - шесть, причём шестой и восьмой тергиты слиты, а восьмой вошёл в состав полового аппарата. Стерниты- такие же хитиновые пластинки с брюшной стороны (см. рис.). У самки их также на один больше, чем у самца, и у представителей каждого пола не развиты первый, второй, седьмой и восьмой стерниты.
Брюшко самки (слева) и самца (справа), вид с вентральной стороны. Видны стерниты (у самки- на один меньше)
Брюшко самки (слева) и самца (справа), вид с латеральной стороны.
К числу вторично-половых признаков у самца относятся половые гребешки, представляющие собой крепкие хитиновые щетинки на первом членике лапки передних ног. У самки подобные образования отсутствуют.
Наружные половые органы самки состоят из влагалища, по сторонам которого расположены две влагалищные пластинки, а сзади них - анальный бугорок, состоящий из двух анальных пластинок, расположенных одна над другой.
На рисунке:
Dorsal anal plate - дорсальная анальная пластинка; Ventral anal plate -
вентральная анальная пластинка; Eighth targite - восьмой тергит; Long
bristles - длинные шипы; Sensilla trichodea - чувствительный волосок;
Thorn bristles - колючие шипы; Vulva - вульва; Vaginal plate -
влагалищная пластинка.
Внутренний половой аппарат самки состоит из двух гроздевидных яичников,
в каждом по несколько десятков яйцевых трубочек; яйцевода; влагалища; трёх
семяприёмников, из которых один трубчатый и два грибовидных; придаточных
желёз. Протоки семяприёмников и придаточных желёз впадают во влагалище.
Непарный трубчатый семяприёмник представлен длинной спиральной трубкой. У
спаривавшихся самок он наполнен спермой. В полости влагалища нередко можно
видеть зрелое яйцо с заключённой внутри него почти развитой личинкой.
На рисунке:
Lateral oviduct - латеральный яйцевод; Common oviduct - основной яйцевод; Seminal receptplace - семяприёмник; Spermathecae and Parovaria - придаточные железы; Uterus - яичник; Vagina - влагалище; Vaginal plates - влагалищные пластинки; Anal plates - анальные пластинки.
Наружные половые органы самца имеют более сложное строение. Они состоят
из генитальной пластинки и пениса с прилегающими к нему частями.
Генитальная пластинка представляет собой подковообразное хитиновое
образование. Внутри неё открывается анальное отверстие, по бокам которого
латерально расположены две анальные пластинки. С брюшной стороны
генитальная пластинка несёт две пары отростков, к которым причленяется
пенис с его придатками. Собственно пенис имеет вид ложкообразной хитиновой
пластинки, несущей краю ряд хитиновых зубцов:
Внутренний половой аппарат самца включает в себя парный семенник,
парные семенные пузырьки, придаточные железы, непарный семявыносящий
проток, непарный bulbus ejaculatorius, непарный семяизвергательный канал.
Семенники представляют собой свёрнутые трубки, переходящие в семенные
пузырьки, которые переходят в семенные канальца, соединяющиеся
непосредственно перед впадением в семявыносящий проток. Семявыносящий
проток впадает в bulbus ejaculatorius, который играет роль насоса,
выталкивающего сперму из семявыносящего протока и выбрасывающего её наружу
через семяизвергательный канал, который открывается в основание пениса.
Как правило, самки не могут спариваться в течение 24 часов после вылупления, однако при температуре, несколько выше нормальной, иногда можно наблюдать копуляцию мух моложе указанного возраста, в особенности, если в культуре имеются старые самцы. Копуляция длится около 20 минут; этот срок является видовой характеристикой рассматриваемого вида.
Цикл развития дрозофилы:
Яйца дрозофилы несколько вытянутые, около 0.5 мм в длину. В свежих
культурах они легко заметны, будучи отложенными на питательной среде,
большей частью поблизости от стенок пробирки, где содержится меньше влаги.
Яйцо дрозофилы защищено двумя внешними оболочками, различными по
происхождению. Внутренняя оболочка, образованная самим яйцом, называется
желточной. Наружная оболочка образована фолликулярным эпителием яичника и
носит название хориона. У яйца дрозофилы можно различить передний и задний
конец, а также дорсальную и вентральные стороны соответственно отделам
будущего зародыша. На переднем конце яйца, на вершине небольшого сосочка,
имеется отверстие, микропиле, ведущее внутрь яйца и служащее для
проникновения сперматозоида внутрь. От передней части дорсальной
поверхности яйца отходят и идут по направлению кпереди и в стороны два
длинных отростка, представляющих собой выросты хориона. Это так называемые
филаменты, предохраняющие яйцо от погружения в жидкую среду.
Оплодотворение яйца происходит в момент прохождения его через верхний отдел влагалища. В нормальных условиях эмбриональное развитие протекает вне тела матери при температуре 27є около 20 часов. В благоприятных условиях каждая самка откладывает до 50-80 яиц в сутки, а всего в течение 3-4 суток она может отложить более 200 штук.
Вылупление личинки из яйца и начало постэмбрионального развития связано с усиленным питанием и ростом. Избыток пищи на этой стадии жизни особи имеет большое значение: в значительной мере он определяет не только размеры мухи, но и её жизнеспособность. Первое время после вылупления личинки остаются на поверхности среды. Затем они уходят в глубь её и остаются там до момента окукливания.
Окукливание начинается с того, что личинки покидают среду, перестают питаться и некоторое время оживлённо ползают по стенкам пробирки. Затем они становятся неподвижными, значительно сокращаются в длину и приобретают характерную для куколки бочонкообразную форму. Куколочный период развития характеризуется, с одной стороны, разрушением личиночных органов и тканей, за исключением гонад и нервной системы, с другой - развитием из имагинальных дисков дефинитивных органов взрослой мухи. Период куколочного превращения равен 4 суткам.
По окончании третьих суток через покров куколки становятся заметными
очертания глаз, в которых к тому времени вырабатывается желтоватый пигмент.
За несколько часов до вылупления хорошо видны крылья, глаза к этому времени
приобретают ярко-красный цвет.
Вылупление мухи и её освобождение от покрова куколки достигается нагнетанием жидкости, вследствие чего оболочка куколки разрывается, и муха освобождается. Обычно мухи выходят из куколки рано утром. Молодые, только что вылупившиеся мухи имеют длинное желтоватое тело, почти лишённое пигмента, короткие, ещё не расправленные крылья. Через 8 часов самки уже готовы к оплодотворению, поэтому для скрещивания необходимо брать виргинных самок, не старше 8 часов после вылупления. Самки начинают откладывать яйца с конца вторых суток и продолжают до конца жизни.
Кариотип дрозофилы.
Дрозофила имеет четыре пары хромосом: X/Y - половые хромосомы и аутосомы 2, 3 и 4. Четвёртая хромосома достаточно маленькая и редко упоминается. Размер генома мухи составляет около 165 миллионов оснований и содержит, по приблизительным подсчётам, 14.000 генов (для сравнения, геном человека имеет 3.300 миллионов оснований и около 70.000 генов, дрожжи имеют около 5800 генов в 13.5 миллионах оснований).
Геном дрозофилы был почти полностью описан в 2000 году, и в данный
момент производится его анализ. Об этом достижении было сообщено 18 февраля
2000 года. В проекте комбинировалась экспертиза группы учёных под
руководством Dr. Gerald Rubin, изучающих геном дрозофилы в Калифорнийском
Институте (Berkeley) и работа мощных анализирующих машин и компьютеров
компании Celera Genomics Corp. под руководством J. Craig Venter. Учёные из
обеих групп сообщили результаты исследований на ежегодной встрече
Американской Ассоциации Прогресса Науки (American Association for the
Advancement of Science).
Политенные хромосомы.
Наличие политенных хромосом является одной из причин популярности дрозофилы как объекта изучения. Политенные хромосомы были впервые обнаружены в клетках слюнных желёз дрозофилы в 1934 г. Личинка во время роста имеет постоянное количество клеток, но в то же время ей необходимо накапливать генетический материал для будущего развития. В результате клетки увеличиваются в рвзмерах, и каждая хромосома реплицируется сотни раз, при этом все цепочки ДНК остаются прикреплёнными одна к другой до тех пор, пока их не наберётся несколько тысяч, лежащих бок о бок. Таким образом, образуется толстая, бросающаяся в глаза своею величиной и легко различимая в микроскоп политенная хромосома. Более того, после окрашивания эти хромосомы имеют чередующиеся тёмные и светлые полоски, индивидуальные по строению для каждой части хромосомы, так что можно определить, какая часть хромосомы попала в объектив микроскопа.
Стандартная карта политенной хромосомы разделяет геном на 102
пронумерованные полоски (1-20 - X-хромосома, 21-60 - вторая хромосома, 61-
100 - третья и 101-102 - четвёртая); каждая из полосок поделена на 6
буквенных полосок (A-F), и каждая из пронумерованных полосок также поделена
на несколько (до 13) подразделов. На фотографии выше указана 57-я полоска.
Локализация многих генов известна точно по буквенной шкале, но не точно по
цифровой шкале, и поэтому указывается приблизительно (например, 42C7-9,
60A1-2). Политенные полоски не имеют одинаковой длины последовательности
нуклеотидов, но в среднем одна буквенная полоска содержит около 300kb ДНК,
или 15-25 генов.
На рисунке - пример компьютерной обработки (расшифровки) политенной хромосомы.
Постановка опыта.
Инвентарь и оборудование, использованное нами в работе.
1. Птичье пёрышко,
2. Листок чистой белой бумаги (или молочно-белое стекло)
3. Лупы двух различных типов
4. Капельница для серного эфира
5. Морилка
6. Пробки из ваты
7. Пробирки с питательной средой
8. Этикетки, клей, и т. д.
Питательная среда.
Нами была использована питательная среда, приготовленная из дрожжей, сахара, манной крупы, пропионовой кислоты, воды и агар-агара.
Важно, чтобы среда не была слишком твёрдой, т.к. молодые личинки не могут проникнуть вглубь твёрдой среды и погибают, и не слишком жидкой, т.к. в жидкой среде могут погибнуть отложенные яйца.
Наркотизация мух.
Анализ и подсчёт мух, а также отбор девственных самок и подбор
родительских пар для скрещивания проводят на матово-белом стекле под лупой
после того, как их усыпят серным эфиром. Для этой цели их обычно помещают в
эфиризатор или морилку. В нижней части морилки имеется углубление, в
которое вставлен плотный ватный тампончик, смачиваемый из капельницы по
мере надобности 1-2 каплями серного эфира. Стаканчик с мухами осторожно
постукивают о ладонь, мухи при этом собираются в нижней его части, затем
осторожно снимают ватную пробку, накрывают стаканчик эфиризатором и
опрокидывают так, чтобы стаканчик с мухами был наверху. Легким
постукиванием о ладонь всех мух переводят в эфиризатор и закрывают его
пробкой с ватным тампоном, смоченным 1-2 каплями эфира. Как только все мухи
заснут, их осторожно вытряхивают из эфиризатора на молочно-белое стекло и,
пользуясь лупой и птичьим пёрышком, быстро анализируют и подсчитывают, так
как в наркотизированном состоянии они могут находиться только около 5
минут. Если наркотизацию необходимо продлить, мух накрывают большим часовым
стеклом, под которое кладут ватный тампон, смоченный одной каплей эфира.
Если эти мухи нужны для последующего размножения, их помещают в чистые
пробирки с питательной средой. В одну пробирку для размножения следует
помещать 2-3 самок и 3-5 самцов. Для того чтобы сонные мухи не упали на дно
пробирки и не увязли в питательной среде, их помещают на чистые стенки
стаканчика со средой и держат стаканчик в горизонтальном положении до тех
пор, пока мухи не проснутся.
По окончании работы с мухами их усыпляют и выбрасывают. От большой дозы
эфира мухи погибают через 3-5 минут. Об их гибели можно заключить по
растопыренным кверху и в стороны крыльям и безжизненно вытянутым лапкам.
Всю работу с дрозофилой и результаты наблюдений фиксируют в соответствующем
журнале. Оптимальными условиями для успешного размножения мух является
температура 24-26° С, относительная влажность 70-80%, хорошая аэрация.
Экспериментальные данные прилагаются. ( См. письменное приложение).
-----------------------
САМКА
САМЕЦ
ЯЙЦО
ЛИЧИНКА
КУКОЛКА
ВЗРОСЛАЯ МУХА
У дрозофилы имеется 4 пары хромосом в каждой соматической клетке. На диаграмме представлены позиции некоторых генов, которые могут подвергаться мутациям.