Зміст
Вступ……………………………………………………………………………….2
4. Основні закономірності світлопоглинання
6. Методика визначення концентрації речовини в розчині
7. Устаткування для фотометричних вимірів
Список використаної літератури
Вступ
Ці методи займають, мабуть, виняткове місце в роботах хіміків-аналітиків: їм приділяється дуже багато уваги, число публікацій досить велико. Переважно розроблені фотометричні методи визначення елементів з використанням органічних реагентів; багато чого зроблено й по загальних питаннях фотометрії.
Ці методи складаються у вимірі поглинання променистої енергії розчинами аналізованих речовин. Характер спектра поглинання служить якісною ознакою обумовленої сполуки, а величина поглинання виступає як кількісна характеристика, що дозволяє судити про зміст компонента, що цікавить нас. Справа в тому, що поглинання променистої енергії за інших рівних умов пропорційно концентрації поглинаючої речовини.
Поняття фотометричні охоплює прийоми, які йменуються або йменувалися колориметричними, фотоелектроколориметричними, спектрофотометричними й властиво фотометричними. Походження цих термінів зв'язано зі способом виміру світлопоглинання й типом застосовуваного для цієї мети приладу. Однак в основі всіх способів лежить поглинання світла обумовленою речовиною у видимій, ультрафіолетовій і інфрачервоній області спектра.
1. Історія
Вважають, що одним з перших фотометричні методи застосував російський мінералог і хімік В.М. Севергин, що працював наприкінці ХVIII – початку ХIX століть. У другій половині ХIХ століття деякі методи цього типу використали на заводах, наприклад у Нижньому Тагілі. Широке ж поширення фотометрія одержала в Радянському Союзі, починаючи з 30-х років ХХ століття. По числу наукових публікацій фотометричний метод посідає перше місце. У дуже великому масштабі метод використовують у практиці аналізу найрізноманітніших об'єктів. Достоїнство цих прийомів у досить низькій межі виявлення, доступності й простоті, що сполучаються в багатьох випадках з достатньою вибірковістю й швидкістю; точність визначень також для ряду цілей цілком задовільна: відносна помилка звичайно становить 5-10 %. Важливо й те, що фотометричні методи розроблені практично для всіх елементів і дуже багатьох органічних сполук.
Майже завжди виміру поглинання передує переклад обумовленого компонента в нову хімічну форму, що саме й відрізняє сильним поглинанням променистої енергії. Це може бути пофарбована сполука або сполуки, що поглинають випромінювання в ультрафіолетовій і інфрачервоній області спектра. Відшукання такої сполуки, вибір умов його утворення, знаходження прийомів усунення перешкод з боку інших компонентів – мета й істота хімічної теорії фотометричних методів. Найбільше поширення одержали прийоми, у яких використовують пофарбовані комплекси з органічними реагентами; наукові дослідження в основному присвячені саме цим комплексам, з'ясуванню хімізму відповідних реакцій.
Колись задовольнялися чисто утилітарним результатом: емпірично підібрана кольорова реакція служила цілям визначення елемента або сполуки, але істота процесів, що протікають при цьому, часом було незрозумілим. У переведеній на російську мову в 1935 р. книзі Йоу «Колориметричний аналіз» маса методик, але майже немає відомостей про хімічну істоту описаних реакцій. Наприклад, визначення заліза по реакції з роданідом використали широко, але сполука поглинаюче світло комплексу не знали. Однак з тих пор у хімії пофарбованих сполук досягнуть величезний прогрес. Відомий механізм майже всіх широко застосовуваних у фотометрії реакцій, при розробці нових прийомів обов'язковим вважається з'ясування природи сполук, що утворюються, і опис ряду їхніх фізико-хімічних властивостей, наприклад стійкості в розчині. Ці вимоги вироблені при активній участі відомих хіміків-аналітиків А.К. Бабко й А.Т. Пилипенко.
У якості фотометричних реагентів використовують речовини різних класів. З неорганічних сполук - це галогеніди й роданіди, перекис водню, аміак, сполуки, що дають гетерополікислоти. З більш численних органічних реагентів можна назвати реагенти, що містять у певнім сполученні гідроксильну й карбоксильную групу, зокрема оксіазосполуки; реагенти з тіольної та тіонної групами. Дуже часто гарний аналітичний ефект дають багатокомпонентні сполуки, наприклад комплекси зі змішаною координаційною сферою.
У більших масштабах ведуться успішні пошуки нових реагентів для фотометричного визначення елементів. Значний внесок внесли дослідження В.И. Кузнєцова й С.Б. Саввіна, які запропонували реагенти групи торона й арсеназо - арсеназо I, арсеназо Ш, сульфохлорфенол С та інші, що дозволяють визначати багато елементів з низькою межею виявлення й високою вибірковістю. Ці реагенти виробляються й застосовуються в багатьох країнах. Особливо ефективні вони при визначенні торія, урану, рідкісноземельних елементів, ніобію. В.П.Живописців увів у практику ефективні реагенти хромпиразол I і хромпиразол II, Ю.А. Банківський вивчив меркоптохінолин, що дозволяє досить вибірково фотометрувати реній і інші елементи. Запропонований також люмогалліон - реагент для фотометричного визначення галію, молібдену, ніобію. Літій зручно визначати з використанням реагенту хіназоліназо. В аналітичній хімії берилія важливі методи, засновані на використанні беррілона II і IV. Чутливе фотометричне визначення титану забезпечується дихлорхромотроповою кислотою, що описали В.И. Кузнєцов і Н.Н. Басаргін.
Розроблені й з великою користю застосовуються фотометричні методи, засновані на використанні раніше відомих реагентів. Так И.П. Алімарин із співр. узвичаїли в обиход важливий метод визначення ніобію по реакції з роданідом; створено багато цікавих методів з використанням катіонних барвників – кристалічного фіолетового, брильянтового зеленого й аналогічних; антипірилметан застосований для фотометричного визначення титану – цей метод широко відомий. Створений широко застосовуваний метод визначення кремнію, фосфору й миш'яку у вигляді гетерополісполук.
У ряді аналітичних центрів синтезуються й випробовуються нові фотометричні реагенти.
Більша роль у розвитку загальної теорії фотометричних методів належить відомим хімікам-аналітикам А.К. Бабко, А.Т. Пилипенко і їхнім колегам. Так, Н.П. Кромарь глибоко вивчив рівноваги в багатокомпонентних системах, застосовуваних у фотометрії, запропонував способи визначення молярних коефіцієнтів поглинання – основного показника, що характеризує межу виявлення. Метрологічні питання фотометрії досліджували А.К. Бланк, В.Ф. Барковський, І.А. Блюм.
Найчастіше фотометричні методи використовують для визначення малих концентрацій речовин. Однак можна визначати й більші кількості, якщо використати так звану диференціальну фотометрію. Цей прийом у цей час гарне відомий, його активно пропагував Ю.А. Черніхов.
2. Класифікація
Методи аналізу, засновані на поглинанні електромагнітного випромінювання аналізованими речовинами, складають велику групу абсорбційних оптичних методів. При поглинанні світла атоми і молекули аналізованих речовин переходять у новий збуджений стан.
У залежності від виду поглинаючих часток і способу трансформування поглиненої енергії розрізняють:
Атомно-абсорбційний аналіз, заснований на поглинанні світлової енергії атомами аналізованих речовин.
Молекулярний абсорбційний аналіз, тобто аналіз поглинання світла молекулами аналізованої речовини в ультрафіолетовій, видимій і інфрачервоній областях спектра (спектрофотометрія, фотоколориметрія, Ик-спектроскопія).
Аналіз поглинання і розсіювання світлової енергії зваженими частками аналізованої речовини (турбидиметрія, нефелометрія).
Люмінесцентний (флуорометричний) аналіз, заснований на вимірі випромінювання, що виникає в результаті виділення енергії збудженими молекулами аналізованої речовини.
Усі ці методи іноді поєднують в одну групу спектрохімічних чи спектроскопічних методів аналізу, хоча вони і мають істотні розходження.
Фотоколориметрія і спектрофотометрія засновані на взаємодії випромінювання з однорідними системами, і їх звичайно поєднують в одну групу фотометричних методів аналізу.
3. Принципи фотометрії
У фотометричних методах використовують виборче поглинання світла молекулами аналізованої речовини. Відповідно до квантової механіки світло являє собою потік часток, називаних квантами чи фотонами. Енергія кожного кванта визначається довжиною хвилі випромінювання. У результаті поглинання випромінювання молекула поглинаючого речовини переходить з основного стану з мінімальною енергією E1 у більш високий енергетичний стан Е2. Електронні переходи, викликані поглинанням строго визначених квантів світлової енергії, характеризуються наявністю строго визначених смуг поглинання в електронних спектрах поглинаючих молекул. Причому поглинання світла відбувається тільки в тому випадку, коли енергія кванта, що поглинається, збігається з різницею енергій ΔЕ між квантовими енергетичними рівнями в кінцевому (E2) і початковому (E1) станах поглинаючої молекули:
hv = ΔЕ = Е2 – E1
Тут h – постійна Планка (h = 6,625*10–34 Дж*с); v – частота випромінювання, що поглинається, що визначається енергією поглиненого кванта і виражається відношенням швидкості поширення випромінювання з (швидкості світлової хвилі у вакуумі с = 3*1010 см/с) до довжини хвилі λ: v = с/λ. Частота випромінювання v виміряється в зворотних секундах (с-1), герцах (Гц). 1 Гц = 1 с-1.
Довжина хвилі λ виміряється в ангстремах (1 A = 1*10–8 см), мікрометрах чи мікронах (1 мкм = 1 мк = 1*10–6 м), нанометрах чи мілімікронах (1 нм = 1 ммк = 10 A = 1*10–9 м).
Енергія випромінювання характеризується електромагнітним спектром, що охоплює область від кілометрових радіохвиль до десятих часток ангстрема γ-випромінювання і космічних променів. Для характеристики ділянки спектра часто використовують також хвильове число θ, що показує, яке число довжин хвиль приходиться на 1 см шляху випромінювання у вакуумі, і визначається співвідношенням: θ = 1/λ.
Природа смуг поглинання в ультрафіолетовій (10–400 нм) і видимої (400–760 нм) областях спектра однакова і зв'язана головним чином з числом і розташуванням електронів у поглинаючих молекулах і іонах. В інфрачервоній області (0,8–1000 мкм) вона в більшому ступені зв'язана з коливаннями атомів у молекулах поглинаючої речовини.
У залежності від використовуваної апаратури у фотометричному аналізі розрізняють спектрофотометричний метод – аналіз по поглинанню монохроматичного світла і фотоколориметричний – аналіз по поглинанню поліхроматичного (немонохроматичного) світла у видимій області спектра. Обидва методи засновані на пропорційній залежності між світлопоглинанням і концентрацією поглинаючої речовини.
4. Основні закономірності світлопоглинання
При проходженні через шар речовини (розчину) світлового потоку з інтенсивністю I0 його інтенсивність у результаті поглинання в шарі, відображення і розсіювання зменшується до значення I. Інтенсивності падаючого світлового потоку I0 і світлового потоку I, що пройшов через розчин, можна визначити експериментально. При відносних вимірах поглинання світла щирими розчинами утратами випромінювання унаслідок відображення і розсіювання звичайно зневажають.
Зв'язок між інтенсивностями світлових потоків I0 і I установлюється законом Бугера-Ламберта, відповідно до якого однорідні шари тієї самої речовини однакової товщини поглинають ту саму частку падаючої на них світлової енергії (при постійній концентрації розчиненої речовини).
Математично цей закон виражається рівнянням експонентної залежності:
I = I0eal (1),
де е – основа натуральних логарифмів; а – коефіцієнт поглинання; l – товщина поглинаючого шару.
Відношення:
T = I/I0
називають пропусканням; його значення можуть змінюватися від 0 до 1. Часто цю величину виражають у відсотках. Якщо величина Т віднесена до товщини шару в 1 см, то її називають коефіцієнтом пропускання. Поглинання випромінювання характеризують оптичною щільністю:
A = lg(I0/I) = –lgT
Зв'язок між концентрацією поглинаючого розчину і його оптичною щільністю lg(I0/I) виражається законом Бера, відповідно до якого оптична щільність розчину прямо пропорційна концентрації розчиненої речовини при постійній товщині шару:
lg(I0/I) = k*1*C (2)
де k*1 – коефіцієнт пропорційності; С – концентрація розчиненої речовини. Залежність інтенсивності монохроматичного світлового потоку, що пройшов через шар забарвленого розчину, від інтенсивності падаючого потоку світла, концентрації забарвленої речовини і товщини шару розчину визначається об'єднаним законом Бугера-Ламберта-Бера, що є основним законом світлопоглинання і лежить в основі більшості фотометричних методів аналізу:
I = I0*10–kCl (3)
де k – коефіцієнт светопоглощения, що залежить від природи розчиненої речовини, температури, розчинника і довжини хвилі світла.
При дотриманні основного закону светопоглощения оптична щільність розчину прямо пропорційна молярному коефіцієнту светопоглощения, концентрації поглинаючого речовини і товщині шаруючи розчину:
А = kCl (5)
При графічному зображенні залежності оптичної щільності від концентрації (при постійному значенні l) виходить пряма лінія. Ця пряма проходить через початок координат при відсутності поглинання світла розчинником і систематичними погрішностями.
Рівняння 4 і 5 виведені для монохроматичного світла, тобто світла визначеної довжини хвилі, що може бути виділений за допомогою спеціального оптичного пристрою – монохроматора. У фотоколориметрі вимір інтенсивності світлових потоків роблять не в монохроматичному, а в поліхроматичному світлі, тобто на досить широкій ділянці спектра – в інтервалі довжин хвиль 20–100 нм.
5. Спектри поглинання
Спектр поглинання, чи, більш коректно, абсолютний спектр поглинання речовини являє собою залежність кількості поглиненого світла від довжини хвилі.
Такі спектри для барвників у видимій області (400–700 нм) мають іноді кілька максимумів. Спектри поглинання в ультрафіолетовій (200–400 нм) і видимих областях відбивають переходи зв'язаних і незв'язаних електронів у молекулі.
Це звичайно делокализованные π-електрони подвійних С=С зв'язків і неподілені пари азоту і кисню. Оскільки, як правило, всі електрони в молекулі при кімнатній температурі знаходяться на нижньому енергетичному рівні, спектри в цій області подають інформацію про основному і першому збудженому електронні стани молекули.
Через те, що довжина хвилі поглиненого світла відповідає визначеному переходу, піки на спектрах поглинання речовини обумовлені присутністю в ньому відомих структур. Довжина хвилі, при якій спостерігається максимальне поглинання світла, позначається через λмакс. Положення максимуму спектра поглинання є важливою оптичною характеристикою речовини, а характер і вид спектра поглинання характеризують його якісну індивідуальність.
Група в молекулі, що дає внесок у спектр її поглинання, називається хромофором. Такою групою є, наприклад, карбонільна група >С=О, що існує у всіх амінокислот. Іншим хромофором є пептидная група поліпептидних ланцюгів. До основних хромофорів білка відносяться залишки ароматичних кислот: триптофан і в меншому ступені тирозин і фенілаланін.
Спектр поглинання триптофану, обумовлений його індольним кільцем із системою сполучених зв'язків, володіє двома смугами поглинання з максимумами при 220 і 280 нм. У нуклеїнових кислотах основними хромофорами є пуринові і пиримідинові азотисті основи нуклеотидів. При утворенні сполучених зв'язків у молекулі енергія збудженого стану електронів зменшується, і, отже, хромофор починає поглинати світло більшої довжини хвилі.
Таке зрушення в спектрах поглинання називається батохромним. Навпаки, зрушення спектра в короткохвильову область іменується гіпсохромним. Гіперхромний і гіпохромний ефекти – це відповідно збільшення і зменшення екстинкції.
Знайти дуже близько розташовані лінії коливальних і обертальних переходів на спектрах молекул удається лише при високій роздільній здатності (роздільною здатність називається здатність приладу розрізняти дві близько розташовані лінії).
6. Методика визначення концентрації речовини в розчині
Фотометричні методи визначення концентрації розчинів засновані на порівнянні поглинання при пропущенні світла стандартними і досліджуваними розчинами. Ступінь поглинання світла фотометруємим розчином вимірюють за допомогою фотоколориметрів і спектрофотометрів. Вимір оптичної щільності стандартного і досліджуваного забарвлених розчинів завжди роблять стосовно розчину порівняння (нульового (контрольного) розчину). Як розчин порівняння можна використовувати аліквотну частину досліджуваного розчину, що містить усі додані компоненти, крім реагенту, що утворить з обумовленою речовиною забарвлену сполуку. Якщо реагент, що додається, і всі інші компоненти розчину порівняння безбарвні і, отже, не поглинають променів у видимій області спектра, то як розчин порівняння можна використовувати дистильовану воду.
Для визначення змісту речовини методом градуировочного (каліброваного) графіка готують серію з 5–8 стандартних розчинів різних концентрацій.
При виборі інтервалу концентрацій стандартних розчинів керуються наступними положеннями:
а) він повинний охоплювати область можливих змін концентрації досліджуваного розчину; бажано, щоб оптична щільність досліджуваного розчину відповідала приблизно середині градуювочної кривої;
б) бажано, щоб у цьому інтервалі концентрацій при обраних товщині кювети l і аналітичній довжині хвилі λ, (у більшості випадків λ = λмакс світлопоглинаючої сполуки) дотримувався основний закон світлопоглинання, тобто графік А = f(C) був лінійним;
в) інтервал робочих значень λ, що відповідає інтервалу стандартних розчинів, повинний забезпечувати максимальну відтворюваність результатів вимірів.
При сукупності перерахованих умов вимірюють оптичні щільності стандартних розчинів щодо розчинника і будують графік залежності А = f(C). Отримана крива називається градуювочною чи каліброваною і має вид прямої що виходить з початку координат. Екстраполювати калібровану пряму до значень оптичних густин, що лежать вище останньої експериментально отриманої крапки, не рекомендується. Періодично (раз у тиждень чи рідше) калібровану криву перевіряють по 2–3 свіжовиготовленим стандартним розчинам. Калібровані графіки, побудовані з реактивами різних партій, як правило, не збігаються. Тому при зміні реактивів графік необхідно побудувати заново. Графік, побудований при роботі на одному приладі, не можна використовувати для розрахунків результатів, отриманих на іншому.
Визначивши оптичну щільність досвідченого розчину Ах, знаходять її значення на осі ординат, а потім на осі абсцис – відповідне їй значення концентрації Сх.
Цей метод застосовують при виконанні серійних фотометричних аналізів. Він дає гарні результати при дотриманні основного закону світлопоглинання.
На відміну від інших фотометричних методів, метод градуювочного графіка дозволяє визначити концентрацію пофарбованих розчинів навіть у тих випадках, коли основний закон світлопоглинання не дотримується. Для побудови градуювочної кривої в цих випадках наготовлюють значно більше число стандартних розчинів, що відрізняються друг від друга по концентрації не більше ніж на 10%. Такий градуировочный графік, що має на положистій ділянці кут нахилу не менш 15°, усе-таки дозволяє проводити фотометричні виміри, незважаючи на те, що між концентрацією розчину і його оптичною щільністю немає лінійної залежності. Відтворюваність визначень у цьому випадку нижче, ніж у випадку лінійної залежності А = f(C).
Для визначення концентрації речовини методом порівняння оптичних густин стандартного і досліджуваного розчинів беруть аликвотну частину досліджуваного розчину, наготовлюють з неї забарвлений розчин для фотометрування і вимірюють його оптичну щільність. Потім аналогічно наготовлюють 2–3 стандартних пофарбованих розчини обумовленої речовини відомої концентрації і вимірюють їхній оптичні щільності при тій же товщині шаруючи (у тих же кюветах).
Значення оптичної щільності досліджуваного розчину дорівнює:
Ах = ελCxlx
Значення оптичної щільності стандартного розчину дорівнює:
Аст = ελСстlст
Розділивши одне вираження на інше одержимо:
Ах/Аст = ελCxlx/(ελСстlст)
Тому що lх = lст, ελ = const, то
Сх = СстАх/Аст
Метод порівняння застосовують при однократних визначеннях; він вимагає обов'язкового дотримання основного закону світлопоглинання.
Існує й інший більш точний спосіб визначення невідомої концентрації Сх, називаний методом обмежуючих розчинів. Наготовлюють два стандартних розчини з концентраціями C1 і С2 так, щоб оптична щільність першого з них A1 була б менше оптичної щільності Ах досліджуваного розчину, а оптична щільність А2 другого стандартного розчину була б, навпаки, більше, ніж Ах.
Невідому концентрацію досліджуваної речовини розраховують по формулі:
Cx = C1 + (C2 – C1)(Ax – A1)/(A2 – A1)
7. Устаткування для фотометричних вимірів
Для фотометричних вимірів використовують дві великі групи приладів: фотоколориметри і спектрофотометри.
У колориметрах потрібні спектральні діапазони виділяються за допомогою світлофільтрів, що обмежують ділянки спектра, у яких можуть проводиться виміри. У спектрофотометрах ділянки спектра виділяються за допомогою призм чи дифракційних ґрат, що дозволяє встановлювати будь-як довжину хвилі в заданому діапазоні.
Конкретна послідовність операцій при вимірі оптичної щільності чи пропускання залежить від конструкції чи спектрофотометра колориметра.
Однак основні принципи залишаються незмінними. Спочатку встановлюють необхідну довжину хвилі, вибираючи світлофільтр на колориметрі чи обертаючи відповідну рукоятку на спектрофотометрі. Потім установлюють нуль. Для цього у світловий потік поміщають кювету зі стандартним розчином. Змінюючи ширину щілини, домагаються того, щоб показання приладу відповідали величині, передбаченою інструкцією. На наступному етапі стандартний розчин заміняють досліджуваним і роблять відлік величини оптичної щільності чи пропускання.
Фотоелектроколориметр – це оптичний прилад, у якому монохроматизация потоку випромінювання здійснюється за допомогою світлофільтрів.
Сучасні спектрофотометри дозволяють працювати з високомонохроматизированим потоком випромінювання. Вони застосовуються для концентраційного аналізу і при вивченні спектрів поглинання речовин.
Структурну схему спектрофотометра можна представити у виді наступних основних блоків:
джерело світла,
монохроматор,
кюветне відділення,
фотоелемент,
пристрій, що реєструє.
Світловий пучок від джерела світла попадає в монохроматор через вхідну щілину і розкладається дифракційними ґратами чи призмою в спектр. У монохроматичний потік випромінювання, що надходить з вихідної щілини в кюветное відділення, по черзі вводяться контрольний і досліджуваний зразки. Випромінювання, що пройшло через кювету, попадає на фотоелемент, що перетворює світлову енергію в електричну. Електричний сигнал потім підсилюється і реєструється.
Монохроматор – це оптична система, що виділяє з усього спектра джерела світла випромінювання визначеної довжини хвилі. Це звичайно призми, що по-різному переломлюють світло різних довжин хвиль, чи дифракційні ґрати. У видимій області використовуються звичайні скляні призми, але в ультрафіолетовій області вони не годяться, оскільки скло починає поглинати вже при λ < 400 нм, тому призми роблять із кварцу.
Як монохроматори застосовуються також дифракційні ґрати, що являють собою плоскопаралельну пластину з нанесеними на ній рівнобіжними лініями – борозенками. Біле світло через дифракцію на рівнобіжних борозенках розкладається на безупинний спектр. Звичайно в монохроматорах спочатку виділяють пучок світла з визначеним діапазоном довжин хвиль за допомогою призми, а потім розкладають його ще раз ґратами. Так одержують строго монохроматичне світло. Основне достоїнство дифракційних ґрат полягає в тому, що можна збільшувати їхню здатність, оскільки вона прямо пропорційна щільності ліній. Крім того, у всьому діапазоні довжин хвиль дифракційні ґрати мають лінійну роздільну здатність, тоді як роздільна здатність призменного монохроматора зі збільшенням довжини хвилі зменшується.
Досліджувану речовину розчиняють у відповідному розчині і поміщають в оптично прозору судину для вимірів – кювету. Звичайно кюветотримач має осередку для чотирьох кювет. Оскільки стекло поглинає ультрафіолетове світло, для проведення вимірів в ультрафіолетовій області спектра використовують кварцові кювети. Для вимірів у видимій області можна використовувати пластикові чи скляні кювети. При роботі з леткими чи хімічно активними речовинами кювети закривають кришками.
Оскільки кювета, поміщена в спектрофотометр, стає складовою частиною його оптичної системи, з нею потрібно поводитись дуже акуратно. Подряпини і бруд на стінках кювети сильно розсіюють і поглинають світло, спотворюючи результати вимірів. Про цьому особливо треба пам'ятати при роботі в ультрафіолетовій області. Кювети можна протирати м'якими тканинами, наприклад, з бавовни. Не рекомендується використовувати для цих цілей фільтрувальний папір. Оскільки органічні молекули поглинають в ультрафіолетовій області, ні в якому разі не можна торкатися оптичних (прозорих) стінок кювети. Розчин краще заливати в кювету, поставивши її в попередньо вийнятий із приладу кюветотримач. Кювети досить тендітні, особливо кварцові, тому працювати з ними треба обережно, не допускаючи механічних ушкоджень.
Уміст кювети повинний бути гомогенним – це необхідна умова одержання відтворених даних. Потрібно стежити за тим, щоб розчин не був мутним. Особливо заважають вимірам пухирці повітря, що сильно збільшують розсіювання. Не можна наливати в кювету дуже холодний розчин, оскільки при цьому на зовнішніх стінках кювети конденсуються пари води повітря, і стінки стають непрозорими.
Якщо кювети забруднені сторонніми домішками, їх варто промити дистильованою водою і (чи) розчинником, у якому розчинена досліджувана речовина. Кювети можна мити м'якими детергентами. Не рекомендується мити кювети концентрованими кислотами чи лугами, а також іншими агентами, що отруйні.
Кювети потрібно заповнювати до такого рівня, щоб потік випромінювання проходив цілком через шар розчину. Найчастіше використовуються кювети з оптичним шляхом 1 см, у які звичайно заливають 2,5–3 мл розчини. У такі кювети входить 4–5 мл, але заповнюють їхній цілком лише в тому випадку, коли це необхідно. Є кювети з оптичним шляхом 50, 20, 5, 2 і 1 мм.
Фотоелементи перетворюють світлову енергію в електричну. Електричний сигнал потім підсилюється і реєструється.
Фотони, бомбардуючи поверхню фотоелемента, вибивають з нього електрони, кількість яких пропорційно інтенсивності світла. Ці електрони летять до позитивного електрода. У результаті в замкнутому ланцюзі виникає електричний струм, що реєструється по спаданню напруги на опорі, що знаходиться в цьому ланцюзі. Напругу можна підсилити, і після компенсації такого сигналу потенціометром, відградуюванним в одиницях поглинання, на датчику реєструється безпосереднє поглинання зразка.
Фотомножники звичайно більш чуттєві, чим прості фотоелементи.
Це відбувається через те, що електрони, що вилетіли з фоточуттєвого шару, прискорюються високою напругою, а через зіткнення в газі виникають вторинні електрони, що і приводить до зростання струму.
Від розміру щілини залежить діапазон довжин хвиль світла, що падає на зразок. Тому для одержання надійних результатів треба працювати при мінімально вузькій для даних умов експерименту щілини. Якщо щілина обрана правильно, то при зміні її розмірів удвічі показання приладу не міняються.
Звичайно нульове значення поглинання встановлюють щілиною, але в гарних спектрофотометрах це роблять, змінюючи напругу фотоелемента. Таке регулювання дозволяє працювати при постійній ширині щілини.
При визначенні концентрації речовини в розчині за допомогою каліброваного графіка слід дотримуватися наступної послідовності:
вибрати світлофільтр;
вибрати кювету;
побудувати градуювочну криву;
вимірити оптичну щільність досліджуваного розчину і визначити його концентрацію, використовуючи градуювочну криву.
Наявність у колориметрі вузла світлофільтрів і набору кювет дозволяє підібрати таке їхнє сполучення, при якому погрішність у визначенні концентрації буде мінімальною.
Якщо спектральні характеристики забарвленої речовини невідомі, світлофільтр для роботи можна вибрати самостійно. У видимій частині спектра сприйманий колір є результат виборчого поглинання визначеної ділянки спектра білого світла. Колір розчину є додатковим до кольору поглинання випромінювання. Тому вимір поглинання варто проводити в додатковій для кольорової реакції області спектра. Так, якщо розчин забарвлений у синьо-зелений колір, те потрібно вимірювати поглинання цим розчином червоного кольору.
Більш точний вибір світлофільтра здійснюється в такий спосіб:
Налийте пофарбований розчин у кювету і визначите оптичну щільність для усіх світлофільтрів.
По отриманим даним побудуйте криву, відкладаючи по горизонтальній осі довжини хвиль, що відповідають максимуму коефіцієнта пропускання світлофільтрів, а по вертикальній осі – відповідні значення оптичної щільності розчину. Відзначте ту ділянку кривої, для якого виконуються наступні умови:
оптична щільність має максимальну величину;
хід кривої приблизно рівнобіжний горизонтальної осі, тобто оптична щільність мало залежить від довжини хвиль.
Світлофільтр для роботи вибирається так, щоб довжина хвилі, що відповідає максимуму коефіцієнта пропущення світлофільтра, приходилася на відзначений вище ділянку спектральної кривої випробуваного розчину.
Якщо ці умови виконуються для декількох світлофільтрів, то виберіть той з них, для якого чутливість колориметра вище.
Попередній вибір кювет проводиться візуально, виходячи з інтенсивності забарвлення розчину. Якщо розчин інтенсивно забарвлений (темний), варто користатися кюветами з малою довжиною оптичного шляху (1–5 мм). У випадку слабозабарвлених розчинів виміри проводять у кюветах з великою довжиною оптичного шляху (20–50 мм).
Принципи побудови градуювочного графіка і його використання для визначення концентрації речовини докладно розглянуті в попередньому розділі.
Висновки
До оптичного діапазону відносяться електромагнітні хвилі з довжиною від 100 до 10000 нм. Його розділяють на три області :
ультрафіолетову (УФ) 100-380 нм;
видиму 380-760 нм;
інфрачервону (ІЧ) 760- 10000 нм.
В залежності від характеру взаємодії речовини з електромагнітним випромінюванням оптичні методи розділяють на :
Абсорбційні (засновані на вимірюванні поглинання речовиною світлового випромінювання).
До них відносять:
колориметрію,
фотоколориметрію,
спектрофотометрію,
атомно-адсорбційні методи;
Емісійні (засновані на вимірюванні інтенсивності світла, випромінюваного речовиною).
До них відносяться:
флюориметрія,
емісійний спектральний аналіз,
полумяна фотометрія.
Методи, повязані із взаємодією світлового випромінювання з суспензіями, поділяють на:
турбідиметрію (заснована на вимірюванні інтенсивності світла, яке поглинається незабарвленою суспензією);
нефелометрію (заснована на вимірюванні інтенсивності світла, яке відбивається або розсіюється забарвленою або незабарвленою суспензією).
Методи, засновані на явищі поляризації молекул під дією світлового випромінювання ділять на :
рефрактометрію( заснована на вимірюванні показника заломлення);
поляриметрію (заснована на вимірюванні кута обертання плоскості поляризації поляризованого променя світла, що пройшов через оптично активне середовище);
інтерферометрію ( заснована на вимірюванні зсуву інтерференції світлових променів при проходженні їх крізь кювети з розчином речовини, розчинником та крізь коліматор)
Оптичні методи аналізу нерозривно пов’язані з використанням сучасних приладів різної складності, що породжує вартість аналізу, але дає ряд переваг у порівнянні з класичними хімічними методами:
експресність,
нерушійність зразків,
простоту методики,
використання невеликої кількості речовини для аналізу,
можливість аналізувати сполуки будь-якої природи,
проведення експрес аналізу багато компонентних сумішей.
Крім того вони підвищують чутливість, точність і відтворюваність результатів кількісних визначень.
Список використаної літератури
Алесковский В.Б., Бардин В.В., Бойчинова Е.С. и др. Физико-химические методы анализа. Л.: Химия, 1988.
Уильямс Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. М.: Мир, 1978.
Мецлер Д. Биохимия. М.: Мир, 1980.
Рубин А.Б. Биофизика. М.: Высшая школа, 1987.
Практикум по биохимии. Под редакцией С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. М.: Московский университет, 1989.
Волькенштейн М.В. Биофизика. М.: Наука, 1981.
24