Курсова робота студента 2 курсу факультету природничих наук Бабошина Івана
Київ-1999
Національний університет “Києво-Могилянська академія”
Факультет природничих наук
Кафедра біології
Серинові протеїнази дуже поширені в природі і виконують найрізноманітніші функції. При єдиному механізмі дії активного центру серинові протеїнази (далі по тексту – СП) мають великі відмінності у специфічності, пов’язані з біологічною функцією кожного окремого фермента. СП діють на біологічних рівнях від внутрішньоклітинного (протеїнази лізосом) до організменого (протеїнази, що модифікують нейропептиди). Дослідження всього різноманіття функцій СП дало змогу зрозуміти причини таких хвороб, як панкреатити, гемофілія, емфізема, що створило теоретичний базис для їх лікування. СП відіграють важливу роль в імунній та гормональній системах; детальне дослідження цих СП , безсумнівно, дасть практичні результати.
Найбільш вивчені на сьогоднішній день серинові протеїнази – це хімотрипсин, трипсин та еластаза. Вони виділені у чистому вигляді і вивчаються більш як півстоліття, що привело до накопичення величезного масиву інформації, яка має як теоретичне, так і відчутне практичне значення. Це особливо стосується трипсину і хімотрипсину, які отримали широке застосування у медицині, фармакології, легкій та харчовій промисловості, аналітичній біохімії і найрізноманітніших галузях біотехнології.
У той же час навіть для цих найпростіших СП є багато неясностей теоретичного і практичного планів. Наприклад, досі не вияснено, яким чином при активаційному розщепленні проформ білків фермент розпізнає строго визначений зв’язок.
Отже, дослідження функцій серинових протеїназ – важлива робота, яка, безумовно, принесе ще чимало корисних плодів.
Більшість відомих на сьогодні серинових протеїназ мають подібні амінокислотні ланцюги зі схожою третинною будовою і тому вважаються еволюційно спорідненими. (Бактеріальна СП субтилізин має зовсім відмінну від решти послідовність амінокислот і третинну будову). Спільна ознака усіх СП – тріада амінокислот, яка складає їхню каталітичну ділянку . Це три жорстко зафіксованих у просторі залишки серину, гістидину і аспарагінової кислоти, які забезпечують гідроліз амідних і складноефірних зв’язків, що потрапляють в зону його дії.
Такий гідроліз відбувається внаслідок унікальної здатності серинового залишку каталітичної тріади ( у хімотрипсину він знаходиться в положенні 195) ацилюватися субстратом. Вважається, що при взаємодії карбоксильної групи субстрату із серином гідролітичного центру утворюється високоенергетична проміжна сполука, яка перетворюється на ацил-фермент з наступним його гідролізом:
Близьке розташування трьох залишків амінокислот – Асп, Сер,Гіс – привело до формулювання класичної на сьогодні гіпотези активації оксигрупи Сер 195 шляхом переносу протона на Асп 102 по так званому ланцюгу переносу заряду:
Відмінності у специфічності СП зумовлені різницею в будові “кишеньки”, яка звязує боковий ланцюг амінокислоти, по якій іде гідроліз зв’язку. В молекулі хімотрипсину є чітко виражена кишенька, що зв’язує великі гідрофобні бокові ланцюги. В молекулі трипсину на дні аналогічної “кишеньки” замість серину знаходиться залишок аспарагінової кислоти. Здатність від’ємно зарядженої карбоксильної групи утворювати іонний зв’язок із додатньо зарядженими групами лізину чи аргініну визначає різницю в специфічності дії хімотрипсину і трипсину: якщо хімотрипсин розщеплює поліпептидний ланцюг по фенілаланіну, тирозину, триптофану і – в меншій мірі – по лейцину, то трипсин специфічно гідролізує зв’язки, утворені карбоксильними групами лізину і аргініну. Направленість дії фермента задається в першу чергу специфічністю такої “гідрофобної кишеньки”(її позначають S1). У випадку СП з більш складною організацією можливе існування додаткових зв’язуючих ділянок, розташованих у досить автономних доменах молекули. Прийнято вважати, що ці ділянки забезпечують високоспецифічне розпізнавання ферментами своїх фізіологічних субстратів і забезпечують необхідну послідовність гідролітичного процесу, а також деякі стадії взаємодії фермента з його нативним білковим інгібітором.
Окрім вищезгаданих ділянок міжмолекулярної взаємодії СП мають ще й регуляторну (ефекторну) ділянку. Зв’язування нею відповідного ліганда (ефектора) приводить активний центр ферменту в активований стан. Саме наявність таких ділянок пояснює явище субстратної активації – нелінійного зростання швидкості гідролізу по мірі збільшення концентрації субстрату.
Крім того, усі серинові протеїнази є кальцій-залежними білками, що містять одну кальцій-зв’язуючу ділянку. Зв’язування іонів кальцію такого роду ділянками збільшує стабільність молекули, підвищує її стійкість до денатураційних впливів і уповільнює процес автолізу фермента.
Регуляція активності СП здійснюється трьома основними шляхами, які знаходяться у складному взаємозв’язку:
утворенням протеаз у вигляді неактивних попередників (проферментів, зимогенів) з перетворенням їх у активні форми під дією ферментів-активаторів тільки у фізіологічно передумовлених органелах;
локалізацією ферментів всередині спеціальних утворів, оточених мембраною (лізосом у тварин; вакуолей і білкових тіл у рослин);
присутністю в клітинах і тканинах специфічних білків, що діють як інгібітори – серпінів.
СП у процесі згортання крові виконують функцію утворення фібринового згустка, який запобігає витіканню крові. Цей процес відбувається як складний каскад послідовних розщеплювальних активацій факторів згортання крові – одна протеїназа розщеплює проформу іншої. При цьому є два шляхи згортання: внутрішній і зовнішній.Зовнішній запускається внаслідок активації т.зв. фактору X після стикання його з чужорідною поверхнею (схема 1). Внутрішній механізм спрацьовує при появі в крові чужорідної для неї речовини (що відбувається через руйнування прилеглих тканин) (схема 2). Після відновлення структури судини в дію вступає СП, яка виконує лізис тромбу. За винятком трьох, всі активовані фактори згортання крові являють собою СП. Зимогени цих СП мають амінокислотні послідовності, гомологічні послідовностям панкреатичних зимогенів: трипсину, хімотрипсину, еластази.
Циркулюючий в кровотоці фібриноген являє собою великий глікопротеїд з молекулярною масою 340 кДа і містить 4% вуглеводів. Його молекула складається з двох ідентичних субодиниць, кожна з яких сформована трьома неоднаковими пептидними ланцюгами – Аa, Вb і g. При утворенні тромбу серинова протеїназа тромбін гідролізує один специфічний зв’язок Arg-Gly у кожному з ланцюгів Аa і Вb; в результаті від N-кінців відщеплюються пептиди А і В відповідно. Потім мономери фібрину агрегують з утворенням м’якого згустку.
На завершальній стадії утворення фібрину бере участь фактор ХІІІ (фібринстабілізуючий фактор – FSF), що знаходиться в тромбоцитах і плазмі. FSF із тромбоцитів складається із двох ідентичних a-ланцюгів. FSF плазми має два a-ланцюги, ідентичні ланцюгам з тромбоцитів, і два b-ланцюги, що містять вуглеводи ( близько 5%). Обидві форми фактора ХІІІ є зимогенами, що активуються тромбіном, який гідролізує специфічний зв’язок Arg-Gly в N-кінцевій частині кожного a-ланцюга. При цьому вивільняються два пептиди, що мають по 37 амінокислот. Після модифікації внаслідок дії тромбіну FSF тромбоцитів, який позначається а2 , стає ферментативно активним. Відповідний фактор плазми а2`b2 залишається неактивним, доки а-ланцюги не відокремляться від b-ланцюгів; цей процес відбувається в присутності Са2+. Активований фактор ХІІІ (ХІІІа) є трансглутаміназою, яка каталізує утворення поперечних зшивок між поліпептидними ланцюгами ланцюгами субодиниць фібрину. Кожен a-ланцюг зв’язаний з принаймні двома a-ланцюгами іншої субодиниці, g-ланцюг – тільки з одним g-ланцюгом іншої субодиниці. Такий згусток називається щільним. Він являє собою тривимірну сітку з розгалужених протофібрил товщиною у дві молекули фібрин-мономеру, зміщених на половину довжини молекули.
В кровотоці ссавців існує рівновага між згортанням і розчиненням фібринових утворів (гемостаз). Основним шляхом видалення фібрину, що вже виконав свої функції, є фібриноліз. Він здійснюється і контролюється складною багатокомпонентною системою. Основними її компонентами є:
плазмін – СП, основний фермент протеолітичної системи;
плазміноген – циркулюючий у кровотоці профермент плазміну;
ряд активаторів і проактиваторів плазміногену;
інгібітори плазміну - a2-антиплазмін та a2-макроглобулін.
Нативний плазміноген людини являє собою прошитий 24 дисульфідними зв’язками одноланцюговий глікопротеїд з молекулярною масою близько 92 000 кДа, він містить 790 амінокислот і до 2% вуглеводів. Плазміноген зустрічається у більшості тканинних рідин. Його активація до плазміну включена до цілого ряду фізіологічних і патологічних процесів, які вимагають обмеженого протеолізу – таких як фібриноліз, запальні процеси, тканинні перетворення, овуляція, ріст пухлин і метастазування.
Для активації плазміногену в плазмін необхідне розщеплення пептидного зв’язку Arg560-Val561. При цьому утворюються важкий і легкий ланцюги, з’єднані двома дисульфідними зв’язками. В даний час поширена гіпотеза активації зв’язаного плазміногену, згідно з якою плазміноген і його фізіологічний активатор завдяки специфічній спорідненості сорбуються на фібриновий згусток, де і відбуваються процеси активації та фібринолізу. Фібриноліз має вибірковий характер: направленість дії гідролітичного центру задається аргініл-зв’язуючими ділянками, які ефективно конкурують з “гідрофобною кишенькою” плазміну за аргінільні залишки фібрину і забезпечують тим самим розщеплення фібрину по лізильним зв’язкам. Вивільнюваний в кровотік по мірі лізису згустка плазмін відразу інактивується a2-антиплазміном. Важлива роль у взаємодії плазміногену з фібрином і плазміну з a2-антиплазміном відводиться лізин-зв’язуючим ділянкам плазміногену (плазміну). Слід зазначити, що крім взаємодій фібринолітичної системи лізин-зв’язуючими ділянками опосередковані складні і маловивчені взаємодії з культуральними ендотеліальними клітинами, гістидин-багатим глікопротеїном, тромбоспондином, клітинними рецепторами і компонентами екстрацелюлярного матриксу, що свідчить про важливість і багатофункціональність лізин-зв’язуючих ділянок.
Подібно до більшості біологічно активних білків, СП синтезуються у вигляді неактивних попередників (проформ, зимогенів). Процес активації носить характер обмеженого протеолізу і зводиться до розщеплення невеликого числа пептидних зв’язків (іноді – навіть одного) в молекулі білка-попередника.
Ключове положення в системі активації зимогенів підшлункової залози має трипсин, який активізує усі без винятку зимогени підшлункової залози – хімотрипсиногени А, В, С, проеластазу, прокарбоксипептидази А і В, зимоген фосфоліпази та проформи багатьох інших біологічно активних білків. Сам же трипсиноген може перетворюватися на трипсин як автокаталітично – під дією трипсину, так і під дією свого фізіологічного активатора - ентерокінази (ентеропептидази, К.Ф.3.21.9), який здійснює активацію трипсиногену шлункового соку при його надходженні у дванадцятипалу кишку. Якщо активація ентерокіназою відбувається ще тоді, коли панкреатичний сік знаходиться у підшлунковій залозі, то передчасно спрацьовують всі протеолітичні та ліполітичні його ферменти, через що відбувається розщеплення структурних компонентів тканин – розвивається гострий панкреатит.
Трипсиноген пертворюється на трипсин внаслідок єдиного розщеплення зв’язку Lys6-Ile7 і відщеплення N-кінцевого гексапептиду (преактиваційного пептиду). Будова преактиваційних пептидів різних організмів досить подібна і характеризується наявністю кластера із чотирьох аспарагінових кислот, що грають роль “іонного замка”, який утримує профермент в неактивному стані. Внаслідок відщеплення в молекулі відбуваються конформаційні зміни, що приводить до формування активного центра фермента.
Викликана трипсином активація хімотрипсиногену проходить за схожим, хоча й складнішим механізмом. Активація хімотрипсиногену А в активний фермент відбувається за рахунок конформаційних змін, викликаних триптичним розщепленням зв’язку Arg15-Ile16. На відміну від трипсину активаційний пептид залишається в складі молекули через дисульфідний зв’язок, утворений його N-кінцевим цистеїном. Автокаталітичні розщеплення ведуть до накопичення α-хімотрипсину – трьохланцюгового білка, прошитого п’ятьома дисульфідними зв’язками.
Активація проеластази в еластазу досить подібна активації трипсиногену в трипсин і відбувається після триптичного відщеплення маленького N-кінцевого пептиду.
Панкреатичні СП після надходження в тонкий кишечник здійснюють гідроліз пептидів, утворених внаслідок дії пепсину в шлунку. Хоча гідроліз здійснюється різними протеїназами по різних амінокислотних залишках, вузької специфічності ця функція не вимагає – трипсин, хімотрипсин і еластаза розщеплюють пептидні ланцюги незалежно від конформації, якщо, звичайно, ті мають відповідні амінокислотні залишки, які пасують до “гідрофобної кишеньки” ферменту. Виняток становлять лише нативні білкові інгібітори, які зв’язуються з іншою ділянкою міжмолекулярної взаємодії СП.
Хімаза і триптаза – СП хімотрисинового і трипсинового типів відповідно, що локалізовані в жирових клітинах різних тканин, а також у гранулах нейтрофілів і базофілів. Триптаза в клітинах, як правило, зв’язана зі своїм інгібітором – білком трипстатином. Це тетрамер із Мm 140 кДа, що складається з чотирьох каталітичних субодиниць. Молекула хімази являє собою одинарний поліпептидний ланцюг з Мm 30 кДа. В гранулах жирових клітин цей фермент існує в комплексі з гепарином і гепаринсульфатом. Вважається, що ці обидві СП включені в деградацію протеогліканів сполучної тканини, в розщеплення колагену базальних мембран, в активацію протромбіну та фактора Х згортання крові. Вони пов’язані з притоком іонів Са2+, вивільненням гістаміну і стимуляцією процесу дегрануляції, хемотаксисом, метилюванням фосфоліпідів.
Пролінендопептидаза (постпролінрозщеплюючий фермент) (КФ 3.4.21.26) – гомодимер з Мm 69 кДа. Міститься в цитоплазмі різних типів тканин ссавців, здійснює гідроліз зв’язку з С-кінця залишку проліну в пролінвмісних пептидах та поліпептидах (наприклад, антидіуретичних гормонів окситоцину та вазопресину, які синтезуються в гіпофізі і виділяються гіпоталамусом).
Інгобсин – міститься в клітинах слизової оболонки кишечника тварин. Це одноланцюговий поліпептид з Мm 33 кДа, який гідролізує зв’язки Lys-A і Arg-A. Вын локалізований в основному в ЕПС і бере участь у секреції мукозного глікопротеїну.
Перфорин – міститься в лініях цитолітичних лімфоцитів; пошкоджує інші клітини, в тому числі еритроцити. Вважається, що перфорин являє собою протеїназу з двох однакових субодиниць з Мm 30 кДа кожна. Перфорин включений в цитоплазматичні гранули і секретуєтьсялімфоцитами після їх стимуляції Са2+-іонофором. Ці спостереження свідчать про те, що цитолітичні лімфоцити секретують цей білок при взаємодії з клітинами-мішенями.
Калікреїн – виявляється переважно в крові і сечі, крім того в деяких типах клітин, зокрема підщелепної залози. Його Мm близько 30 кДа. Калікреїн бере участь в утворенні брадикініну з кініногенівта інших біологічно активних пептидів, зокрема нейропептидів, активує додаткові кількості фактора Х згортання крові (перший етап зовнішнього шляху згортання).
Серинові АТФ-залежні протеїнази – як і всі АТФ-ази, потребують іонів Mg2+ та інгібуються іонами ванадію. Прикладом такої СП може служити протеїназа, вперше виявлена в мітохондріях клітин кори наднирників. Це гексамер з Мm субодиниці 106 кДа. При її дії гідроліз макроергічного зв’язку не є конче потрібним. В мітохондріях гепатоцитів подібна протеїназа має в 10 разів нижчу активність. Очевидно, вона специфічна лише для аномальних білків, а в наднирниках вона гідролізує також білки з незміненою структурою, в тому числі гемоглобін.
Еластаза і нейтральна протеїназа виділяються лізосомними гранулами гранулоцитів крові у вогнищах запалення. Їх дія контролюється α1-антитрипсином, знайденим в α-глобуліновій фракції сироватки крові. Спадкова відсутність α1-антитрипсину або його повільне вивільнення змісця синтезу (печінки) призводить до важкого перебігу емфіземи в ранньому дитинстві. Причиною цього є невпорядкована робота еластази і нейтральної протеїнази, які викликають локальний розпад колагену.
Цей фермент виконує специфічну функцію руйнування стінки кокона при виході з нього гусениці шовковичного шовкопряда. Він виділяється слинними залозами гусениці і гідролізує фіброїн шовкових волокон до пептидів. Розпушена таким чином стінка кокона легко прогризається щелепами гусениці.
В цій курсовій роботі з різних джерел зібрано дані, що стосуються біологічних функцій сериновивих протеїназ. З них можна скласти уявлення про різноманіття, важливість і складність функцій СП.
При всьому різноманітті функцій дія СП відбувається за однаковим механізмом “переносу заряду”, який забезпечується ідентичною у всіх СП будовою гідролітичного центру. Усім СП властива також гомологічність амінокислотних послідовностей цілих ланцюгів. Саме гомологічністю пояснюються їх спільні риси (порівняно невеликі розміри, утворення з неактивних проформ, подібність конформацій у окремих СП, залежність від іонів Са2+) цей клас ферментів можна вважати яскравим прикладом дивергентної еволюції.
Увесь спектр СП можна функціонально поділити на дві групи: високоспецифічні (виконують преактиваційні розщеплення зимогенів чи модифікують нейропептиди і структурні білки) і низькоспецифічні (перетравлюють білки у шлунково-кишковому тракті, виконують лізис відпрацьованих органел). Дослідження функцій більшості СП досить перспективне з погляду практичного застосування.
Вивчення функції СП в системі гемостазу дуже актуальне з огляду на нагальну проблему створення штучного замінника крові чи плазми, який повинен точно вписуватися в природну систему гемостазу людського організму та забезпечувати гемостаз не гірше за неї. Роль СП у запальних процесах становить інтерес для медицини: дані щодо цієї ролі можуть бути використані для впливу на перебіг запальних процесів у бажаному напрямі. Високоспецифічні СП перспективні з погляду їх використання у фармакології, аналітичній біохімії, біотехнології. У біотехнології можливе також використання здатності деяких СП гідролізувати такі стійкі білки, як, наприклад, фіброїн шовку чи колаген. Таку властивість можна застосувати для виробництва амінокислотних добавок у раціон тварин чи навіть людини з різних білкових відходів (кератини, колаген). Така особливість СП як інактивація їх специфічними білковими інгібіторами теж може бути використана в біотехнології для регуляції технологічних процесів. Потребує детальнішого з’ясування роль перфорину та АТФ-залежних СП через потребу в таких даних імунології
Загалом СП вже давно знаходять широке застосування у медицині, фармакології, легкій та харчовій промисловості, аналітичній біохімії і найрізноманітніших галузях біотехнології. Докладне дослідження біологічних функцій СП необхідне з метою використання їх у цих галузях, та, безумовно, знайде собі використання в багатьох інших.