МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ

Отчет

РАЗДЕЛЕНИЕ ПИГМЕНТОВ МЕТОДОМ БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

студентка IV курса

В.Н.Захарьина

Научный руководитель:

Горбанева Т.Б

Красноярск 2008

1. Характеристика пигментов

Ксантофиллы (от греч. xanthуs— жёлтый и phэllon — лист), кислородсодержащие каротиноиды; главная составная часть жёлтых пигментов в листьях, цветках, плодах и почках высших растений, а также во многих водорослях и микроорганизмах. В животном мире ксантофиллы встречаются реже (в курином желтке, печени и жировой ткани млекопитающих). Содержатся в хлоропластах зелёных частей растений, в хромопластах цветков и плодов, в липофильных участках бактериальных клеток. В сочетании с флавоноидами создают осеннюю окраску листвы. Биологическое значение ксантофиллов связано с их способностью поглощать энергию солнечного света в коротковолновой части видимого спектра (380—520 нм). Все фотосинтезирующие органы в зелёных растениях и фотосинтезирующих микроорганизмах содержат ксантофиллы В этих органах происходит перенос поглощённой ксантофиллом световой энергии на хлорофилл или подобную ему систему. Т. о., ксантофиллы участвуют в фотосинтезе в качестве дополнительных пигментов. По-видимому, ксантофиллы играют также роль светофильтров, защищающих чувствительные к свету ферменты от разрушения. Известно более 50 различных ксантофиллов с разными функциональными группами (спирты, кетоны, альдегиды, окиси, простые и сложные эфиры), относящихся к ациклическим, моноциклическим и бициклическим каротиноидам, содержащим 40 атомов углерода. Типичные представители ксантофиллы — зеаксантин, C40H56O2,— жёлтые кристаллы (tпл 207—215°С) и изомерный ему ксантофилл, или лутеин, — фиолетовые кристаллы (tпл 190—193°С). Биосинтез Ксантофиллы из бесцветных каротиноидных углеводородов проходит с участием кислорода воздуха на свету [3].

Каротиноиды – пигменты, которые содержатся в растениях, устойчивых к пониженным температурам. Когда хлорофилл исчерпывается в холодное время года, листья приобретают заметную желтую или оранжевую окраску за счет пролонгированного действия пигмента каротиноида. Каратиноиды защищают растения от пагубного действия солнечного света, принимая УФ - излучения солнца на себя, трансформируя в энергию и передавая ее хлорофиллу. С помощью такой передачи хлорофилл регулируют процессы фотосинтеза. В доказательство того, что каротиноиды присутствуют в листьях постоянно на равне с хлорофиллом, послужит следующий пример: к спиртовой вытяжке хлорофилла прилить бензина 1:1, взболтать смесь и дать отстояться, смесь расслоится. Нижний слой из спирта имеет желтую окраску и содержит желтый пигмент ксантофилл. Верхний бензиновый слой зеленого и содержит хлорофилл и каротин. Оранжево-красный цвет растениям дает пигмент каротин, желтую – ксантофилл. Эти пигменты имеют белково-липоидную основу. Эти пигменты обнаружены в плодах помидоров, апельсинов, мандаринов, в корне моркови. Основная роль этих пигментов – придать растениям яркую привлекательную окраску, привлекая птиц и животных для разнесения семян. Цветы с оранжево-желтой окраской – лютик, настурция [1].

Хлорофилл – зеленый пигмент растений, с помощью которого они улавливают энергию солнечного света и осуществляют фотосинтез. Локализован в особых клеточных структурах – хлоропластах или хроматофорах и связан с белками и липидами мембран. Основу структуры молекулы Х, составляет магниевый комплекс порфиринового цикла; в 4 пиррольном кольце к остатку пропионовой кислоты присоединен высокомолекулярный спирт фитол, который придает хлорофиллу способность встраиваться в липидный слой мембран хлоропластов [2].

Высшие растения и зеленые водоросли содержат хлорофилл а и в, бурые и диатомовые водоросли – а и с, красные водоросли – хлорофилл а и d. В фотосинтезирующих бактериях присутствуют близкие аналоги хлорофилл а – бактериохлорофиллы. По своему строению хлорофилл близок к другим природным комплексам порфиринов (с железом) – дыхательным пигментам – цитохромам, красящему веществу крови – гему, а также простетическим группам некоторых ферментов- пероксидазы, каталазы [3].

2. Ход работы

Работа включает несколько этапов

Получение вытяжки пигментов – отцентрифугировали культуру водорослей, объемом 150 мл, при 5 тыс/об в минуту, осадок аккуратно перенесли в ступку, добавили немного песка и растворителя (смесь спирта и ацетона 3:1) и тщательно растерли до гомогенизированного состояния. Экстракцию проводят следующим образом. В колбе Бунзена на пробке укрепили стеклянный фильтр №4. На дно коблы установили пробирку, в которую опускается конец стеклянного фильтра. Колбу соединили с воздушным насосом Камовского. Жидкость из ступки сливается по стеклянной палочке на фильтр, носик ступки предварительно смазывается вазелином снаружи во избежание растекания раствора. В ступку приливается еще 4-5 мл растворителя и содержимое вновь тщательно растирается, затем жидкость сливается в воронку и фильтруется в пробирку, вставленную в колбу Бунзена. Промывание проводиться до тех пор, пока вытекающий из воронки растворитель не станет бесцветным. После экстракции остается сероватая масса без признаков наличия пигментов. Объединенная порция экстракта доводиться растворителем до определенного объема (10мл). Экстракт содержит сумму зеленых и желтых пигментов.

Спектрофотометрирование.

Определение оптической плотности экстракта осуществляется на спектрофотометре. Область оптических плотностей в которой рекомендуется работать, лежит в пределах 0,2-0,8. Если оптическая плотность экстракта выше, то его следует разбавить. Образец разбавили в три раза. Для количественного определения часть полученного экстракта наливают в кварцевую кювету на 1 см. Вторая кювета заполняется чистым растворителем (80% ацетоном). Кюветы помещают в кюветное отделение и определяют поглощение при длинах волн, соответствующих максимумам определяемых пигментов.

Для вычисления содержания пигментов полученные величины оптической плотности подставляют в формулы.

Совершенствование техники спектрофотометрических измерений позволило уточнить коэффициенты полученных раньше.

Совершенствование техники спектрофотометрических измерений позволило уточнить коэффициенты полученных ранее формул. А также сделало возможным определение в суммарном субстрате пигментов не только хлорофиллов а и в, но и каротиноидов (мг/л) в 80 % ацетоне.

С а = 12,21*А663 – 2,81*А646

С в = 20,13*А646 – 5,03*А663

Скар = (1000*А470 – 3,27*Са -100*Св)/229

Таблица 1 Величины оптической плотности

вариант	λ=470	λ=646	λ=663
Дина	1,5	0,45	1,062
Яна	0,38	0,7	0,225
Аня	0,65	0,1	0,44
Валя	0,28	0,375	0,16

Рассчитали концентрацию пигментов, полученные данные занесли в таблицу 2.

Таблица 2 Концентрация пигментов в вытяжке

	С а (мкг)	С в (мкг)	С кар (мг/л)
Дина	35,1	10,8	14,1
Яна	0,7	12,9	-4,01
Аня	5,09	-0,2	2,85
Валя	0,9	6,74	-1,7

Вычислили содержание пигментов в вытяжке, тут же посчитали их содержание с учетом объема, массы пробы и разведения.

Fа = 9*20/1000*1 = 0,18г/г

Fв = 67,4*20/1000*1 = 1,35 мг/г

Fкар = -17*20/1000*1 = -0,34 мг/г

Нанесение пигментов на бумагу

Для разделения пигментов используют лист бумаги размером 16х16 см.

При одномерной хроматографии 1 мл полученной вытяжки наносят полосой длиной 12 см на расстоянии 2 см от нижнего края листа. Нанесли 1,4 мл образца.

Разделение пигментов на одномерной хроматограмме

На одномерной хроматограмме в зависимости от применяемой для разгонки смеси растворителей удается отделить каротин, ксантофиллы и хлорофилл а и в.

Хроматограмму помещают в камеру, заполненную 30 мл смеси, состоящей из бензола и петролейного эфира (2:1). Через 30-40 минут, когда фронт растворителя поднимется на 14 см и будет видно четкое разделение пигментов, хроматограмму вынимают и подсушивают. Самую верхнюю полосу образует каротин, ниже него лежит хлорофилл а, под ним распологаются ксантофиллы, а самый последний – хлорофилл в.

Окрашенные полосы, соответствующие пигментам вырезают, измельчают и переносят в отдельные бюксы на 25 мл. Каротин эллюируется хлороформом, ксантофиллы и хлорофиллы – смесью спирта с ацетоном (1:3).

Растворитель добавляют небольшими порциями, каждый раз настаивая 2-3 минуты.

Эллюция пигментов с бумажного носителя

Эллюцию проводят до полного обесцвечивания бумаги. Элюат фильтруется через стеклянный фильтр или центрифугируется для удаления взвешенных частиц бумаги. Экстракт аккуратно сливают в мерные пробирки и доводят до 5-10 мл в зависимости от интенсивности окрашивания. Полученные экстракты используют для фотоколориметрии с использованием калибровочной кривой, построенной для определенного прибора.

Для получения калибровочных кривых использовали два раствора – раствор Гетри (для зеленых пигментов) и двухромовокислый калий (для желтых пигментов).

Определение оптической плотности пигментов

Оптическую плотность элюата определяют на фотоэлектроколориметре, за синим светофильтром для желтых пигментов и красным для зеленых. Желательно работать в средней области шкалы, где относительная ошибка прибора минимальна.

Оптическая плотность элюата

Д	Хлорофилл а	Хлорофилл в	каротин
	0,015	0,01	0,025

Перед тем, как рассчитать содержание пигментов, была построена калибровочная кривая. Использовали раствор известной концентрации 1% CuSO4*5H2O – 25,5 мл; 2%К2Сr2O7 – 50 мл; 7% - NН4ОН (100мл раствора).

Желтые пигменты

разведение	Д
1:0	0,745
1:1	0,35
1:2	0,274
1:3	0,235
1:4	0,19
1:5	0,165
1:6	0,133

Зеленые пигменты

разведение	Д
1:0	0,38
1:1	0,18
1:2	0,12
1:3	0,1
1:4	0,095
1:5	0,08
1:6	0,065

После измерения оптической плотности был построен калибровочный график.

Эквиваленты:

Хлорофилл а – 23,3 мг

Хлорофилл в – 31,5 мг

Каротин – 2,35мг

Виолоксантин – 2,7 мг

По калибровочному графику с помощью оптической плотности элюата нашли концентрации хлорофиллов и каротиноидов. (рис1)

Затем рассчитали содержание пигментов по формуле

Х= (С1*Vэл*Vэк)Vн*Р,

где С1- концентрация пигмента в элюате, определенная по калибровочному графику согласно оптической плотности;

Vэл – объем элюта, мл; Vэк – объем экстракта из навески, мл; Vн – объем раствора, нанесенного на бумагу, мл; Р – навеска в г.

Ха = (4,5мг/л*5мл*20мл)/2мл*1г=225мг/л

Хв = (1мг/л*5мл*20мл)/2мл*1г=50мг/л

Хкар = (1,2мг/л*5мл*20мл)/2мл*1г=60мг/л

Чтобы сравнить получившиеся данные по двум способам расчета пигментов, необходимо привести к одним единицам измерения.

Ха =225мг/л/1000 = 0,225 мг/г

Хв = 50мг/л/1000 = 0,05 мг/г

Хкар = 60мг/л/1000 = 0,06 м/г

Рис1. Калибровочная кривая для зеленых пигментов (ряд1 – хлорофилл а, ряд 2 – хлорофилл в)

Рис2. Калибровочная кривая для жлтых пигментов (ряд1 – каротиноиды, ряд2 – виолоксантин)

Вывод

В данной работе были использованы 2 метода определения и количественного подсчета пигментов: спектрофотометрический и бумажная хроматография (была использована одномерная хроматограмма). При этом значения содержания пигмента хлорофилла а получилось больше в методе бумажной хроматографии (Ха = 0,225мг/г) в то время как спектрофотометрический метод определил (Fа = 0,18мг/г); значения содержания пигмента хлорофилла в оказались больше при спектрофотометрическом методе(Fв = 1,35мг/г), а при бумажной хроматографии (Хв = 0,05мг/г). Значения по каротиноидам получились меньше при спектрофотометрии (Fкар = -0,34мг/г),при бумажной же хроматографии мы получили (Хкар = 0,06мг/г).Это может быть объяснено тем фактом, что метод бумажной хроматографии более точен.

Также в данной работе был использован колориметрический метод. На основе этого метода был построен график зависимости оптической плотности от концентраций хлорофиллов а, в и каротиноидов.

Список литературы

1.Гудвин Т., Сравнительная биохимия каротиноидов, пер. с английского, М., 1954.

2.Тимирязев К.А., Солнце, жизнь и хлорофилл, Избр. Соч., т.1, М., 1948.