Когда мышца сокращается, то на это тратится энергия. Это ясно. Одним из показателей затраты энергии является потребление кислорода. Но оказывается, что кислород потребляется и покоящейся мышцей или нервом. В 1932 г. М. Березина, работавшая в лаборатории английского биофизика А. Хилла, показала, например, что нерв краба в покое потребляет 50% того количества кислорода, которое требуется ему при усиленной работе. В связи с этими данными Хилл писал: «Таким образом, ничего не делая, а просто находясь в состоянии готовности к ответу, нерв потребляет около половины той энергии, которую он использует при максимальном ответе». Сейчас достоверно известно, что эта энергия в основном расходуется га поддержание ионных концентраций, а следовательно, и на поддержание потенциала покоя.

Напомним, что ПП в основном создается за счет разности концентраций калия внутри клетки, где его много, и вне клетки, где его мало. Но мембрана проницаема, хотя и в небольшой степени, также и для ионов натрия. Ионы натрия должны проникать внутрь клетки по градиенту потенциала, а наружу вместо них должны выходить ионы калия. За счет этого процесса ПП должен постепенно снижаться. Однако в живых организмах этого ие происходит. Существует какой-то механизм, который все время поддерживает ПП, а значит и разность концентраций калия внутри и вне клетки. Этот механизм должен перемещать ионы калия внутрь клетки, т.е. туда, где их концентрация выше, чем снаружи, а такие перемещения против градиента концентрации требуют затраты энергии.

Косвенные данные, показывающие, что энергия покоящегося нерва затрачивается на поддержание ПП, были получены еще в 30-годы, когда Р. Джерард показал, что величина ПП в нервном волокне прямо зависит от содержания кислорода в омывающей волокно среде.

Изучение механизма поддержания ионной концентрации является одной из важных задач биоэнергетики – раздела молекулярной биологии. Биоэнергетика, которая изучает, откуда живая клетка получает энергию и на что ее тратит, оказалась теснейшим образом связанной с электробиологией. Каковы же молекулярные механизмы поддержания ионных концентраций?

Мы уже говорили, что в наружную клеточную мембрану встроены разного рода белковые молекулы. Оказывается, некоторые из этих молекул играют роль своеобразных насосов, «закачивая» ионы калия внутрь клетки и выкачивая ионы натрия наружу. Они так и называются – «ионные насосы». Эти белки, очень сложно устроенные, представляют собой настоящую молекулярную машину, умеющую делать удивительные вещи. Например, показано, что она имеет два активных центра, одним из которых может захватывать ион калия, а другим – натрия. Найдено также и «топливо», на котором работает эта машина. Это особое химическое соединение – аденозинтрифосфорная кислота. Известен также «коэффициент полезного действия» этого топлива: опыты с радиоактивными изотопами показали, что энергии распада одной молекулы АТФ достаточно для выкачивания наружу трех ионов натрия и закачивания внутрь клетки двух ионов калия. Как работает эта молекулярная машина, точно не известно, но можно представить себе, например, такую схему. Захватив одним активным центром из наружной среды ион калия, а другим – из внутренней – ион натрия, она, потребляя АТФ, поворачивается внутри мембраны на 180°. Ион натрия оказывается вне клетки и там отделяется, а ион калия попадает внутрь и тоже освобождается, после чего молекула белка принимает исходное положение и все начинается сначала. Этот белок, открытый в 1957 г. С. Скоу, обычно называют натрий-калиевым насосом.

Если прекратить подачу кислорода к клетке, то в ней через некоторое время исчезает АТФ и прекращается перекачка калия и натрия; тогда разности концентраций начинают выравниваться и ПП начинает падать. Если в такую клетку ввести АТФ, то насос возобновляет работу и ПП восстанавливается. Это и объясняет опыты Дже-рарда.

Мы знаем, что процессы в организме регулируются. Сердце бегуна бьется втрое чаще, чем у спокойно сидящего человека. Работа сердца регулируется нервной системой. А можно ли как-то регулировать работу молекулы, управлять молекулярной машиной?

Оказалось, что работа ионных насосов управляется концентрацией ионов внутри клетки и вне ее. При этом работа насоса ускоряется избытком ионов калия снаружи клетки или избытком ионов натрия внутри клетки.

Поскольку натрий-калиевый насос выкачивает наружу больше ионов натрия, чем закачивает внутрь ионов калия, он меняет не только концентрацию этих ионов, но и мембранный потенциал. Поэтому натрий-калиевый насос называют электрогенным насосом. В каждом цикле работы насос выбрасывает наружу лишний ион натрия и тем самым гиперполяризует мембрану. После одного или нескольких ПД в клетке оказывается избыток Ка+; это активирует работу насоса. Интенсивно выкачивая натрий, насос может заметно гиперполяризовать мембрану: МП может на 20 мВ превышать ПП за счет работы насоса. Таким образом, насосы не только влияют на концентрации ионов, но могут быть и источниками заметной разности потенциалов.

Мы с вами вкратце ознакомились с работой одного из мембранных белков – натрий-калиевого насоса. В дальнейшем нам придется говорить про многие другие мембранные белки. Но одно важное замечание можно сделать уже после этого первого примера. До сих пор мы рассматривали такие процессы, которые протекали совершенно одинаково и в физических, и в биологических системах. ПП возникает совершенно одинаково и на полупроницаемой мембране нервного волокна, и на полупроницаемой стенке глиняной трубки. Теперь мы в первый раз столкнулись с таким явлением, которое не встречается в физике, так как оно является результатом биологической эволюции. Это машина, размером всего в одну молекулу, перекачивающая ионы через мембрану. Работа этой машины может регулироваться как поставками энергии, так и ситуацией в окружающей среде. С разными молекулярными машинами мы неоднократно встретимся в дальнейшем.

Какие еще бывают насосы?

Важнейшую роль в осуществлении самых разных клеточных функций играет ион кальция. В покое внутри клетки очень мало ионов свободного кальция по сравнению с окружающей средой – всего 10~7 – 10~е моля. Под влиянием тех или иных воздействий кальций может попадать в клетку, но потом должен быть удален из цитоплазмы. Если высокая концентрация кальция в клетке не устраняется, клетка через некоторое время погибает, Поэтому клетки очень тщательно следят за внутриклеточной концентрацией кальция. В клеточной мембране имеется специальный кальциевый насос, выкачивающий ионы кальция в наружную среду. Этот насос электронейтрален: он обменивает ион кальция на два протона.

В особом положении находятся мышечные клетки. Для мышечного сокращения необходимо много ионов кальция, и его надо доставлять к каждой из белковых фибрилл, пронизывающих все тело клетки *). Его надо быстро доставлять, а потом так же быстро убирать от фибрилл, чтобы мышца могла расслабиться. Если бы кальций поступал и удалялся через наружную мембрану клетки, такое быстрое его перемещение было бы невозможным. Мышечные клетки нашли выход из положения. Внутри них имеется разветвленная система полостей и трубочек» образованных специальной внутренней мембраной. В этих полостях и хранится кальций, туда же он убирается для расслабления мышцы. Вся эта внутренняя мембрана густо покрыта молекулами – молекулами кальциевого насоса. Концентрация кальция в полостях в расслабленной мышце в тысячи раз выше, чем в остальных частях клетки. Работа насоса обходится клетке недешево: на перенос двух ионов кальция насос расходует одну молекулу АТФ.

На этом примере мы видим, что молекулярные машипи могут работать не только на наружной мембране клетки, но и на ее внутренних мембранах.

Протонная помпа

Ионные насосы имеются не только в клетках животных. Например, у гриба нейроспоры обнаружен электрогенный ионный насос, который работает на энергии АТФ и может создавать на мембране гриба разность потенциалов в 200 мВ за счет энергичного выкачивания протонов из клетки. У галобактерий обнаружен протонный насос, работающий на энергии света. Интересно, что белок, образующий этот насос, весьма схож по строению с родопсином рецепторов сетчатки.

А теперь обратите внимание на то, как далеко мы вдруг ушли от нервного волокна или мышцы, с которыми работали и Гальвани, и Дюбуа-Реймон, и поколения других электрофизиологов. Вдруг речь пошла о бактериях и грибах, а могла с таким же успехом пойти и о клетках растений.

В биологии очень важно сравнивать между собой разные объекты, чтобы уберечься от ложных заключений, переноса свойств одного животного на весь органический мир. И что же показало такое сравнительное изучение? Оказалось, что все клетки имеют ПП! Причем у разных клеток он может создаваться разными способами: в нервном волокне – за счет градиента концентрации калия, а у гриба нейроспоры – за счет работы протонной помпы.

Мы знаем, что у нервных и мышечных клеток их мембранный потенциал как-то используется для передачи сигналов и сокращения. Но зачем нужен ПП клеткам бактерий или грибов?

Зачем невозбудимым клеткам потенциал покоя?

Вернемся на минутку к клеткам животных. Ведь и у животных кроме нервов и мышц есть и клетки печени, и клетки желудкаА и клетки кожи. Зачем нужен им ПП?

До сих пор, когда мы говорили о движении веществ через клеточную мембрану, мы в основном рассматривали или воду, или ионы. Но всем клеткам необходимо получать питательные вещества, например сахара, или аминокислоты для построения клеточных белков. Сами по себе эти вещества очень плохо проходят через липидные пленки. Как же они попадают в клетки? Оказалось, что, как правило, они проходят внутрь клеток тогда, когда на клеточной мембране есть потенциал, а в окружающей среде – ионы натрия. Почему?

Здесь мы сталкиваемся с новым классом молекулярных машин белков-переносчиков и с явлением электрического транспорта. Эти белки присоединяют к себе на наружной части мембраны молекулу и ион натрия, приобретая положительный заряд. Тогда электрическое поле втягивает переносчик к внутренней поверхности мембраны, где он отделяет сахар и натрий. Затем белок-переносчик вновь проходит через жидкую липидную мембрану на поверхность, где захватывает новые молекулы сахара и натрий. Лишний натрий, который попадает внутрь клетки, откачивается наружу натриевым насосом.

Итак, теперь мы понимаем, что мощное электрическое поле в мембране создается не зря: клетка, обладающая ПП, может эффективно втягивать внутрь положительно заряженные молекулы или комплексы молекул. Молекула сахара сама по себе не несет заряд, а переносчик не присоединяет ион натрия, пока сахар не займет свое место. Можно сказать, что переносчик играет роль кареты, сахар – седока, а натрий – роль лошадки, хотя он не сам вызывает движение, а его втягивает в клетку электрическое поле. Для поглощения из среды разных Сахаров или разных аминокислот клетка имеет и разные белки-переносчики. Переносчики у бактерий доставляют в клетку сахара не с ионом натрия, а с ионом водорода.

Таким образом, мембранный потенциал используется всеми клетками для электрического транспорта разных веществ.

Электрический транспорт может быть использован и для удаления некоторых веществ из клетки. Приведем пример. Мы уже говорили, что избыток кальция в клетке опасен для нее. Если кальция в клетку попало много и кальциевый насос не справляется с его удалением, включается особая аварийная система и в дело вступает белок-переносчик. Он присоединяет внутри ион кальция, а снаружи – три иона натрия и переносит кальций наружу, а натрий – внутрь клетки. В отличие от натрий-калиевого насоса, который использует энергию АТФ, этот кальциевый переносчик работает как электромотор, используя энергию мембранного потенциала. Правда, при каждом цикле работы внутрь клетки тут попадают три иона натрия, но это не так страшно, как попадание ионов кальция.

Все рассказанное нами наводит на мысль, что нервные клетки, несколько модифицировав свою мембрану, использовали мембранный потенциал, присущий любой живой клетке, для выполнения новой функции – передачи сигналов. То, что служило для транспорта веществ, стало служить для передачи информации. Такой способ эволюции называется «смена функций»; он был открыт еще Дар-вином и подробно разработан почти сто лет назад немецким зоологом А. Дорном.

Как организмы используют свои ионные насосы

Успехи молекулярной биологии часто позволяют понять процессы, происходящие на клеточном и даже на органном уровне. Так. открытие ионных насосов позволило биологам совершенно иначе представить себе работу целого ряда органов животных или выполнение клеточных функций. Мы рассмотрим лишь несколько примеров такого нового понимания,

Есть животные, которые пьют только морскую воду9 папример альбатросы. Специальные железы, клетки которых снабжены ионными насосами, выделяют наружу лишнюю соль. Железы с такими же функциями имеются и у некоторых растений, растущих на засоленных почвах.

Интересно, что «опреснители» существуют и у морских рыб. Дело в том, что их кровь менее соленая, чем окружающая среда, поэтому вследствие осмоса вода «вытягивается» из тела рыбы через жабры. Приходится пить много воды, но с ней в организм попадает лишняя соль. Эта соль выкачивается наружу ионными насосами, которые расположены в мембране клеток тех же жабер.

А у пресноводных рыб или лягушек вода, напротив, поступает в тело, разбавляя внутреннюю среду. Поэтому у этих рыб насосы жабер, а у лягушек ионные насосы кожи ловят разнообразные ионы в окружающей среде и перекачивают их внутрь организма. Работу такого электрогенного насоса когда-то и удалось зарегистрировать Дюбуа-Реймону на коже лягушки.

С ионными насосами связана работа органов пищеварения и выделения различных животных, они принимают участие во всасывании продуктов пищеварения, выделении отходов метаболизма и др. В специальных клетках желудка позвоночных имеется протонная помпа. Она выкачивает в просвет желудка положительно заряженные ионы водорода, за которыми идут отрицательные ионы хлора; так в желудке вырабатывается соляная кислота.

Рассмотрим еще работу кишечника человека и других позвоночных. Когда пища в кишечнике разрушается пищеварительными ферментами, там возникает очень много молекул, которые создавали бы огромное осмотическое давление. В передние отделы кишечника все время поступает вода так, чтобы поддерживалось такое же осмотическое давление, как в плазме крови. Вместе с водой в двенадцатиперстную кишку поступают ионы натрия и хлора. В тонком кишечнике натрий вместе с молекулами Сахаров и аминокислот захватывается молекулами-переносчиками. Это создает разность потенциалов на эпителии тонкого кишечника, а разность потенциалов вызывает движение ионов хлора. В результате в кровь возвращаются натрий и хлор, а также сахара и аминокислоты. Вслед за этими веществами по законам осмоса идет всасывание воды. За сутки из кишечника всасывается в кровь примерно 10 литров воды, это больше^ чем все количество крови в организме. Таким образом, кишечник работает за счет «круговорота воды», а также ионов натрия и хлора.

Итак, ионные насосы обслуживают самые разные функции организма: снабжение клеток пищей, поддержание солевого состава внутренней среды организма, регуляция осмотических процессов; ионные насосы позволяют растениям поглощать воду и соли из почвы, животным – пить только морскую воду и т.д. Создание высокой концентрации калия и связанного с ней ПП в возбудимых тканях – нервах и мышцах – лишь небольшая побочная веточка в этих разнообразных и важных электрических процессах.

Ионные каналы

Мембранная теория, о которой было рассказано в гл. 4, объяснив ряд классических экспериментальных данных, поставила перед биологами целый ряд новых вопросов. Чем обусловлена проницаемость мембраны для ионов калия и натрия? Каким способом мембранный потенциал меняет проницаемость мембраны? Какие процессы лежат в основе уравнений Ходжкина – Хаксли?

Вы уже знаете, что проводимость клеточных мембран в основном определяется содержащимися в них белками, образующими в мембране «поры», через которые могут проходить небольшие молекулы. Те поры, через которые проходят ионы калия, назвали калиевыми ионными каналами, а те, через которые проходят ионы натрия, – натриевыми ионными каналами.

Ионные каналы образованы особым классом белковых молекул. Эти молекулы умеют отличать «свои» ионы, открывают или закрывают путь для ионов под действием потенциала на мембране и т.д. Таким образом, это еще один класс белковых машин, столь же важных, как и ионные насосы.

В начале 70-х годов английский биофизик Б. Хилле исследовал прохождение через натриевые и калиевые каналы ионов разного размера. Ионы, которые имели размер больше критического, не проходили через данный канал. Хилле выяснил, что диаметр калиевого канала равен примерно 0,3 нм, а у натриевого канала – чуть больше. На основании ряда таких опытов сложилось следующее приближенное представление о ионных каналах,

Ионный канал можно представить себе как трубку определенного диаметра, пересекающую мембрану. На одном конце такая трубка имеет «заслонку» или «ворота», положением которых управляет потенциал. Заслонка заряжена и поэтому при изменении потенциала может открывать вход в канал. Иными словами, считается, что ворота каналов представляют собой какую-то заряженную группу атомов, которая может смещаться в электрическом поле, открывая при этом дорогу для ионов калия или натрия. Смещение такой заряженной группы в молекуле белка должно регистрироваться в виде кратковременного небольшого электрического тока. И действительно, в 1973 г. Р. Кейнесу и Е. Рохасу удалось зарегистрировать этот ток в натриевых каналах. Чтобы более сильный ток натрия не замаскировал этот слабый воротный ток, натриевые каналы во время опытов были заблокированы тетродотоксином.

При изучении натриевых каналов было показано, что ворота и механизм инактивации расположены в разных участках канала. Фермент проназа, введенный внутрь гигантского аксона кальмара, «откусывает» часть натриевого канала, торчащую из мембраны. После такой процедуры канал продолжает открывать ворота под действием деполяризации но не инактивируется. Таким образом, предсказание модели X–X о наличии двух обособленных процессов – активации и инактивации – получило четкое экспериментальное подтверждение.

Удалось определить также плотность натриевых каналов в мембране. Это было сделано разными способами. Так, Хилле, который оценил диаметры каналов, рассчитал, какое сопротивление должен иметь один такой канал, и получил значение порядка 1010 Ом. Зная удельное сопротивление мембраны, можно найти плотность каналов. Другой метод состоял в том, что определялось число молекул тетродотоксина, необходимое для полной блокады натриевой проводимости. Оба метода дали очень близкие результаты. Оказалось, что на квадратном микрометре мембраны находятся всего несколько десятков каналов. Это очень мало, если учесть, что на той же площади располагаются несколько миллионов молекул липидов. «Молекулярное сито» оказалось похожим на решето, в котором пробито всего несколько дырочек.

Сначала думали, что существуют всего два типа ионных каналов – калиевые и натриевые, но оказалось, что это не так. Например, были открыты кальциевые каналы. Вначале их обнаружили у пресноводных животных – инфузорий и моллюсков. Это казалось естественным: в пресной воде обычно больше ионов кальция, чем натрия. Однако в дальнейшем оказалось, что кальциевые каналы есть и у позвоночных животных. Оказалось также^ что и сами натриевые каналы устроены не все одинаково. Например, в клетках сердца эмбрионов млекопитающих обнаружены натриевые каналы, которые не блокируются тетродотоксином. По мере созревания организма эти каналы заменяются другими – тетродочувствительными. Калиевых каналов тоже оказалось много сортов. Затем были открыты хлорные каналы и т.д. В конце концов, каналов наоткрывали почти столько же, сколько элементарных частиц. В одной и той же клетке сердца имеется много разных сортов ионных каналов и открываются все новые.

Развитие методик позволило перейти к изучению свойств отдельных каналов. Для этого микроэлектрод не вводят в мембрану, а плотно прижимают к ней. Так как каналы расположены далеко друг от друга, удается так прижать электрод, что под ним находится всего один канал. В таких работах удается получить ответы, например, на такой вопрос, сколько состояний есть у канала: «открыто» и «закрыто» или еще какие-то? В этих работах было обнаружено, что поведение одиночного канала является вероятностным. При данном уровне мембранного потенциала у канала есть определенная вероятность открыться на некоторое время. При другом уровне ПП эта вероятность меняется.

Теперь мы можем обсудить такой вопрос: чем определяется, например, рост мембранной проницаемости калия от времени при скачке мембранного потенциала? Если бы все каналы были одинаковыми и детерминировано управлялись бы электрическим полем на мембране, то постепенного изменения проницаемости не наблюдалось бы – она менялась бы скачком. Тогда все процессы возбуждения протекали бы совершенно иначе. Плавное изменение проницаемости можно объяснить либо присутствием в мембране каналов разного сорта с разной чувствительностью к МП, либо вероятностным характером работы каналов, который и был обнаружен экспериментаторами.

Таким образом, уравнения Ходжкина – Хаксли – это такие же макроскопические уравнения, как уравнение Менделеева – Клапейрона. И как за уравнением газового состояния стоят молекулярно-кинетическая теория и статистическая физика, так и за уравнениями X–X сюит статистическая физика каналов, которая сейчас энергично развивается.

Другие современные направления молекулярной биологии – это изучение устройства одиночных молекулярных машин, их деталей и их взаимодействия, выяснение того, какие атомные группы играют роль ворот и т.д. И, наконец, еще одно направление – генетика ионных каналов.

Если еще недавно предполагалось, что ионный канал – это стабильная машина, которая встраивается в мембрану н функционирует достаточно долго, то теперь выяснилось, что белки-каналы нервных клеток функционируют всего около суток, а потом разрушаются и на их место доставляются новые каналы. Синтезируются эти канальные белки, как и другие белки, специальными молекулярными машинами – рибосомами. «Команду», какой именно белок синтезировать, рибосомы получают от особых молекул – молекул информационной рибонуклеиновой кислоты. Английскому биологу Миледи удалось поставить такой красивый опыт. Он выделил из нервных клеток молекулы РНК и ввел их в яйцеклетку. В норме эти яйцеклетки невозбудимы, т.е. не реагируют на деполяризацию ПД. Однако те яйцеклетки, в которые ввели РНК нейронов, приобрели возбудимость и стали отвечать на раздражение такими же импульсами, как нервные клетки. Это означает, что по РНК нейронов на рибосомах яйцеклеток были синтезированы белки ионных каналов, эти белки сумели встроиться в мембрану яйцеклетки и нормально в ней работали.

Было обнаружено, что в мотонейронах позвоночных на теле клетки в основном находятся натриевые каналы, а на дендритах – кальциевые. Такое же распределение каналов обнаружили и на клетках Пуркинье – крупных нейронах мозжечка. Это означает, что белки-каналы, вырабатываемые клеткой, не просто встраиваются в мембрану нейрона где попало, а каналы разного сорта транспортируются в нужное место.

До сих пор речь шла о каналах, которые открываются и закрываются под действием электрического поля на мембране. Однако существуют и каналы совершенно иного сорта, которые управляются химическими веществами. Уже давно были известны каналы постсинаптической мембраны, которые открываются под действием медиатора. Но сейчас выяснено, что сходными свойствами обладают и каналы, не имеющие отношения к синапсам, причем они могут реагировать не на вещества, поступающие к наружной поверхности клетки извне, а на те вещества, которые вырабатываются внутри клетки или накапливаются в ней.

Например, существуют кальциевые каналы, лишенные инактивации. При деполяризации мембраны через них в клетку все время поступает поток ионов кальция. Если концентрация кальция в клетке достигает некоторого достаточно высокого уровня, то канал закрывается. Эти каналы можно закрыть и с помощью электрического поля, гиперполяризуя мембрану; таким образом, это каналы, так сказать, «двойного подчинения». Обнаружены и калиевые каналы, управляемые концентрацией кальция.

Для других кальциевых каналов показано, что они чувствительны к концентрации особого вещества цАМФ. Это вещество управляет рядом внутриклеточных процессов. Рост концентрации цАМФ в некоторых нейронах приводит к открыванию каналов и деполяризации клетки. Одним из первых такие каналы обнаружил советский биофизик Е.А. Либерман.

Таким образом, в последние годы стало ясно, что есть много типов каналов, что каналы – это динамические образования и, наконец, что существует много механизмов, управляющих работой каналов: это и электрические поля на мембране, и разные химические вещества.

В каждой клетке есть гены, ответственные за белки-каналы, но в одних клетках эти гены неактивны, а в других они функционируют. Так электрические процессы в клетке оказываются связанными с работой ее генетического аппарата. Клетка может не только управлять работой каналов изнутри, она может и модифицировать их, менять их свойства посредством биохимических реакций. Такие процессы происходят например, при обучении животного.