Введение

Метод пульс-электрофореза дает возможность разделять ДНК индивидуальных хромосом дрожжей и простейших. Размеры этих молекул варьируют от 0,2 до 10x106 нуклеотидных пар. В настоящее время создана технология выделения и обработки ДНК таких больших размеров как для эукариот, так и для прокариот. Таким образом, теперь существует возможность изучать целые хромосомы, последовательности ДНК которых насчитывают несколько миллионов оснований. Получены физические карты больших районов некоторых хромосом млекопитающих и целой хромосомы Esherichia coli. Цель этой работы – рассказать о биохимических методах, используемых при выделении больших молекул ДНК, и методах ПЭФ, применяемых для их анализа.

1. Приготовление образцов ДНК

Препараты ДНК с очень большой молекулярной массой невозможно получить, используя традиционные методы растворения, поскольку такие молекулы очень чувствительны к сдвиговым усилиям. В основе их – огромное осевое отношение молекул ДНК. Например, человеческая хромосома 21-самая маленькая в геноме. Ее ДНК насчитывает 50х10 п. н.и представляет собой единственную молекулу длиной 15 мм. Между тем диаметр этой молекулы всего 20 нм. Таким образом, осевое отношение составляет 10.

Для предотвращения разрушительного воздействия сдвиговых сил процедуру экстракции ДНК из клеток проводят в присутствии агарозы. Этот прием достаточно прост, и получаемые таким способом образцы можно затем использовать в традиционных электрофоретических опытах и экспериментах по клонированию. Живые клетки суспендируют в расплавленной низкоплавкой агарозе. Затем агарозе дают застыть в формочках объемом 100 мкл для формирования блоков, называемых вставками. Формочки можно приобрести у фирмы Pharma-cia-LKB или сделать самим, соединив вместе «хвост к голове» обычные гребенки для электрофореза нужных размеров. Все манипуляции с формочками следует проводить так, чтобы предотвратить их загрязнение нуклеазами. Перед употреблением формочки необходимо тщательно промыть дистиллированной водой и вытереть, одев перчатки. Затем одна сторона формочки заклеивается лентой, используемой в качестве донышка.

В качестве альтернативы агарозным блоквставкам могут выступить агарозные гранулы. Для их получения клеточную суспензию в агарозе по каплям добавляют в масло с одновременным перемешиванием. Размеры гранул контролируются скоростью перемешивания. С образцами ДНК в гранулах можно обращаться так же, как с растворенными. Однако мы предпочитаем использовать агарозные вставки, так как с ними проще работать.

Для выделения ДНК из клеток, лишенных клеточной стенки, поместите заполимеризовавшиеся агарозные вставки в раствор ESP и инкубируйте 2 дня при 50°С. В этом растворе происходит лизис клеток и отделение белков и других молекул от ДНК. Интактную хромосомную ДНК можно анализировать с помощью ПЭФ непосредственно из раствора ESP. Образцы ДНК в растворе ESP хранятся неопределенно долго при +4°С или даже при комнатной температуре прямо в пробирках Эппендорф.

При наличии клеточной стенки ее необходимо удалить перед экстракцией ДНК, поместив клетки в раствор ESP. Методики выделения ДНК из клеток с интактной стенкой представлены в табл. 4–6. Состав клеточной стенки значительно варьирует для различных организмов. В некоторых случаях может оказаться необходимым подбор различных ферментов, расщепляющих полисахариды клеточной стенки. Многие из этих ферментов не требуют для своей работы присутствия двухвалентных катионов. Таким образом, обработка этими ферментами может проводиться в присутствии большого количества ЭДТА для предотвращения деградации хромосомной ДНК-

Все образцы должны быть обязательно проинкубированы в растворе ESP в течение 2 дней при 50°С. Вставки станут прозрачными гораздо раньше окончания инкубации. Однако инкубацию следует продолжить, чтобы добиться полного отделения от ДНК связанных с ней различных молекул. Белки, связанные с ДНК, могут изменять ее электрофоретическую подвижность. Кроме того, образцы, проинкубированные более короткое время, оказываются устойчивыми к воздействию некоторых рестриктаз.

Наиболее общая проблема, возникающая при использовании описанной ниже техники получения ДНК из новых организмов, – это измерение конечной концентрации ДНК. Надо стремиться к тому, чтобы концентрация ДНК в агарозной блоквставке была «удобна» для нанесения на форезный гель. Такая концентрация должна быть определена эмпирически. Возможное число клеток и количество ДНК предложены в прилагаемых протоколах опытов. Эти цифры можно использовать как предварительные и менять в зависимости от условий куль-

1. 50 хисходный раствор Денхардта

Этот раствор – одни из компонентов смеси для прегибрндизации и гибридизации

На 500 мл раствора:

поливинилпирролидои 5 г, фиколл 5 г, БСА, фракция V 5 г.

Простерилизуйте фильтрацией через одноразовый фильтр и храните в аликвотах по 30 мл при – 20°С.

2. Раствор для лизиса клеток Е. coli

Раствор можно использовать для приготовления сферопластов из различных бактерий

Конечные концентрации На 1 л

6 мМ трис-HCl 6 мл 1 М раствора

1 М NaCl 58,4 г

100 мМ ЭДТА 100 мл 0,5 М раствора

0,5% бридж-58 60 мл 10%-ного раствора

0,2% дезоксихолата 50 мл 4%-ного раствора

0,5% са|ркозила 5 мл 100%-ного раствора

Проавтоклавируйте

Добавьте свежими: 1 мг/мл лизоцима яичного белка 20 мкл/мл бычьей панкреатической РНКазы

3. ESP

Этот раствор используется для выделения любых больших молекул ДНК.

Он имеет еще одно название – NDS.

Конечные концентрации

0,5 М ЭДТА

Автоклавируйте

1% лаурилсаркозин

Тщательно перемешайте до полного растворения 1 мг/мл протеиназы К Инкубируйте 2 ч при 37°С Храните в аликвотах замороженным

Для работы: смешайте с равным объемом образца и инкубируйте 1–2 дня при 50°С.

4. Смесь для прегибрндизации и гибридизации Конечные концентрации На 1 л

3хSSC 100 мл 30 X раствора

0,1% SDS 5 мл 20%-иого раствора

10Х раствор Денхардта 200 мл 50х раствора

10% декстрансульфат> 200 мл 50%-го раствора

ДНК спермы лосося 5 мг/мл

Смесь храните замороженной в аликвотах по 30 мл для прегибридизационного раствора и в аликвотах по 20 мл для гибридизационного раствора.

5. 1ХМ9

На 1 л: 50 г. Na2HPO «

30 г. КН2Р04

5 г NaCl

10 г. NH4C1

Разведите до однократной концентрации и проавтоклавируйте.

После автоклавирования добавьте Конечные концентрации На 1 л

1 мМ MgS04 1 мл 1 М раствора

0,1 М СаС12 0,2 мл 0,5 М раствора

0,4% глюкоза 10 мл 40%-ного раствора

0,5% казаминокислот 25 мл 20%-ного раствора

Необязательные добавки

50 мкл/мл аминокислот 10 мл раствора 5 мг/мл

10 мкг/мл витаминов 10 мл раствора 1 мг/мл

50 мкг/мл оснований 25 мл раствора 2 мг/мл

6. Pett IV

Этот раствор предназначен для отмывки бактериальных клеток перед выделением сферопластов

Конечные концентрации На 1 л

10 мМ трис-HCl 10 мл 1 М раствора

1 М NaCI 58,44 г.

Проавтоклавируйте.

7. 0,1 М ФМСФ Раствор используется для инактивации протеиназы К. Ресуспендируйте 17,5 мг ФМСФ в 1 мл изопропанола.

Помните, что раствор нестабилен, поэтому его надо использовать свежим и готовить перед употреблением. ФМСФ очень токсичен.

8. PSG

Этот раствор используется для отмывки простейших перед лизисом. Конечные концентрации На 1 л

75 мМ Na-фосфатный буфер 75 мл 1 М раствора

65 мМ NaCI 13 мл 3 М раствора

10% глюкоза 100 г.

Проавтоклавируйте.

Организм	Концентрация клеток в 100 мкл блок-вставки	Нагрузка на дорожку при форезе
Trypanosoma brucei Plasmodium falciparum Giardia lambia Leishmania	2х10х10 1Х10 2х10	1/16 1/8 1/10 1/16

Известно, что хромосомная ДНК из-за больших размеров молекулы чрезвычайно чувствительна к воздействию нуклеаз. В связи с этим необходимо принять за правило предварительно обрабатывать все растворы, контактирующие с ДНК. Растворы следует разлить на небольшие порции и простерилизовать. Стерильными должны быть и посуда, и оборудование. Для переноса образцов из вставок или из трубочек можно использовать изогнутую стеклянную палочку, простерилизованную в спирте и в пламени горелки. При работе с образцами ДНК нельзя пользоваться никакими приспособлениями, содержащими металлические детали, в частности из нержавеющей стали, а также шпателями и бритвенными лезвиями. ДНК прочно связывается со многими бивалентными металлами и контакт с ними обычно приводит к появлению разрывов в молекуле ДНК.

2. Приготовление вставок с образцами ДНК простейших

Свободно живущие простейшие могут быть прямо использованы для приготовления вставок с препаратами ДНК. Их можно отделить от культуральной среды центрифугированием. Перед приготовлением вставок внутриклеточных паразитов выделяют из клеток крови или других хозяйских клеток. Эритроциты можно лизировать, как указано в табл. 3. В некоторых случаях трипаносом выделяли из различных клеточных элементов с помощью ионно-обменной хроматографии на ДЕАЕ-носителе.

2.1 Выделение ДНК из культивируемых клеток и лимфоцитов

Процедуры получения ДНК из культивируемых клеток и из простейших имеют много общего. Для рестрикционного картирования необходимо использовать клеточные линии только с нормальным стабильным геномом. Например, клетки HeLa очень удобны для культивирования, но содержат большое количество хромосомных перестроек и имеют разную плоидность. Один миллион диплоидных клеток должен содержать примерно 6,6 мкг ДНК, что соответствует размерам генома 6х10 нуклеотидных пар. Поскольку несинхронизированные клеточные культуры обычно представляют собой смесь диплоидных, тетраплоидных и промежуточных состояний, мы используем для работы 1х10 клеток, считая, что они содержат примерно 10 мкг ДНК.

Процедуру, описанную в табл. 3, использовали также для получения интактных хромосом из различных клеточных линий насекомых. При этом концентрация клеток должна быть пересчитана в соответствии с меньшими размерами генома.

Методика выделения ДНК из лимфоцитов существенно близка используемой для культивируемых клеток, если лимфоциты свободны от примеси эритроцитов. Эритроциты могут быть или лизированы), или удалены с помощью центрифугирования в градиенте фиколла или перколла. Эти методы описаны в табл. 3.

2.2 Выделение ДНК из клеток прокариот

Методика выделения ДНК из клеток Е. coli представлена в табл. 4. Именно эта методика была с успехом использована для получения интактной хромосомной ДНК широкого набора бактерий и архебактерий, включая Salmonella, Legionella, Mycobacterium, Haemophilus, Bacillus, Streptomyces, Halobacterium и некоторые другие быстрорастущие, сопутствовавшие им. Размеры хромосом у этих бактерий варьируют в пределах от 1 до 20хЮ нуклеотидных пар, количество хромосом на одну клетку также может изменяться от 1 до 5 в зависимости от условий культивирования. Таким образом, в предварительные эксперименты необходимо включить подсчет клеток в широком диапазоне.

В некоторых случаях могут оказаться необходимыми небольшие изменения в методике. Например, в растворе Pett IV, когда его использовали для обработки Halobacterium, концентрацию NaCl пришлось увеличить до 0,5 М, чтобы предотвратить преждевременный лизис клеток.

Прием, описанный в табл. 4, предназначен для синхронизации репликативных вилок, которая достигается инкубацией клеток в хлорамфениколе в течение 1 ч непосредственно перед сбором. Обработка хлорамфениколом позволяет закончиться уже начатым репликативным процессам, но предотвращает запуск новых. Препараты ДНК можно получить и из несинхронизированных культур. Однако необходимо помнить, что области хромосом около точек конца репликации могут быть недопредставлены в некоторых препаратах. Иногда это не имеет значения, но не всегда. Так, например, интенсивность окрашивания бромидом этидия зависит от молекулярного веса. Таким образом, хромосомную ДНК из области терминации репликации будет непросто выявить с помощью этого соединения.

2.3 Выделение ДНК из клеток грибов

Мы предлагаем две методики для дрожжей. Первая из них предназначена для Saccharomyces cerevisiae, а вторая – для делящихся клеток Schlzosaccharomyces pombe. В обоих случаях для удаления клеточной стенки и приготовления сферопластов используется зимолиаза 100 Т. Получить сферо-пласты из 5. pombe более трудно. В этом случае мы рекомендуем контролировать процесс лизирования под микроскопом.

Другие представители грибов могут иметь иные, нежели дрожжи, компоненты клеточной стенки. В этом случае полезно вспомнить, что существуют разнообразные зимолиазы, отличающиеся друг от друга по своей специфичности и активности. В каждом конкретном случае можно подобрать подходящий фермент. К сожалению, в этих ферментах присутствует большое количество примесных нуклеаз, которые препятствуют получению больших фрагментов ДНК. Препарат «Новозин», выпускаемый фирмой Novo Bio Labs, является смесью ферментов, воздействующих на клеточную стенку самых разных грибов. Мы так и не решились использовать этот препарат; нас смутил его коричневый цвет. Вероятно, необходима более тщательная очистка.

2.4 Выделение ДНК из растительных клеток

Усилия многих исследователей направлены'сейчас на разработку методов получения интактных хромосомных ДНК из солидных тканей. Предварительные эксперименты с плоскими червями, Caenorhabditis elegans, личинками Drosophila и с Chlamy-domotias продемонстрировали возможность использования различных приемов. Для небольших многоклеточных организмов могут пригодиться методы, применяемые для одноклеточных. Для предотвращения выхода подвижных клеток за пределы вставок полезна обработка раствором 0,2 мМ азида натрия. ДНК с большим молекулярным весом удается получить при обработке коллагеназами, гомогенизировании, трипсинизации или просто разрезании материала, помещенного в раствор ESP. Можно вначале выделить из клеток ядра, а затем из них приготовить вставки с образцами.

3. Работа с агарозными блок-вставками, содержащими образцы ДНК

Для многих целей удобнее и проще иметь дело с ДНК, заключенными в агарозный гель, чем находящимися в растворе. Низкомолекулярные компоненты свободно диффундируют через агарозу при мягком перемешивании. Мы работали с 100 мкл-агарозными блок-вставками просто как с жидкими образцами объемом 100 мкл.

Возможность обрабатывать ДНК ферментами непосредственно в агарозе зависит от типа агарозы. По крайней мере, половина партий агарозы содержит примеси, которые не позволяют ферментам эффективно работать. Компания FMC выпускает агарозу с низкой температурой плавления, специально проверенную на пригодность к рестрикционной обработке заключенных в нее молекул ДНК.

3.1 Ферментативная обработка

Для ферментативной обработки ДНК, содержащейся в блок-вставке, необходимо предварительно инактивировать протеинкиназу К, оставшуюся после приготовления образца, и убрать диализом ЭДТА и детергенты. Протеиназа К весьма устойчивый фермент и может оставаться активной в растворе ESP при 4°С по крайней мере 1 год. Однако она полностью инактивируется при обработке фенилметилсульфонилфторидом, который крайне нестабилен и свежий раствор, которого поэтому надо добавлять ежедневно. Любая остающаяся во вставке протеиназа К разрушит вносимые ферменты. Необходима чрезвычайная аккуратность, чтобы не загрязнять лабораторный стол и используемое оборудование протеиназой К. В правильно выбранной агарозе эффективными будут если не все, то большинство рестриктаз. Когда рестриктазы не активны в агарозе, они, как правило, не проявляют активность и в растворе. Обычно мы используем соотношение фермент: ДНК, равное 20: 1. В большинстве случаев это соответствует по крайней мере 10-кратному превышению над реально необходимым количеством фермента. Наш опыт, основанный на использовании ДНК и рестриктаз из различных источников, а также опыт других исследователей подсказывает, что именно такой подход гарантирует полноту рестрикции. В случае низкой концентрации ДНК, особенно при работе с бактериями, может оказаться необходимым повысить концентрацию рестриктаз. Для частичного рестриктазного гидролиза необходимо титровать отдельные рестриктазы, добавляя различное их количество к вставкам с образцами ДНК и инкубируя в течение 2,5 ч.