НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ. О.В. ПАЛЛАДІНА НАН УКРАЇНИ

ШИМАНСЬКИЙ ІГОР ОЛЕКСАНДРОВИЧ

УДК 612.82+577.164.15+616-03

МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ

РЕАЛІЗАЦІЇ НЕЙРОТРОПНОЇ ДІЇ ВІТАМІНУ РР

ТА ЙОГО БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ ПОХІДНИХ

03.00.04 – Біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України Донченко Георгій Вікторович, завідувач відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Цудзевич Борис Олександрович, старший науковий співробітник лабораторії фізико-хімічної біології Київського національного університету імені Тараса Шевченка;

доктор медичних наук, професор Мхітарян Лаура Сократівна, керівник відділу біохімії ННЦ “Інститут кардіології ім. М.Д. Стражеска” АМН України.

Захист відбудеться “ 17 ” березня 2008 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 при Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: м. Київ, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат розісланий “ 15 ” лютого 2008 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В. Кірсенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Новий інтерес до вітаміну РР, пов’язаний з можливістю його ефективного застосування у неврологічній практиці [Stevens M.J. et al, 2007], обумовлює доцільність подальшого з’ясування конкретних механізмів біологічної дії вітаміну за різних функціональних станів нервової системи. Нині цілком очевидно, що більшість функцій вітаміну РР реалізується у клітинах через його нуклеотидні похідні, зокрема NAD+ та NADP+ [Maiese K., Chong Z., 2003]. Хоча NAD+ упродовж багатьох десятиліть і був відомий лише як основний акцептор гідрид-іонів у метаболічних реакціях оксидоредукції [Magni G. et al, 1999], останнім часом все більшу увагу привертає його регуляторна роль. Так показано, що NAD+ є субстратом у таких важливих клітинних регуляторних процесах, як ковалентна модифікація білкових молекул (моно та полі-ADP-рибозилювання) [Ame J.C. et al, 2004], реакції деацетилювання гістонів за участю Sir2, нещодавно відкритого класу ферментів, які беруть участь у регуляції “генного сайленсингу” [Yu S.W. et al, 2002]. Поряд з цим, NAD+ та NADP+ необхідні для синтезу відповідно циклічної ADP-рибози та NAADP+ – важливих медіаторів кальцієвих сигнальних шляхів [Guse A.H., 2005]. Порушення у будь-якому з цих процесів потенційно може спричинювати дисфункції клітин, призводячи до підвищення ризику розвитку нейродегенеративних захворювань.

Нейротропні ефекти вітаміну РР за нормальних фізіологічних умов та за розвитку деяких патологічних станів нервової системи можуть здійснюватись, принаймні частково, на рівні регуляції процесів синаптичної передачі, опосередкованих NAD+. У синаптичних мембранах головного мозку щурів виявлено існування NAD-модуляторної системи, фізіологічне значення якої полягає у спряженні специфічного зв’язування NAD+ синаптичними мембранами з процесом їхньої деполяризації, що індукує вивільненням нейромедіаторів із нервових закінчень [Халмурадов А.Г. и др., 1983]. Молекулярний механізм такого спряження не виключає можливості залучення мембранних систем транспортування катіонів та деяких компонентів основних шляхів клітинної сигналізації. З огляду на це, актуальною є оцінка можливості функціональної взаємодії NAD-модуляторної системи з системами транспортування катіонів та сигнальної трансдукції. Дослідження молекулярних механізмів некоферментної дії NAD+ на синаптичні закінчення, що реалізуються через специфічну рецепцію нуклеотиду NAD-зв’язувальним білком синаптичних мембран, дозволить розширити уявлення щодо механізмів нейротропної дії вітаміну РР.

У контексті з’ясування молекулярних механізмів, які лежать в основі некоферментної функції вітаміну РР, велике значення має вивчення NAD-модуляторної системи синаптичних закінчень за різних функціональних станів нервової системи. Відомо, що дефіцит вітаміну РР та піридинових нуклеотидів або порушення у їх обміні можуть викликати селективну нейродегенерацію внаслідок патогенетичних змін окисно-відновних процесів та регуляторних функцій в нервових клітинах насамперед тих, що залучені до контролювання синаптичної активності. Раніше показано, що NAD-зв’язувальний білок бере участь у реалізації нейротропної дії вітаміну РР за експериментальних РР-гіповітамінозу, епілепсії та хвороби Паркінсона [Фоменко А.И. и др., 1997; Кучмеровська Т.М., 1998]. Не достатньо з’ясованими, однак, залишаються питання, наскільки у патогенезі різних захворювань нервової системи зміни в ключових NAD+-залежних регуляторних процесах, зокрема моно та полі-ADP-рибозилюванні білків, впливають на NAD-рецепцію та процеси нейротрансмісії та якою мірою вітамін РР може залучатись до регуляції зазначених процесів.

Для більш глибокого розкриття конкретних біохімічних механізмів, відповідальних за нейротропну дію вітаміну РР та його похідних у функціонуванні збудливих клітин, нами проведено дослідження на експериментальній моделі цукрового діабету 1 типу (ЦД1). Оцінка характеру порушень NAD-модуляторної системи у взаємозв’язку з рівнем нікотинамідних динуклеотидів головного мозку, деякими NAD-утилізуючими та NAD-генеруючими процесами, а також функціональним станом серотонінергічної системи є актуальною та сприятиме як з’ясуванню патогенетичного значення змін NAD-модуляторної системи за діабетичної невропатії, так і, в цілому, кращому розумінню її біологічної ролі у функціонуванні синаптичних закінчень та у механізмі нейротропної дії вітаміну РР.

Мета та завдання роботи. Метою роботи було дослідження молекулярних механізмів участі NAD+ у функціонуванні NAD-модуляторної системи головного мозку щурів та механізмів нейротропної дії вітаміну РР і його біоактивних похідних за експериментального цукрового діабету 1 типу. Відповідно до поставленої мети в роботі вирішувались наступні завдання:

1. Дослідити молекулярні механізми нейромодуляторної дії NAD+ на синаптосомальній моделі:

- З’ясувати роль іонних каналів при NAD-індукованій деполяризації синаптичних мембран головного мозку щурів;

- Вивчити вплив NAD+ на активність Na+,К+-АТPази синаптосом та синаптичних мембран головного мозку;

- Оцінити можливість існування функціонального взаємозв’язку NAD-модуляторної системи з компонентами ключових систем внутрішньоклітинної сигналізації у нервових закінченнях;

- У порівняльному аспекті дослідити концентраційнозалежні ефекти нікотинаміду (NAm) та NAD+ на трансмембранний цитоплазматичний потенціал нервових закінчень та вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку.

2. Вивчити функціональний стан NAD-модуляторної системи за експериментального ЦД1 та за умов введення нікотинаміду.

3. Дослідити роль сигнального шляху Gs-білок/cAMP/PKA пресинаптичних закінчень у модуляції синаптичної активності за цукрового діабету та у механізмі нейротропної дії вітаміну РР та його похідних.

Об’єкт дослідження: процеси модуляції синаптичної активності за різних функціональних станів нервової системи та у механізмі реалізації нейротропної дії вітаміну РР і його похідних.

Предмет дослідження – поглинання та вивільнення нейромедіаторів ізольованими синаптичними закінченнями, генерування мембранного потенціалу, стан системи антиоксидантного захисту та пероксидне окислення ліпідів, підтримання структурно-функціональної цілісності геному у нервовій системі нормальних і діабетичних щурів та за введення сполук з РР-вітамінною активністю.

Методи дослідження: виходячи з основних задач дослідження, проведено експериментальне моделювання цукрового діабету 1 типу та інтенсифікації біосинтезу NAD+ в організмі, використано біохімічні (методи ензимології, препаративної біохімії, біокінетики), біофізичні методи, методи радіорецепторного аналізу та статистично-математичні.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана дисертаційна робота є частиною фундаментальних досліджень відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за темами “Дослідження механізмів реалізації біологічної дії вітамінів, коферментів та їх специфічних білків-акцепторів в регуляції метаболізму спеціалізованих клітин” (1997-2001); “Вивчення механізмів функціональної взаємодії вітамінів А, С, Д, РР, В1 та Q в організмі тварин в нормі та за умов деяких патологій” (2002-2006); “Дослідження молекулярних механізмів реалізації біологічної ролі вітамінів, коферментів та їхніх білків-акцепторів у забезпеченні функціонування та життєздатності клітин за норми та за умов деяких патологій” (2007-2011).

Наукова новизна одержаних результатів. Результати досліджень, проведених на моделі синаптосом, поглиблюють розуміння конкретних молекулярних механізмів секретогенної дії NAD+. Вперше встановлено, що деполяризація синаптичних мембран та стимулювальний вплив динуклеотиду на процес вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку опосередковуються активацією сигнальних шляхів протеїнкінази С та/або А і реалізуються через інгібування активності Na+,K+-АТPази за неконкурентним механізмом та активацію потенціалкерованих натрієвих каналів. Показано, що нейротропна дія нікотинаміду на рівні синаптичних закінчень у концентраціях, наближених до фізіологічних, найімовірніше здійснюється не прямо, а опосередковано через NAD+.

Отримані дані розкривають конкретні патогенетичні механізми розвитку діабетичної невропатії та свідчать про важливу роль порушень NAD-модуляторної системи в розвитку дисфункцій головного мозку за ЦД1. Вперше показано, що зростання специфічного зв’язування NAD+ синаптичними мембранами за цукрового діабету корелює з підвищенням як спонтанного, так і індукованого деполяризуючими агентами вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку, але спостерігається зниження вивільнення медіатору у відповідь на дію екзогенного NAD+. При цьому виявлено, що не існує прямої залежності між рівнем NAD+ у головному мозку та його зв’язуванням синаптичними мембранами.

Результати проведених досліджень свідчать про опосередкований полі-АDP-рибозополімеразою (Parp) механізм порушення біодоступності NAD+ при розвитку дисфункцій головного мозку за ЦД1. Зокрема, вперше продемонстровано можливий зв’язок між зростанням активності цього NAD-залежного ферменту у клітинних ядрах та зниженням вмісту динуклеотиду у головному мозку діабетичних щурів, що пов’язано з репарацією розривів ДНК в умовах виявленої інтенсифікації за діабету пероксидокислювальних та вільнорадикальних процесів. Вперше встановлено, що посилення моно-ADP-рибозилювання Gs-білків та активація сигнального шляху cAMP/протеїнкіназа A, принаймні частково, може бути ендогенним сигналом, який сприяє підвищенню вивільнення нейромедіаторів за цукрового діабету.

Механізм позитивної нейротропної дії за діабету нікотинаміду та нікотиноїл-ГАМК, введених у терапевтичних дозах, включає нормалізуючий ефект цих сполук на рівень NAD+ і специфічне зв’язування динуклеотиду синаптичними мембранами головного мозку, що корелює з нормалізацією процесів зворотного поглинання та вивільнення серотоніну ізольованими синаптичними закінченнями. Здатність вітаміну РР і його похідного ефективно коригувати NAD-опосередковані мембранні процеси за експериментальної діабетичної невропатії, принаймні частково, є результатом антиоксидантної дії цих сполук та інгібування процесів моно- і полі-АDP-рибозилювання білків.

Практичне значення одержаних результатів. Позитивна нейротропна дія вітаміну РР та його похідних, яка на рівні контролю синаптичної активності реалізуються опосередковано через NAD-зв’язувальний білок синаптичних мембран, обумовлює можливість та доцільність їх застосування з метою нормалізації специфічних нейрохімічних процесів у синаптичних закінченнях та забезпечення ефективної нейропередачі за діабетичної невропатії. Крім цього, продемонстровано можливість успішного використання нікотинаміду та нікотиноїл-ГАМК у фармакологічних дозах як інгібіторів загального ADP-рибозилювання та сполук з антисорбітоловими та антиоксидантними властивостями у лікуванні даного захворювання. Результати проведених досліджень також підтверджують, що порушення процесів рецепції NAD+ синаптичними мембранами та його нейромодуляторної дії можуть бути спільним проявом розвитку різних захворювань центральної нервової системи.

В цілому, проведені дослідження розширюють уявлення щодо механізмів біологічної дії вітаміну РР та нікотиноїл-ГАМК у головному мозку та складають теоретичне підґрунтя для подальшого вивчення досліджуваних сполук та інших біоактивних похідних на їх основі як препаратів, що використовуються з метою цілеспрямованої фармакологічної корекції порушень функціонування ЦНС за діабетичної невропатії та інших патологій нервової системи.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто підібрано та критично проаналізовано великий обсяг сучасної вітчизняної та зарубіжної літератури за темою запланованого наукового дослідження. Дисертантом розроблено конкретні схеми вирішення поставлених завдань, інтерпретовано отримані результати, підготовлено до друку публікації. Експериментальна частина роботи виконана особисто здобувачем. Аналіз та обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником – зав. відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, член-кор. НАН України, д.б.н., проф. Донченко Г.В. та пров. науков. співр. відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна, д.б.н. Кучмеровською Т.М.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на VI з’їзді ендокринологів України (2001, Київ); VI міжнародній конференції “Биоантиоксидант” (2002, Москва); VIII Українському біохімічному з’їзді (2002, Чернівці); Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); V Парнасівській конференції (2005, Київ); міжнародній конференції “Рецепция и внутриклеточная сигнализация” (2005, Пущино, Росія); II Європейському Конгресі з фармакології (1999, Угорщина); V Всесвітньому Конгресі IBRO з нейронаук (1999, Єрусалим, Ізраїль); IX, XI, XII Конгресах “NEURODIAB Diabetic Neuropathy” Європейської Асоціації з Вивчення Діабету, EASD (1999, Маастріхт, Нідерланди; 2001, Абердін, Шотландія; 2002, Балатонфюред, Угорщина;); III об’єднаному З’їзді DFSG (група з вивчення діабетичної стопи) та NEURODIAB (2004, Регенсбург, Німеччина); 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43-му Щорічних Конгресах Європейської Асоціації з Вивчення Діабету (1999, Брюссель, Бельгія; 2000, Єрусалим, Ізраїль; 2001, Глазго, Великобританія; 2002, Будапешт, Угорщина; 2004, Мюнхен, Німеччина; 2005, Афіни, Греція; 2006, Копенгаген-Мальмо, Данія-Швеція; 2007, Амстердам, Нідерланди); 19-му Всесвітньому Діабетичному Конгресі (2006, Кейптаун, Південна Африка).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових праць, з яких 6 - статті у фахових наукових виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів, результатів та їх обговорення, заключної частини, висновків та списку використаних джерел, який містить 330 посилань. Робота викладена на 166 сторінках друкованого тексту та проілюстрована 11 таблицями та 29 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Розглянуто некоферментні функцій вітаміну РР та його біологічно активних похідних у забезпеченні процесів життєдіяльності клітин; проведено аналіз сучасних уявлень про значення вітаміну РР та його похідних за різних функціональних станів центральної нервової системи; особливу увагу приділено нейрохімічним порушенням за цукрового діабету та висвітлено можливу роль вітаміну РР у їхній корекції.

Матеріали та методи дослідження. Експерименти проводили на щурах-самцях лінії Вістар вагою 130-160 г, яких утримували в стандартних умовах віварію при відповідному освітленні та годуванні ad libitum.

Експериментальний цукровий діабет 1 типу у щурів викликали одноразовим введення стрептозотоцину ("Sigma") з розрахунку 70 мг/кг маси тіла внутрішньоочеревинно (Chatfopadhyay S. et al, 1997). Розвиток діабету контролювали за зростанням рівня глюкози крові, яку визначали глюкозооксидазним методом (Marks V., 1963). В експериментах використовували тварин через 4 тижні після індукції діабету з рівнем глюкози 14,5-16,5 ммоль/л, у яких, за даними літератури, розвивається діабетична невропатія. Тваринам вводили NAm або нікотиноїл-ГАМК (N-ГАМК) щоденно в дозі 20, 100 та 200 мг/кг маси тіла, внутрішньоочеревинно, упродовж 7-14 діб.

Модель інтенсифікації біосинтезу NAD+ в організмі створювали: а/ введенням тваринам NAm та/або N-ГАМК на 6 годин або упродовж 2 тижнів по 20, 100 або 200 мг на кг маси тіла; б/ введенням NAm за 6 годин до забою у дозі 500 мг на кг маси тіла (Чаговець Р.В. та інш., 1977).

Синаптосоми та синаптичні мембрани головного мозку виділяли методом диференційного центрифугування в градієнті густини сахарози за методом Abita J. et al. (1977). В основу процедури виділення ядер клітин головного мозку було покладено метод, розроблений Blobel G. et al. (1966).

У кислотних екстрактах головного мозку, які одержували при його обробці 0,6 н HClO4 (при температурі 0-4оС), визначали вміст NAD+, NADP+, ATP та сорбітолу ферментативними методами (Bergmeyer H.U., 1974).

Специфічне зв’язування [U-14C]NAD+ (питома активність 269 мКи/ммоль, "Amersham", Англія) синаптичними мембранами головного мозку щурів визначали радіолігандним методом (Варфоломеев С.Д. и др., 1982) як різницю між загальним (кінцева концентрація [U-14C]NAD+ 0,32 мкМ) та неспецифічним зв’язуванням у присутності 1000-кратного надлишку неміченого динуклеотиду.

Зворотне поглинання [2-14C]серотоніну (57 мКи/ммоль, "Amersham"), вивчали в інкубаційному середовищі об’ємом 1 мл, що містило 100 мМ Na – фосфатний буфер, рН 7,4; 120 мМ NaCl; 5 мМ КСl; 1 мM CaCl2; 1 мM MgCl2; 0,5 мM Na2HPO4; 10 мМ глюкозу; 10 мкМ іпроніазид (Gandhi V.C., 1990). До інкубаційного середовища вносили 0,5 мг білка синаптосом та преінкубували 5 хв при 37oC. Після цього додавали мічений серотонін, кінцева концентрація якого становила 1,48 мкмоль/л. Після закінчення інкубації (10 хвилин за температури 370 С) проби швидко фільтрували через фільтри GF/C "Whatman" та промивали 15 мл 0,1 М фосфатного буферу. Поглинену синаптосомами радіоактивність на висушених фільтрах підраховували у РС-101 на рідинно-сцинтиляційному спектрометрі SL-30 ("Intertechnique", Франція).

Для визначення вивільнення [2-14C]серотоніну фільтри з навантаженими міченим серотоніном синаптосомами поміщали у перфузійні камери, приєднані до перистальтичного насосу і промивали 6 мл інкубаційного середовища (в яке вносили досліджувані агенти) зі швидкістю 1,0 мл/хв. Фракції з радіоактивністю, що вивільнилась, збирали кожної хвилини упродовж 6 хв і підраховували радіоактивність в сцинтиляційній рідині РС-103.

Мембранний потенціал вимірювали за поглинанням ліпофільного катіону тетра[3Н]фенілфосфонію броміду ([3H]ТФФ+, 20 Ки/ммоль, "Amersham") синаптосомами головного мозку щурів (Pauwels P.J., 1986). Кінцева концентрація катіону становила 2,5 нмоль/л. Величину потенціалу розраховували як різницю поглинання [3H]ТФФ+ синаптосомами головного мозку за високої (1) та низької (2) концентрації K+, використовуючи рівняння Нернста: Е = ─ 26,7ln[3H]ТФФ1+/[3H]ТФФ2+, де [3H]ТФФ1+ та [3H]ТФФ2+ - радіоактивність на фільтрах після інкубування синаптосом у середовищі 1 та 2. За умов проведених експериментів величина Е дорівнювала 0 при концентрації KCl 120ммоль/л.

Активність Na+,K+-АТPази (АТР: фосфогідролаза 3.6.1.3) визначали за утворенням неорганічного фосфату як різницю між сумарною активністю АТРаз та активністю Ca2+,Mg2+-АТФази (у присутності 0,1 мМ уабаїну) (Rathbun P.J., 1969).

Про активність полі-ADP-рибозополімерази (NAD+: полі(аденін-дифосфат-D-рибозил)-акцептор-ADP-D-рибозилтрансфераза 2.4.2.30) судили за кількістю радіоактивно мічених ADP-рибозильних фрагментів NAD+, включених до загальних ядерних білків клітин головного мозку щурів, за методом Tanigawa Y. et al., 1977. Рівень базального та індукованого холерним токсином (2 мкг преактивованого у 20 мМ дитіотрейтолі токсину на 1 мг білка синаптосом) моно-ADP-рибозилювання синаптосомальних білків оцінювали за включенням [U-14C]ADP-рибозильних фрагментів NAD+ до синаптосомальних білків (Qian Z. et al., 1983).

Інтенсивність процесів ПОЛ оцінювали за рівнем дієнових кон’югатів (Тимирбулатов Р.А., 1983) та ТБК-активних продуктів (Тимирбулатов Р.А., 1981). При визначенні вмісту дієнових кон’югатів у гомогенаті мозку, їх екстрагували у гептан-ізопропаноловій суміші та вимірювали оптичну густину гептанового шару (l = 233). Вміст ТБК-активних продуктів визначали спектрофотометрично за їх реакцією з тіобарбітуровою кислотою. Ступінь пошкодження ДНК визначали спектрофотометрично за (Ходарев Н.Н. и др., 1981).

Результати досліджень оброблялись статистично з використанням t-критерію Стьюдента.

Результати досліджень та їх обговорення

1. Молекулярні механізми нейромодуляторної дії NAD+ у нервових закінченнях. Мембранні системи пасивного та активного іонного транспорту, визначаючи проникність мембрани для іонів за деполяризації як необхідної передумови нейросекреції, можуть бути залучені до механізму NAD-індукованого вивільнення медіаторів. З огляду на це досліджували роль потенціалкерованих Na-каналів та Na+,K+-АТPази синаптичних мембран у прояві нейромодуляторних ефектів NAD+, використовуючи нейротоксини, дія яких на канальні структури збудливих мембран добре відома, а також інгібітор Na+,K+-АТPази – уабаїн.

Рис. 1. Вивільнення [2-14С]серотоніну синаптосомами головного мозку щурів при дії нейротоксинів та NAD+ (1мкМ), M±m, n=5-7; Примітка: абсолютну величину вивільнення в контролі (К) – 17,3 ± 0,85 пмоль/0,2 мг білка прийнято за 100 ± 4,3 %

Показано, що при внесенні у середовище інкубування синаптосом головного мозку щурів тетродотоксину (ТТХ) - специфічного блокатору потенціалчутливих Na-каналів - вивільнення [2-14C]серотоніну синаптосомами під дією NAD+ (1 мкМ) суттєво знижувалось (рис. 1). Блокувальний ефект ТТХ на NAD-індуковане

вивільнення медіатору свідчить про активацію саме потенціалчутливих Na-каналів у механізмі реалізації нейромодуляторних ефектів NAD+. На тлі дії активатору Na-каналів вератридину (VTD) або латротоксину (LTX, формує канали з широкою селективністю до одно та двохвалентних катіонів), які стимулювали вивільнення серотоніну на 70 та 120 % відповідно, істотні ефекти NAD+ відсутні (рис. 1). Вірогідно, модифікація під впливом досліджуваних токсинів канальних іонотранспортувальних структур призводить до швидкого виснаження екзосекреторної активності синаптосом, внаслідок чого NAD+ не спроможний додатково стимулювати процес вивільнення нейромедіатору.

Рис. 2. Вплив in vitro NAD+ та нікотинаміду (10-3,10-5,10-6 М) на мембранний потенціал (а) синаптичних закінчень мозку щурів (К – контроль; А – аденозин, 10-6 М; ● - NAm; □ – NAD+) та вивільнення [2-14С]серотоніну синаптосомами (б, контроль - 100%), M ± m, n=5

Це не виключає залучення пулу готових до вивільнення везикул у механізмі NAD-залежного вивільнення серотоніну. Внесення в інкубаційне середовище уабаїну призводило до 24 %-го підвищення рівня вивільнення [2-14С]серотоніну у порівнянні зі спонтанним. Додавання NAD+ у кількості, необхідній для створення його кінцевої концентрації 10-6 М, сприяло подальшому підвищенню вивільнення медіатору. Очевидно уабаїн, викликаючи помірну деполяризацію синаптичних мебран, залучає лише певну частину пулу готових до вивільнення везикул в даному активному секреторному процесі, що дозволяє динуклеотиду надалі стимулювати вивільнення нейромедіатору за механізмом екзоцитозу.

Дослідження залежності гідролізу АТР синаптосомальною Na+,K+-АТPазою від концентрації субстрату при одночасній дії NAD+ (1 мкМ) продемонструвало гальмівний ефект динуклеотиду на активність цього ферменту. Установлене інгібування відноситься до типу неконкурентного, адже воно не послаблювалось при підвищенні концентрації субстрату (1000-кратний надлишок). Показано також, що динуклеотид концентраційнозалежно (1 мМ – 0,1 мкМ) знижує активність Na+,K+-АТPази синаптосом, тоді як на рівні синаптичних мембран лише експозиція 1 мМ NAD+ призводить до 25 % інгібування активності. Одержані результати вказують на важливість субмембранних компонентів, які на відміну від очищених мембран може містити фракція синаптосом, для механізму NAD-індукованого гальмування активності Na+,K+-АТРази, що не виключає можливості опосередкованої модифікації Na+,K+-помпи певними протеїнкіназами функціонально асоційованими з NAD-зв’язувальним білком. Згідно з отриманими нами даними нейромодуляторна дія динуклеотиду, імовірно, може реалізуватись через активацію фосфорилювання ефекторних білків синаптичних закінчень під дією протеїнкінази С/А, з огляду на здатність Н7, інгібітору цих кіназ, блокувати ефекти NAD+ на вивільнення серотоніну.

Таблиця. Вміст нуклеотидів у головному мозку за діабетичної невропатії: ефект двохтижневого введення нікотинаміду та нікотиноїл-ГАМК, мкмоль на 1 г тканини (M ± m, n=6-8)

Передбачається, що нікотинамід може конкурувати за місця специфічного зв’язування NAD+ на синаптичних мембранах мозку щурів. Проте на сьогодні нема чіткої відповіді, яким є характер його нейромодуляторної дії in vitro. У зв’язку з цим у порівняльному аспекті вивчали ефекти NAD+ та NAm у синаптичних закінченнях з метою оцінки можливості залучення NAD+-зв’язувального білка синаптичних мембран до механізму реалізації нейротропної дії вітаміну РР. Як виявилось, ефекти NAm (0,001-1 мМ) на мембранний потенціал та вивільнення серотоніну є значно менш вираженими ніж при внесенні відповідних концентрацій NAD+ (рис. 2). Недостатня ефективність NAm у проведеному порівняльному дослідженні свідчить про те, що його нейротропна дія як попередника біосинтезу NAD+ можливо опосередкується нейромодуляторними ефектами динуклеотиду через NAD-зв’язувальний білок.

2. Специфічне зв’язування [U-14C]NAD+ синаптичними мембранами при цукровому діабеті 1 типу та за умов інтенсифікації біосинтезу NAD+. У ході роботи важливо було з’ясувати ті функціональні та біохімічні порушення у ЦНС, які можуть впливати на NAD-модуляторну систему за цукрового діабету 1 типу. Подібно до зниження внутрішньоклітинного вмісту нікотинамідних динуклеотидів як спільної патобіохімічної ознаки багатьох захворювань нервової системи [Maiese K. Chong Z.Z., 2003; Skaper S.D., 2003], за діабету також виявлено зниження рівня NAD+ у головному мозку (на 30 %), таблиця. Очевидно, що дефіцит NAD+ не пов’язаний з посиленням фосфорилювання динуклеотиду, так як вміст NADP+ був також знижений на 23 %. Установлені за ЦД1 зміни у забезпеченості мозку нікотинамідними динуклеотидами можна цілком

Рис. 3. Активність полі-ADP-рибозополімерази у ядрах клітин головного мозку щурів за введення нікотинаміду та N-ГАМК (мкмоль інкорпорованої [U-14C]ADP-рибози*10-5/хв на мг білка, M ± m, n = 8-10)

пояснити виявленим посиленим використанням NAD+ як субстрату у процесах полі-АDP-рибозилювання ядерних білків в ході репарації ДНК. Продемонстровано більш ніж 20 % підвищення активності ядерної полі-АDP-рибозополімерази за діабету у порівнянні з контролем (рис. 3). Це відбувається одночасно з інтенсифікацією вільнорадикальних процесів у ЦНС, про що свідчить акумулювання у мозку первинних та кінцевих продуктів ліпопероксидації - відповідно дієнових кон’югатів (не наведено) та ТБК-активних продуктів (рис. 4). Не виключено, що одним з фізіологічно небезпечних наслідків виснаження внутрішньоклітинного пулу NAD+, обумовленого інтенсифікацією NAD-залежного полі-ADP-рибозилювання ядерних білків, можна вважати паралельно встановлену за діабету нестачу ATP у мозку (таблиця).

Як видно з результатів дослідження, представлених на рис. 5 та 6, на тлі зниженого вмісту NAD+ за діабету має місце істотне, на 51 %, підвищення його специфічного зв’язування синаптичними мембранами у порівнянні з контролем, що здійснюється за рахунок підвищення кількості місць зв’язування NAD+ без зміни спорідненості білка-рецептора до нуклеотиду. Величина високоафінної компоненти зв’язування у контролі становить Кд = 0,33 мкМ (рис. 5).

Рис. 4. Вміст ТБК-активних продуктів у гомогенатах головного мозку щурів за введення нікотинаміду

Для оцінки залежності рецепції NAD+ від забезпеченості мозку нікотинамідними нуклеотидами у порівняльному аспекті досліджували короткотривалі (6 годин – час, за який досягається максимум біосинтезу динуклеотидів) та довготривалі (2 тижні) ефекти низької (20 мг/кг маси тіла) та високої (200 мг/кг) доз NAm та N-ГАМК за ЦД1. З’ясовано, що досліджувані сполуки у використаних дозах як за короткотривалого, так і за довготривалого введення приблизно однаково ефективно впливали на вміст NAD+, фактично повертаючи його до рівня контролю. Однак, прямої залежності між вмістом NAD+ та його рецепцією синаптичними мембранами за різної забезпеченості нервової системи цим динуклеотидом ми не виявили. Отримані результати засвідчили відсутність будь-яких суттєвих ефектів сполук у досліджуваних дозах на зв’язування NAD+ синаптичними мембранами за їх короткотривалої дії. Досягнення фармакологічного ефекту вітаміну РР на відновлення рецепції NAD+ потребувало хронічного введення його високих доз (рис. 6), що поряд з можливістю безпосередньої взаємодії NAm з NAD-зв’язувальним білком, фактично свідчить про залучення механізмів більш опосередкованої та віддаленої у часі дії вітаміну на нейрохімічні процеси у нервових клітинах, які можуть бути пов’язані зі встановленими антиоксидантними властивостями NAm та N-ГАМК (рис. 4), а також з їх роллю як інгібіторів полі-АDР-рибозилювання білків (рис. 3).

Рис. 5. Зв’язування [U-14C]NAD+ синаптичними мембранами в нормі та за умов діабету (A) та його графічний аналіз за Скетчардом (Б): 1-контроль; 2-діабет; 3- діабет + NAm (20 мг/кг), M ± m, n = 5

3. Стан серотонінергічної медіаторної системи за цукрового діабету та при введенні вітаміну РР. Оскільки з одного боку NAD+ та серотонін мають спільного попередника біосинтезу, триптофан, а з іншого – динуклеотид є модулятором серотонінергічної медіаторної системи, то виявлені зміни вмісту NAD+ у головному мозку та його рецепції синаптичними мембранами могли б призводити до змін у функціонуванні цієї нейромедіаторної системи. Установлено, що пов’язані з діабетом порушення синаптичної функції включають зростання рівня спонтанного вивільнення міченого серотоніну (рис. 7), що супроводжується зниженням електрохімічного градієнту іонів у синаптичних мембранах нервових закінчень.

Рис. 6. Зв’язування [U-14C]NAD+ синаптичними мембранами головного мозку щурів: 1 – контроль; 2 – діабет; 3 – діабет + NAm (20 мг/кг); 4 - діабет + NAm (200 мг/кг); 5 - діабет + N-ГАМК (200 мг/кг)

Деполяризація синаптосом KCl (25 мМ) або 4-амінопіридином (4-AP, 0,1 мМ) індукувала вдвічі більш істотне, на додаток до базального, вивільнення серотоніну за діабету у порівнянні з контролем (рис. 7б). При цьому вивільнений серотонін в обох випадках, імовірно, походить з одного і того ж везикульованого пулу медіатору. Підвищена відповідь синаптосом на дію деполяризаторів за цукрового діабету узгоджується з можливістю посилення за патології ендогенного фосфорилювання певних ефекторних білків апарату екзоцитозу (Shoji-Kasai Y. et al, 2002). Як введення NAm, так і N-ГАМК призводило до часткової нормалізації процесів зворотного поглинання та вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку, але при цьому дія NAm була більш вираженою.

Рис. 7. Вивільнення [2-14C]серотоніну синаптосомами головного мозку (а) за дії екзогенного NAD+ (1 мкМ); (б) 4-амінопіридину та KCl: 1 – відповідний контроль; 2 – 4-АР (0,1 мМ); 3 – KCl (15 мМ), M ± m, n = 10-12

Доказом того, що індуковані цукровим діабетом порушення у функціонуванні центральних нейромедіаторних систем можуть включати зміни у нейромодуляторних процесах за участю NAD+ є те, що екзогенно доданий до суспензії навантажених [2-14С]серотоніном синаптосом головного мозку діабетичних щурів NAD+ (1 мкМ) виявився не здатним у порівнянні з контролем істотно стимулювати вивільнення медіатору (рис. 7а). Отже, загальні зміни вмісту NAD+ у клітинах мозку та порушення процесу його специфічного зв’язування за діабету, напевно, негативно позначаються на ефективності механізму функціонального спряження рецепторної та/або трансдукуючої/ефекторної ланки у клітинному сигналингу NAD+. Відновлення зв’язування супроводжувалось нормалізацією відповіді синаптосом на нейромодуляторну дію екзогенного NAD+ у групі тих діабетичних тварин, які отримували нікотинамід у дозі 200 мг/кг маси тіла.

4. Роль сигнального шляху Gs-білок/cAMP/протеїнкіназа А та процесів моно-ADP-рибозилювання синаптосомальних білків у вивільненні серотоніну за ЦД1 та при введенні вітаміну РР. Передача сигнальної інформації через NAD-зв’язувальний білок та нейрохімічні ефекти вітаміну РР і його біологічно активних похідних за умов ЦД1 можуть здійснюватись на рівні процесів, які пов’язані зі складною регуляцією синаптичної функції із залученням різних типів посттрансляційної модифікації функціонально важливих білкових молекул. Нами встановлено можливу патогенетичну роль активації сигнального шляху cAMP/протеїнкіназа А та PKA-залежного фосфорилювання у порушенні вивільнення серотоніну за цукрового діабету, так як H89, специфічний інгібітор PKA, знижує in vitro вивільнення [2-14С]серотоніну синаптосомами головного мозку діабетичних щурів (рис. 8).

Рис. 8. Спонтанне вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку щурів за умов інгібування сАМР-залежної протеїнкінази in vitro: 1 – контрольні щури; 2 – діабетичні щури; 3 – діабетичні щури, яким вводили нікотинамід (М ± m, n = 4-6)

Дія інгібітору РКА за двохтижневого введення NAm у дозі 200 мг/кг маси тіла нагадує його ефекти у недіабатичному контролі, що вказує на гальмування ендогенного фосфорилювання білків у механізмі нормалізації вивільнення серотоніну при введенні досліджуваної сполуки за ЦД1. У контексті вивільнення нейромедіаторів у літературі найдетальніше описано значення модифікації синаптичних білків саме шляхом фосфорилювання. Останнім часом з’являється дедалі більше даних стосовно його зв’язку з ендогенним моно-ADP-рибозилюванням білків, яке, імовірно, відіграє подібну роль [Ying W., 2006; Tsuyama S. et al, 1999]. Тому досліджували можливі зміни моно-ADP-рибозилювання неядерних білків у взаємозв’язку з дисфункціями мозку, асоційованими з діабетом. Отримані нами результати свідчать, що рівень конститутивного моно-ADP-рибозилювання синаптосомальних білків за діабету вищий на 34 % у порівнянні з контролем (рис. 9).

Рис. 9. Базальне та індуковане холерним токсином (СТХ) моно-ADP-рибозилювання білків синаптичних закінчень in vitro: 1 – контрольні щури; 2 – контрольні щури + СТХ; 3 – діабетичні щури; 4 – діабетичні щури + CTX; 5 – діабетичні щури, яким вводили NAm; 6 – діабетичні щури, яким вводили NAm + СТХ (М ± m, n = 6)

Після преінкубації з міченим NAD+ оцінювали індуковане холерним токсином специфічне моно-ADP-рибозилювання стимуляторної a-субодиниці G-білків, позитивно спряжених з аденілатциклазою. Незважаючи на виявлену більш високу ефективність холерного токсину на вивільнення серотоніну синаптосомами діабетичних тварин, викликане ним підвищення загального моно-ADP-рибозилювання було нижчим у порівнянні з контролем (рис. 9). Недостатня ефективність токсину за діабету може пояснюватись тим, що моно-ADP-рибозилювання його білкових мішеней частково досягається внаслідок активації певних ендогенних моно-ADP-рибозилтрансфераз, які конкурують з холерним токсином за спільний субстрат – стимуляторну a-субодиницю G-білків.

Таким чином, наведені результати засвідчують порушення Gs/cAMP/PKA-залежних механізмів контролю синаптичної функції за цукрового діабету. Підвищення рівня моно-ADP-рибозилювання, принаймні частково, може бути тим ендогенним механізмом, що активує опосередковані Gs-білками процеси фосфорилювання за діабету та може лежати в основі підвищеного як спонтанного, так і індукованого вивільнення серотоніну. Позитивна нейротропна дія NAm може реалізуватись через модуляцію досліджуваного сигнального шляху нервових закінчень шляхом інгібування процесів моно-ADP-рибозилювання білків.

В цілому, отримані дані підтверджують важливе фізіологічне значення специфічного зв’язування NAD+ синаптичними мембранами у функціонуванні серотонінергічної нейромедіаторної системи у нормі та за умов цукрового діабету. Механізм нейротропної дії вітаміну РР за ЦД1 полягає у нормалізації синаптичної активності на рівні NAD-модуляторної системи нервових закінчень, що може здійснюватись в результаті комбінації як прямих, так і опосередкованих через зниження інтенсивності оксидативного стресу та реакцій моно- і полі-ADP-рибозилювання білків ефектів вітаміну РР на цю систему.

ВИСНОВКИ

1. Приймаючи до уваги недостатню з’ясованість молекулярних механізмів біологічної, переважно некоферментної, дії вітаміну РР та його похідних у нервовій системі, проведені дослідження дозволили встановити важливу роль NAD-залежної модуляторної системи нервових закінчень та факторів, що визначають її функціонування, у контролюванні синаптичної активності за різних функціональних станів ЦНС.

2. Показано, що механізм нейромодуляторної дії NAD+ in vitro на процеси зворотного поглинання та вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку щурів пов’язаний з інгібуванням активності Na+,К+-АТРази та активацією потенціалкерованих натрієвих каналів. Продемонстровано можливість залучення сигнального шляху протеїнкінази C та аденілатциклазної системи до механізму реалізації нейромодуляторної дії NAD+.

3. Виявлено, що за за умов експериментальної діабетичної невропатії у відповідь на дію екзогенного NAD+ вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку знижується. Зростання специфічного зв’язування NAD+ синаптичними мембранами за цукрового діабету 1 типу корелює з направленістю порушень у зворотному поглинанні та вивільненні серотоніну нервовими закінченнями головного мозку, що підтверджує важливість NAD-опосередкованих мембранних процесів для нормального функціонування даної медіаторної системи. При цьому не було встановлено прямої залежності між рівнем NAD+ у головному мозку та його рецепцією синаптичними мембранами.

4. Вперше встановлено, що підвищення рівня моно-ADP-рибозилювання синаптосомальних білків та активація сигнального шляху Gs-білки/cAMP/протеїнкіназа A, принаймні частково, може бути ендогенним сигналом, здатним активізувати вивільнення нейромедіаторів за цукрового діабету.

5. Встановлено інтенсифікацію процесів пероксидного окислення ліпідів та істотне зниження активності основних ферментів антиоксидантного захисту клітин головного мозку за умов хронічної гіперглікемії, що спричинює порушення структурно-функціональної цілісності біологічних мембран та функціонування NAD-зв’язувальних ділянок синаптичних мембран головного мозку за діабету.

6. Вперше показано значне підвищення за діабету активності Parp та інтенсивності процесів полі-АDP-рибозилювання білків в клітинних ядрах головного мозку, пов’язане зі зростанням ступеню вільнорадикального пошкодження ДНК, що може призводити до часткового виснаження внутрішньоклітинних пулів NAD+ та АTP та відігравати роль у механізмі розвитку енергодефіциту в нервових клітинах.

7. Підтверджено важливість як коферментних, так і некоферментних функцій вітаміну РР та його похідних у нервовій системі за її різних функціональних станів. Показано, що нейротропна дія нікотинаміду та нікотиноїл-ГАМК за ЦД1 реалізується через нормалізацію функціонування NAD-модуляторної системи синаптичних мембран головного мозку, процесів моно- та полі-АDP-рибозилювання синаптосомальних та ядерних білків, сигнальних шляхів протеїнкінази А/C та системи антиоксидантного захисту.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Т.М. Кучмеровская, З.Е. Столяров, Г.В. Донченко, И.А Шиманский, А.П. Клименко. Захват и высвобождение [2-14C]серотонина синаптосомами головного мозга крыс с экспериментальным диабетом: эффект ингибитора протеинкиназы С и экстракта из пищевого растения // Доп. НАН України. - 1999. - № 5. - С. 173-177.

Кучмеровская Т.М., Донченко Г.В., Шиманський И.А., Клименко А.П. Влияние никотинамидадениндинуклеотида на ионные каналы нервных окончаний головного мозга крыс // Доп. НАН України. – 2000. - № 3. - С. 188-192.

Т.М. Кучмеровська, І.О Шиманский, Л.В. Пакірбаєва, С.О. Михалюк Реалізація нейротропної дії вітаміну РР та його похідних за умов діабетичної нейропатії // Збірник наукових праць “Хімічні Науки (хімія та біохімія)”. -2000. - Вип. 1.- С. 62-66.

І.О. Шиманський, Т.М. Кучмеровська, Г.В. Донченко, М.М. Великий, А.П. Клименко, О.М. Паливода, М.О. Кучмеровський. Корекція нікотинамідом та нікотиноїл-ГАМК оксидативного стресу за діабетичної нейропатії // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 74, № 5. – С. 89-95.

T. Kuchmerovska, I. Shymanskyy, G. Donchenko, L. Pakirbaieva, M. Kuchmerovskyy A. Klimenko. Poly -ADP- ribosylation enhancement in brain cells nuclei is associated with diabetic neuropathy // Journal of Diabetes and Its Complications. – 2004. - V. 18, N 4. - Р. 198-204.

І.О. Шиманський, Г.В. Донченко, А.П. Клименко Т.М. Кучмеровська. Механізми індукованих цукровим діабетом порушень процесу вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку щурів: ефект нікотинаміду // Укр. біохім. журн. – 2006. - Т. 78, № 4. - С. 130-136.

Kuchmerovskaya T., Donchenko G., Shimansky I., Pakirbaeva L. Effect of the inhibitors of PKC on serotoninergic transmission in streptozotocin-induced diabetes // 35th An. Meeting of EASD. – Diabetologia, V.42, Suppl.1. – Brussels, Belgium, 1999. – P. A 12, 6.

Shymanskyy I., Kuchmerovska T., Donchenko G., Klimenko A. NAD-Receptor System in the mechanisms of nicotinamide action in diabetic encephalopathy // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology. - Lviv, Ukraine, 2004. - P. 386.

I. Shymanskyy, T. Kuchmerovska, A. Klimenko. The relation of diabetes-associated mono-ADP-ribosylation to impaired brain serotonin transmission: effect of nicotinamide // 40th An. Meeting of the EASD. – Diabetologia, V.47, Suppl. 1. – Munich, Germany, 2004. – P. A 99, О. 256.

I. Shymanskyy, T. Kuchmerovska, G. Donchenko, A. Klimenko. Diabetes-associated cAMP/PKA-dependent facilitation of 5-HT release from rat brain synaptosomes: effect of nicotinamide // 41st EASD An. Meeting. – Diabetologia, V.48, Suppl. 1. - Athens, Greece, 2005. – A 426, 1181.

Kuchmerovska T, Shymanskyy I., Donchenko G., Klimenko A. Possible involvement of cyclic AMP system in nicotinamide adenine dinucleotide-induced serotonin release from rat brain synaptosomes // Укр. біохім. журн. – 2005. – Т. 77, № 2 (спец. випуск). - С. 64.

I. Shymanskyy, T. Kuchmerovska, G. Donchenko, A. Klimenko. Possible mechanisms of nicotinamide and nicotinoyl-GABA action in central nervous system of STZ-diabetic rats // 19th World Diabetes Congress. – Diabetic Medicine, V.23. – Cape Town, South Africa, 2006. – P. 107-108.

АНОТАЦІЯ

Шиманський І.О. Молекулярні механізми реалізації нейротропної дії вітаміну РР та його біологічно активних похідних. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2008.

Дисертацію присвячено дослідженню біологічної дії вітаміну РР та його похідних за різних функціональних станів ЦНС. У роботі експериментально обґрунтовано концепцію можливості реалізації нейротропних ефектів вітаміну РР безпосередньо на рівні модуляції процесів зворотного поглинання та вивільнення нейромедіаторів синаптичними закінченнями та з’ясовано конкретні механізми такої дії. Показано, що механізм NAD-індукованого вивільнення серотоніну синаптосомами мозку опосередковується активацією сигнальних шляхів протеїнкінази С/А і включає інгібування Na+,К+-АТРази та активацію потенціал- керованих Na-каналів. На експериментальній моделі цукрового діабету 1 типу встановлено, що зростання специфічного зв’язування NAD+ синаптичними мембранами корелює з підвищенням як спонтанного, так і індукованого деполяризуючими агентами вивільнення серотоніну синаптосомами, але супроводжується зниженням вивільнення медіатору у відповідь на дію екзогенного NAD+. Відмічено роль активації сигнального шляху Gs-білки/cAMP/протеїнкіназа A, внаслідок підвищення рівня моно-ADP-рибозилювання синаптосомальних білків, у посиленні вивільнення серотоніну за діабету. Встановлено також підвищення активності полі-АDP-рибозополімерази клітинних ядер, що викликано інтенсифікацією вільнорадикального пошкодження ДНК. Введення нікотинаміду та нікотиноїл-ГАМК за умов ЦД1 сприяло зниженню процесів моно- та полі-АDP-рибозилювання нейронних білків, інтенсивності ліпопероксидації, а також нормалізувало функціонування NAD-модуляторної системи та сигнальних шляхів протеїнкінази А/C, що призводило до зниження спонтанного та індукованого вивільнення серотоніну синаптичними закінченнями. Результати дослідження дозволяють зробити висновок про доцільність використання вітаміну РР з метою попередження розвитку та комплексного лікування діабетичної невропатії та на його основі вести пошук терапевтичних засобів, скерованих на нормалізацію функціональної активності ЦНС.

Ключові слова: нікотинамід, нікотиноїл-ГАМК, NAD-зв’язувальний білок, моно- та полі-ADP-рибозилювання, протеїнкінази А та С, Na+,K+-АТPаза, серотонін, синаптосоми, цукровий діабет.

аннотация

Шиманский И.О. Молекулярные механизмы реализации нейротропного действия витамина РР и его биологически активных производных.– Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2008.

Диссертация посвящена изучению биологического действия витамина РР и его производных при разных функциональных состояниях ЦНС. В работе экспериментально обоснована концепция возможности реализации нейротропных эффектов витамина РР непосредственно на уровне модуляции процессов захвата и высвобождения нейромедиаторов синаптическими окончаниями, а также исследованы конкретные механизмы такого действия. Показано, что механизм NAD-индуцированного высвобождения серотонина синаптосомами головного мозга опосредуется активацией сигнальных путей протеинкиназы С/А и включает ингибирование Na+,К+-АТРазы, а также активацию потенциал-зависимых Na-каналов. На экспериментальной модели сахарного диабета 1 типа установлено, что повышение специфического связывания NAD+ синаптическими мембранами коррелирует с усилением как спонтанного, так и индуцированного деполяризирующими агентами высвобождения серотонина синаптосомами, однако сопровождается снижением высвобождения в ответ на действие экзогенного NAD+. Отмечена роль активации сигнального пути Gs-белки/cAMP/протеинкиназа A, в результате повышения уровня моно-ADP-рибозилирования синаптосомальных белков, в усилении высвобождения серотонина при диабете. Установлено также повышение активности поли-АDP-рибозополимеразы клеточных ядер, что вызвано интенсификацией свободнорадикального повреждения ДНК. Введение никотинамида и никотиноил-ГАМК при диабете способствовало снижению процессов моно- и поли-АDP-рибозилирования нейронных белков, интенсивности липопероксидации, а также нормализовало функционирование NAD-модуляторной системы и сигнальных путей протеинкиназы А/C, что приводило к снижению спонтанного и индуцированного высвобождения серотонина синаптическими окончаниями. Результаты исследования позволяют сделать вывод о целесообразности применения витамина РР для предупреждения развития и комплексного лечения диабетической нейропатии, а также на его основе вести поиск терапевтических средств, направленных на нормализацию функциональной активности ЦНС.

Ключевые слова: никотинамид, никотиноил-ГАМК, NAD-связывающий белок, моно- и поли-ADP-рибозилирование, протеинкиназы А и С, Na+,K+-АТPаза, серотонин, синаптосомы, сахарный диабет.

SUMMARY

Shymanskyy I.O. Molecular mechanisms of neurotropic action of vitamin PP and its biologically active derivatives. – Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 – biochemistry. – O.V. Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.

The dissertation is devoted to investigating the mechanisms of biological action of vitamin PP and its derivatives under different functional states of central nervous system. Particular attention has been focused on the experimental support of the concept of direct involvement of these compounds in modulation of synaptic transmission via NAD-binding protein. It was found that effects associated with this protein contribute to the changes in the plasma membranes electrochemical gradients and may also depend on receptor-coupled intracellular signalling pathways. Consistent with the involvement of “action potentials” in NAD-related neuromodulation, tetrodotoxin (specific inhibitor of potential-operated Na channels) abolished the release of serotonin from isolated synaptic endings evoked by NAD+ (1 mM). These changes were accompanied by NAD+ ability to inhibit Na+,K+-ATPase activity in non-competitive fashion. Protein kinase C/A inhibitor, H7, completely prevented secretogenic action of NAD+. Thus, NAD+-induced serotonin release from synaptosomes appears to involve protein kinase C/A pathway which probably links downregulation of Na+,K+-ATPase and depolarization of synaptic membranes.

Further study was undertaken to define the character of functional interplay between NAD+ availability and changes in the specific binding of NAD+ by brain synaptic membranes in STZ-diabetic rats (70 mg/kg b.w.) which were treated by single injection for 6 hours (short-term) or chronically for two weeks (long-term) after 6 or 4 weeks of diabetes respectively with nicotinamide (NAm) or nicotinoyl-GABA (N-GABA) in low or high (20 and 200 mg/kg b.w.) doses. The brain NAD+ and ATP contents were significantly reduced in diabetes vs. control (respectively by 27.3±1.9 % and 30.1±2.7 %). No difference occurred between increments in NAD+ contents after single administration of high NAm dose in control and diabetes indicating preserved nervous cells ability to synthesize NAD+ in sufficient amounts. Depletion of brain NAD+ and ATP contents defined in diabetes could be regarded as a consequence of free radical- and oxidant-induced increase in ADP-ribosylation since poly(ADP-ribose)polymerase activation was currently established. Diabetes was also found to be associated with enhanced oxidative stress in brain as it is evident from 2.9–fold increase in accumulation of thiobarbituric acid reactive substances vs. control. These changes were accompanied by 51.0 % increase in maximal capacity of [U-14C]NAD+ binding sites (Bmax) of synaptic membranes. In spite of augmented binding, NAD+ (1 mmol/L) failed to evoke the release of serotonin from the synaptosomes isolated from diabetic rat brain to the level of control. While NAD+ and ATP contents were similarly counteracted by low and high doses of NAm and N-GABA treatments, NAD+ reception fully restored only in case of chronic administration of high Nam dose. Discrepancies in efficacy of the drugs to restore NAD+ contents and normalize NAD+ binding and serotonin release after long-term treatments corresponded to their efficacy as free radicals scavengers and Parp inhibitors being the strongest in case of high NAm dose.

Our data provide further evidence that diabetes may cause physiologically drastic failure in realization of serotonin-mediated effects in CNS. It was found that striking increase in spontaneous and evoked serotonin release associated with diabetes is, at least partially, dependent on Gs protein/cAMP/PKA-mediated facilitatory pathway in synaptic endings related to enhanced mono-ADP-ribosylation of extranuclear proteins. NAm treatment, initiated after diabetes duration of 4 weeks, virtually normalized both mono-ADP-ribosylation and serotonin release.

In conclusion, the present study confirms the complex pattern of vitamin PP neuroprotective action used in high therapeutic doses. Its beneficial effects on diabetes-associated brain failures can be related to normalization of NAD+ reception most likely due to its antioxidant and anti-ADP-ribosylating properties.

Key words: nicotinamide, nicotinoyl-GABA, NAD-binding protein, mono- and poly-ADP-ribosylation, protein kinases А/С, Na+,K+-АТPase, serotonin, uptake, release, synaptosomes, diabetes mellitus.

СПИСОК СКОРОЧЕНЬ

ГАМК – г-аміномасляна кислота;

N-ГАМК – нікотиноїл-ГАМК;

ТБК-активні продукти – продукти, які реагують з тіобарбітуровою кислотою;

ЦД1 - цукровий діабет 1 типу;

4-AP - 4-амінопіридин;

СТХ - холерний токсин;

G-білки - GTP-зв’язувальні білки;

LTX - латротоксин

NАm - нікотинамід;

Parp - [Poly(ADP-ribose) polymerase] - полі-ADP-рибозилполімераза;

PKA - протеїнкіназа А;

РКС - протеїнкіназа С;

ТТХ - тетродотокcин;

VTD - вератридин;