Реферат: Использование пенициллиназы в биотехнологии

Под резистентностью (устойчивостью) понимают способность микроорганизма переносить значительно большие концентрации препарата, чем остальные микроорганизмы данного штамма или развиваться при таких концентрациях, которые превышают достигаемые в макроорганизме при введении антибиотиков, сульфаниламидов в терапевтических дозах.

Резистентные штаммы микроорганизмов возникают при изменении генома бактериальной клетки в результате спонтанных мутаций. В процессе селекции в результате воздействия химиотерапевтических соединений чувствительные микроорганизмы погибают, а резистентные сохраняются, размножаются и распространяются в окружающей среде. Приобретенная резистентность закрепляется и передается по наследству последующим генерациям бактерий.

Пенициллины — большая группа лекарственных препаратов, имеющих определенное сродство химического строения, механизмов действия, фармакологических, клинических эффектов. Эти препараты называют β-лактамными антибиотиками, что обусловлено наличием в их структуре общего для всей группы четырехчленного лактамного кольца.

Все пенициллины имеют одинаковое строение основной группы, которая представлена тиазолидиновым кольцом, соединенным с β -лактамным кольцом, и имеющим аминогруппу - 6-аминопеницилановая кислота (6-АПК).

Различные пенициллины отличаются строением радикала молекулы боковой цепи, активностью и спектром действия. Важные, с точки зрения клинического использования, представители пенициллинов можно разделить на несколько групп:

- обладающие наивысшей активностью в отношении грамполо-жительных микроорганизмов и слабой в отношении грамотрицательных видов, а также гидролизуемые бета-лактамазам (пенициллин G);

- относительно резистентные к действию бета-лактамаз стафилококков, но с более низкой активностью в отношении грамположительных микроорганизмов и не действующие на грамотрицательные (нафициллин, метациллин);

- относительно высокоактивные против грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, но разрушаемых бета-лактамазами (карбенициллин, тикарциллин);

- препараты с относительной кислотоустойчивостью и пригодные для перорального применения - (пенициллин V, ампициллин, клоксациллин).

Структурное единство ядра 6-АПК существенно для проявления биологической активности молекул. При ферментативном расщеплении бета-лактамного кольца бактериальными бета-лактамазами (пенициллиназами) с образованием неактивной пенициллановой кислоты антибиотик лишается своих антимикробных свойств.

Одна из основных причин, вызывающих потребность в создании и внедрении в медицинскую практику новых беталактамных антибиотиков, — распространение среди патогенных микроорганизмов способности продуцировать ферменты, катализирующие расщепление беталактамного кольца у пенициллинов, внедренных в медицинскую практику. Они получили название пенициллиназ в соответствии с их субстратной специфичностью и избирательностью действия на пенициллины.

Один из возможных способов борьбы с резистентностью — химическая трансформация молекул антимикробных веществ, в частности антибиотиков, направленная на создание новых препаратов, активных в отношении антибиотико-устойчивых микроорганизмов. Путем трансформации были синтезированы полусинтетические пенициллины и цефалоспорины, нечувствительные к действию бета -лактамаз: метициллин, оксациллин, диклоксациллин, цефамандол, цефуроксим, цефсулодин и ряд других.

1. Пенициллиназы. Общие сведения

Пенициллиназы (бета-лактамазы) - ферменты, разрывающие β-лактамное кольцо пенициллинов и цефалоспоринов.

Синтезируются грамположительными (бациллами, клостридиями, стафилококками и др.) и некоторыми грамотрицательными (напр., протеем) бактериями.

Гены, кодирующие синтез β-лактамаз, находятся в бактериальной хромосоме или R-плазмиде и могут передаваться другим особям трансдукцией или трансформацией.

Продуценты пенициллиназ устойчивы к большинству препаратов пенициллинового и цефалоспоринового рядов.

Бета-лактамазы расширенного спектра являются плазмидными ферментами, продукция которых является общей для семейства Enterobacteriaceae, особенно для Klebsiella pneumoniae.

Пенициллиназы (бета-лактамазы) - ферменты, разрывающие β-лактамное кольцо пенициллинов и цефалоспоринов.

Синтезируются грамположительными (бациллами, клостридиями, стафилококками и др.) и некоторыми грамотрицательными (напр., протеем) бактериями. Гены, кодирующие синтез β-лактамаз, находятся в бактериальной хромосоме или R-плазмиде и могут передаваться другим особям трансдукцией или трансформацией.

Продуценты пенициллиназ устойчивы к большинству препаратов пенициллинового и цефалоспоринового рядов.

Ферментативное расщепление (гидролиз) беталактамного кольца ведет к полной инактивации беталактамного антибиотика. Это было показано на примере бензилпенициллинов еще в 1940-х гг. Э.Чейном, впервые очистившим пенициллин. Продукт ферментативного расщепления бензилпенициллина — пенициллоиновая кислота полностью не активна. Это легко объяснимо, так как механизм действия беталактамных антибиотиков связан именно с расщеплением беталактамного кольца и ацилированием гидроксильной группы серина в активном центре ферментов-мишеней.

В случае же пенициллиназ беталактамное кольцо также расщепляется, и антибиотик быстро освобождается из активного центра этих ферментов с присоединением атома водорода и гидроксила.

В настоящие время пенициллиназы составляют обширную группу одинаковых по механизму действия, но разнящихся по субстратной специфичности ферментов, объединенных под общим названием «беталактамазы».

Наиболее часто лекарственная устойчивость связана со способностью микроорганизмов вырабатывать ферменты, инактивирующие антибактериальные препараты.

Характерный пример устойчивости этого типа — способность бета-лактамаз (пенициллиназ) бактерий гидролиэировать бета-лактамные кольца пенициллинов и цефалоспоринов. В результате разрыва бета-лактамной связи антибиотики теряют свою специфическую активность в отношении микроорганизмов.

Бета-лактамазы бывают как широкого спектра действия, расщепляющие пенициллины и цефалоспорины, так и узкого — активные в отношении только одной из групп этих антибиотиков. Пенициллиназы грамположительных микроорганизмов служат индуцируемыми ферментами, поэтому их синтез начинается только в момент контакта бактерии с бета-лактамами. При этом пенициллиназа высвобождается из бактериальных клеток и инактивирует антибиотик в межклеточном пространстве.

В то же время бета-лактамазы грамотрицательных бактерий детоксицируют антибиотик в периплазматическом пространстве. Таким образом, они инактивируют проникшие через наружную мембрану бета-лактамы еще до того, как антибиотик связался с ферментами, участвующими в синтезе клеточной стенки. Пенициллиназы резистентных грамотрицательных микроорганизмов синтезируются конститутивно и постоянно находятся в периплазматическом пространстве.

Известно, что беталактамазы произошли от транспептидаз и D,D-карбоксипептидаз пептидогликана, т. е. из ферментов-мишеней в бактериальной клетке, необратимо инактивируемых беталактамами.

Гены беталактамаз, локализуются как в бактериальной хромосоме, так и в плазмидах, которые не находятся под столь строгим регуляторным контролем в клетке, как хромосомный генетический материал, и могут существовать во многих копиях, что повышает количество генов беталактамаз и уровень самих ферментов в клетке. Между хромосомами и плазмидами нередко происходит обмен генами, в частности беталактамаз.

Очень важно, что гены беталактамаз, локализованные в плазмиде, могут передаваться при конъюгации вместе с плазмидой в другую клетку. Это означает, что плазмидные гены быстро распространяются по клеточной популяции, для чего не нужно даже деления клеток.

Возможен и межвидовой перенос плазмидных генов беталактамаз, например, из клетки кишечной палочки в клетку сальмонеллы и т.п.

2. Классификация, свойства и механизм действия пенициллиназ

Беталактамазы могут быть как конституитивными (у одних штаммов бактерий), так и индуцибельными (у других штаммов).

Иногда в одной клетке могут оказаться две разных беталактамазы, причем одна из них образуется постоянно, т. е. конституитивно, тогда как другая обнаруживается, когда клетка попадает в среду с беталактамным антибиотиком.

Способность к индукции беталактамаз является отрицательным свойством беталактамных антибиотиков с позиций медицинской практики, поэтому новые беталактамные структуры оцениваются при изучении их свойств не только на устойчивость к ферментативной инактивации, но и на способность индуцировать беталактамазы. Последняя зависит от того, с какой мишенью, т.е. с каким из РВРs связывается беталактаммый антибиотик, так как именно РВРs являются «сенсорами», запускающими сложный механизм индукции беталактамаз.

Схематически этот механизм выглядит следующим образом: беталактамный антибиотик, находящийся в среде, реагирует с одним из белков, принадлежащих к РВРs. Его взаимодействие с белком ведет к изменению конформации этого белка

Меняются биофизические параметры белка, сигнал об этом передается на специальный трансмембранный белок, молекула которого пересекает цитоплазматическую мембрану и выходит на ее внешнюю поверхность.

Далее сигнал последовательно передается на первый и второй цитоплазматические белки, включенные в систему индукции ферментов и, наконец, на белок-репрессор, уже непосредственно регулирующий экспрессию именно гена беталактамазы.

В результате репрессор перестает подавлять экспрессию этого гена. Соответственно, начинаются его экспрессия и синтез молекул информационной РНК, которая далее поступает в рибосомную систему, где на ней как на матрице синтезируются молекулы беталактамазы.

Система индукции беталактамаз специфична: на своем начальном участке РВРs являются первичными сенсорами в отличие от других белков мембраны, а на конечном участке — белок репрессор специфичен только для гена беталактамазы.

3. Использование пенициллиназы в биотехнологии

В настоящее время большое практическое значение имеет полусинтетический (биологический + химический) способ получения аналогов природного пенициллина. Исходным продуктом служит 6-аминопени-циллановая кислота (6-АПК).

6-АПК получают в результате биосинтеза при развитии Р. chrysogenum при отсутствии предшественника в среде или путём ферментативного дезацилирования бензилпенициллина или феноксиметилпенициллина при участии фермента пенициллинацилазы (пенициллинамидазы).

Второй способ наиболее перспективен. Используется иммобилизованная пенициллинацилаза, которая гидролизует бензилпенициллин с образованием 6-АПК и фенилуксусной кислоты.

Пенициллинацилаза образуется различными группами микроорганизмов, в том числе она образуется всеми продуцирующими пенициллин грибами. В настоящее время предложен способ получения иммобилизованных клеток Е. соli с высокой пенициллинацилазной активностью, пригодных для многократного применения.

Сама по себе 6-АПК не активна. Её подвергают химическому аци-лированию и получают аналоги пенициллина с улучшенными или новыми свойствами; некоторые из них: оксациллин, ампициллин, метициллин, амоксициллин и другие. Всего в настоящее время используется порядка четырёх десятков таких препаратов.

4. Ингибиторы беталактамаз

Среди беталактамных антибиотиков обнаружены очень активные индукторы беталактамаз и малоактивные, которые применяют для использования в клинике.

Перспективными методами в борьбе с лекарственно-устойчивыми микроорганизмами служит использование соединений, подавляющих определенные механизмы резистентности в бактериальной клетке. Наибольшие успехи в этом направлении достигнуты в результате применения неконкурентных ингибиторов бета-лактамаз, первый представитель — клавулановая кислота.

Она обладает слабой антибактериальной активностью, и как антибактериальный препарат ее не используют. Основное ее свойство — способность необратимо ингибировать пенициллиназы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Эта кислота проявляет синергизм в отношении бета-лактамазообразующих возбудителей в комбинации с ампициллином, амоксициллином, тикарциллином, цефалексином и многими другими бета-лактамными антибиотиками. Уже разработаны и применяются в клинической практике комплексные препараты на основе амоксициллина и клавулановой кислоты.

Производные пенициллановой кислоты также можно практически использовать в качестве ингибиторов бета-лактамаз. К другим эффективным ингибиторам пенициллиназ относят оливановые кислоты и тиенамицины, которые, помимо защиты антибиотика от действия ферментов, обладают широким антимикробным спектром действия.

Ввиду несомненного сходства многих беталактамаз с их ферментами-мишенями был предпринят поиск специфических ингибиторов беталактамаз.

Среди природных беталактамов и продуктов их химической трансформации были отобраны ингибиторы беталактамаз, воздействующие и на беталактамазы, и на транспептидазы пептидогликана, т.е. обладающие антибактериальной активностью.

Практическая ценность ингибиторов беталактамаз обусловлена тем, что их используют вместе с беталактамными антибиотиками, которые чувствительны к беталактамазам. Ингибиторы беталактамаз защищают эти антибиотики от ферментативной инактивации.

Широкую известность получили такие ингибиторы, как клавулановая кислота и сульбактам и некоторые другие. Однако необходимо учитывать, что любой конкретный ингибитор не может воздействовать на все многочисленные типы беталактамаз.

действия каждого ингибитора ограничен беталактамазами лишь нескольких типов, распространенных среди бактерий.

За рубежом выпускаются смесь полусинтетического пенициллина (ампициллина) с сульбактамом (2:1) под фирменным названием «уназин», а также препарат сультамициллин — химическое соединение ампициллина с сульбактамом.

Получил практическое применение и препарат аугментин, являющийся смесью амоксициллина (полусинтетического пенициллина) с клавулановой кислотой.

При подборе комбинаций ингибиторов беталактамаз с беталактамными антибиотиками важно иметь в виду и соблюдать следующее условие: фармакокинетика ингибитора и антибиотика должна быть сходной. Иными словами, их распределение по органам и тканям организма, пути выведения (например, преимущественно с мочой или с желчью), время циркуляции в организме должны быть близкими.

Ингибитор не сможет выполнять свою защитную роль, когда его концентрация в местах локализаций антибиотика окажется низкой или если он будет выводиться из организма гораздо быстрее, чем антибиотик.

Заключение

Перспективное направление в борьбе с резистентностью бактерий — использование фосфогликолипидных антибиотиков. Другим подходом к решению проблемы воздействия на лекарственно-устойчивую популяцию микроорганизмов является использование соединений, обеспечивающих элиминацию плазмид из резистентных бактерий и действующих на детерминанты лекарственной устойчивости.

Одним из способов, ведущих к элиминации плазмид из микробной клетки, стало применение ДНК-тропных веществ. Акрифлавин и хинакрин вызывают элиминацию R-факторов из сальмонелл, шигелл и эшерихий. Способностью элиминировать плазмиды резистентности к лекарственным препаратам обладают рифампицин, фурагин, антигистаминные препараты, бромистый этидий, акридиновые красители и ряд других веществ.

ДНК-тропные соединения действуют в первую очередь на R+-клетки. Механизм этого процесса связан с тем, что ДНК-тропные вещества взаимодействуют с плазмидной ДНК и тем самым нарушают ее репликацию, необходимую при переносе плазмид из клетки в клетку.

Помимо непосредственного влияния на R-факторы, ДНК-тропные соединения замедляют развитие резистентности микроорганизмов к антимикробным препаратам.

Еще один путь предупреждения распространения плазмид реэистентности — это использование соединений, эффективно подавляющих процессы переноса детерминанты устойчивости при конъюгации бактерий. Наиболее интенсивно на этот процесс воздействуют рифампицин, бромистый этидий, кофеин, протамин, неомицин и нитрофураны

Наиболее перспективный и реальный метод, ограничивающий появление и накопление устойчивых бактерий в организме — это повышение эффективности химиотерапии за счет использования комбинаций различных антимикробных препаратов.

Помимо предупреждения развития резистентности, рационально подобранные сочетания антибактериальных препаратов могут воздействовать на устойчивые штаммы микроорганизмов с помощью подавления ферментов, инактивирующих один из компонентов смеси.

Так, одна из возможностей защиты бета-лактамазолабильных пенициллинов от деградации пенициллиназой заключается в их использовании в сочетании с бета-лактамазостабильными пенициллинами. При этом последние блокируют активные центры фермента и тем самым предупреждают инактивацию пенициллиназолабильных антибиотиков.

При комбинировании левомицетина с ампициллином и окситетрациклина с пенициллином удается воздействовать на беталактамазопродуцирующие штаммы Haemophilus influenzae и стафилококка за счет ингибирования бактериостатическими антибиотиками процесса бета-лактамазообразования в микробной клетке, в связи с чем резистентные микроорганизмы становятся чувствительными к бета-лактамазолабильным антибиотикам.

Таким образом, высокоэффективным способом борьбы с резистентностью микроорганизмов является использование соединений, активных в отношении ферментов, ингибирующих антимикробные вещества.

К сожалению, ассортимент таких веществ практически ограничен только противо-бета-лактамазными препаратами и не может полностью решить проблему лекарственной резистентности. Использование специфических ингибиторов репликации плазмидной ДНК и препаратов, влияющих на процессы конъюгации и трансдукции, также не нашло широкого применения, во-первых, из-за отсутствия 100 %-ного эффекта в отношении всех видов устойчивых микроорганизмов и, во-вторых, из-за высокой токсичности многих из этих веществ для макроорганизма. В связи с этим для предотвращения развития лекарственной резистентности и воздействия на устойчивую микрофлору наиболее широко используют комбинированную химиотерапию.

Список литературы

Биотехнология микробного синтеза/под ред. М. Е. Бекера — Рига: Зинатне, 1980. — 350 с.

Биотехнология/под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса/перевод с английского/под ред. А. А. Баева. — М.: Мир, 1988. — 479 с.

Веселкова Е.Г. Генная инженерия - основа современной биотехнологии / Е.Г. Веселкова //

Виестур У. Э., Ш м и т е И. А., Ж и л е в и ч А. В. Биотехнология. — Биотехнологические агенты, технология, аппаратура. — Рига: Зинатне, 1987. — 263 с.

Гаузе Г. Ф. Молекулярные основы действия антибиотиков. /Пер. с англ. М.: “Мир”, 1975.

Д е б а б о в В. Г., Лившиц В. А. Биотехнология. — М.: Высшая школа, 1988.

Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высшая школа, 1986.

Страчунский Л. С., Козлов С. Н. Антибиотики : клиническая фармакология. Смоленск : Амипресс, 1994.

Реферат: Использование пенициллиназы в биотехнологии

Похожие работы: