Реферат

З дисципліни «Агроекологія»

На тему: «Використання біологічних тестів для оцінки впливу мінеральних добрив на агроекосистему»

Для оцінки негативного впливу агрохімікатів на агроекосистему сучасний рівень досліджень передбачає широке застосування методів біотестування, тобто використання відповідної реакції організму на вплив факторів середовища. Цей підхід до оцінки екологічного стану агроекосистеми є найоб'єктивнішим. Він базується на тому, що реалізація процесів, які відбуваються в організмі, зумовлена специфікою як організму, так і навколишнього середовища. Організм залежить від середовища передусім через характер його ресурсів і факторів, які впливають на метаболізм. У свою чергу, про стан середовища можна судити за кількістю або інтенсивністю розвитку різних видів, популяцій і цілих угруповань певних організмів. Чутливішими до впливу факторів середовища є види з низьким ступенем толерантності, які належать до стенобіонтів, тобто організмів з вузьким діапазоном життєвих можливостей при зміні певного фактора середовища, у тому числі антропогенного характеру. Ю. Одум (1976 р.) підкреслював, що організм часто перебуває під впливом не одного, а кількох лімітуючих факторів середовища і саме тому методи біоіндикації дають змогу врахувати не лише адитивні ефекти (як це відбувається при нормуванні впливу за рівнем ГДК), а і сумарні ефекти, завжди присутні у природних екосистемах.

Як показав Ю. Лібіх (1840 p.), лімітуючим фактором може бути не тільки нестача, але і надлишок якоїсь певної хімічної речовини, життєвість організмів характеризується екологічним мінімумом і максимумом, діапазон між цими двома величинами є межею екологічної толерантності. Більшість біологічних видів пристосовані не до визначених величин даного фактора, а до меж його мінливості у природі, та меж його тимчасових флуктуацій (коливань).

В основу екологічного тестування покладено реакцію організмів на вплив факторів середовища. Організм здатний виживати лише в діапазоні мінливості даного фактора, який ще називають амплітудою. Як дуже високі (максимальні), так і дуже низькі (мінімальні) значення факторів середовища можуть бути згубними для організму. Поро-гове значення даного фактора, виражене в певних одиницях, вище або нижче якого організм не може існувати, є критичною точкою. Між цими критичними значеннями розташована зона екологічної толерантності. У межах зони екологічної толерантності напруженість факторів середовища різна. Поряд з критичними точками розташовані песимальні зони, в яких активність організму значно обмежена дією зовнішніх умов. Далі розташовані зони комфорту, в яких відбувається чітке зростання екологічних реакцій організму. В центрі знаходиться зона оптимуму, яка є найсприятливішою для функціонування організму (рис. 1).

Рис. 1. Реакція організму на фактори середовища. Зони: І – песимуму; ІІ – комфорту; ІІІ – оптимуму

В. Ковальським 1974 р. було показано можливі негативні реакції організмів на недостатню і надлишкову кількість ХЕ у грунті. Саме надлишкова кількість ХЕ, які у такому разі виступають токсикантами, є предметом вивчення і контролю при застосуванні агрохімікатів.

Для біотестування впливу мінеральних добрив на Ґрунтову систему слід підбирати показники стану біоти, які характеризуються найменшими зонами оптимуму і комфорту. Порівняння амплітуд мінливості фактору, в яких реакція біоти переходить від зони оптимуму до зони комфорту і далі до зони песимуму, дає можливість встановити найчутливіші з них. За розмірами відхилення реакції організму від еталону (контролю), можна судити про можливий негативний вплив конкретного мінерального добрива на ґрунтову систему. При екоток-сикологічній оцінці засобів хімізації прийнято, що відхилення реакції від еталону менше ніж на 10% – малонебезпечний рівень, на 10– 25% – помірно небезпечний і понад 25% – небезпечний. Базуючись на цьому, реакцію організмів щодо мінеральних добрив можна оцінити так: зона оптимуму – зниження < 10%, зона комфорту – зниження на 10–25%, песимуму – зниження > 25%. Якщо зміни напруження екологічного фактора в зоні екотоксикологічного контролю виразити через умовні одиниці, а реакцію організму на зміну екологічного фактора – у відсотках до еталону (контролю), то за активністю переходу від зони оптимуму і комфорту до зони песимуму можна провести оцінку різних біотестових методів і встановити найчутливіші з них. Чим менше рівень активної толерантності (до 25% депресії), тим ефективніший метод тестування.

Для біотестування доцільно використовувати системи показників на молекулярному (біохімічні процеси), онтогенетичному (толерантність організмів на певних стадіях онтогенезу), біогеоценотичному (зміни кількості деяких видів організмів у ґрунтових системах) та інших рівнях організації життя.

Оцінювати різні біотести щодо мінеральних добрив доцільно виходячи з того, що потенційний негативний вплив МД може полягати у привнесені БАЕ у ґрунтову систему і педохімічно активному впливі на неї – зміні реакції ґрунтового середовища.

Важливим показником рівня небезпечності мінеральних добрив може бути дія на ґрунтову біоту (зміна загальної кількості мезофауни, сапрофітної мікрофлори, активність протікання біохімічних процесів тощо). З усіх біотичних компонентів ґрунту мікробна спільнота найчутливіша до змін екологічної ситуації під час сільськогосподарської діяльності. У відповідь на антропогенне навантаження мікробна спільнота змінюється структурно-функціонально, що виражається у послідовній зміні чотирьох адаптивних зон. У першій зоні (зона гомеостазу), яка характерна для низького рівня навантаження, відбуваються зміни загальної біомаси мікробної спільноти при постійному складі та організації. Середні рівні навантаження спричиняють зміни в організації мікробної спільноти у вигляді перерозподілу популяцій за ступенем домінування, тоді як видовий склад залишається незмінним (зона стресу). При цьому у ґрунті розвиваються токсиноутворюючі мікроорганізми. Для третьої зони (зона резистентності), яка характеризується високим рівнем навантаження, характерні зміни складу мікробної спільноти. Його видовий склад різко скорочується через загибель більшості організмів, властивих контрольному ґрунту. Переважаючий розвиток одержують стійкі щодо певного фактору популяції. Подальше збільшення навантаження призводить до повного пригнічення росту і розвитку мікроорганізмів у ґрунті (зона репресії).

Тривале застосування мінеральних добрив сприяє збільшенню загальної чисельності мікроорганізмів у ґрунті. Але при застосуванні високих доз мінеральних добрив (понад 300 кг/га NPK) можливо пригнічення мікробіологічної діяльності (рис. 2).

Рис. 2. Вплив тривалого застосування мінеральних добрив на загальну чисельність мікроорганізмів у орному шарі темно-сірого опідзоленого ґрунту, млн/г ґрунту (ІЗ УААН)

На фоні загальної тенденції зменшення чисельності мікроорганізмів у ґрунті при застосуванні підвищених доз NPK (понад 180 кг/га NPK) можна спостерігати збільшення кількості таксономічних груп, здатних утворювати токсини, що характерно для зони стресу. Так, при тривалому застосуванні мінеральних добрив на темно-сірому опідзоленому грунті (ІЗ УААН) кількість грибів зросла з 113 до 154– 159 тис, стрептоміцетів – з 4,1 до 5,2–5,9 млн, або відповідно на 36,3-40,7% і 26,8-43,9% (рис. 3).

Рис. 3. Вплив тривалого застосування мінеральних добрив на чисельність токсиноутворюючих груп мікроорганізмів у темно-сірому опідзоленому ґрунті: -●- гриби ; -•- стрептоміцети

Встановлені в умовах багатьох стаціонарних дослідів особливості впливу мінеральних добрив на мікробоценоз свідчать про необхідність контролю за станом біоти при їхньому застосуванні.

Поширеним видом біотестування є фітотестування, тобто визначення умов середовища за станом рослин. Для фітотестування використовують широкий спектр тест-рослин, серед яких значне місце посідають злакові, бобові, мареві…

В умовах штучного забруднення ґрунту ВМ на дерново-підзолистому ґрунті в дослідах Інституту агроекології та біотехнології УААН одержано дані, які показали, що фітотестування не завжди можна з успіхом використовувати для оцінки мінеральних добрив як джерело БАЕ. Так, біопродуктивність тест-культури ячменю знижувалася лише при доволі високому рівні забруднення ґрунту – 1,0 ГДК Cd, Pb, Cu, Zn за валовими формами. Перехід рослин від зони оптимуму до зони песимуму спостерігали при забрудненні ґрунту – 5,0 ГДК. При забрудненні ґрунту ВМ – 0,5 ГДК проявлявся стимулюючий ефект на рослини ячменю – біопродуктивність порівняно з контролем зросла на 16,0%. Це свідчить, що такі концентрації ВМ не спричиняють руйнації толерантного потенціалу рослин і відіграють роль мікроелементів, тобто стимулюють фізіологічні процеси рослин. З мінеральними добривами у ґрунт надходить незначна кількість БАЕ, і перевищення рівня ГДК за їхніми валовими формами спостерігають у крайніх випадках, тому результати екотоксикологічної оцінки мінеральних добрив за показниками фітотоксичності можуть бути необ'єктивними.

Подібну залежність спостерігали і при використанні онтогенетичного підходу, тобто вивченні реакції тест-організму на певній стадії його онтогенезу. Встановлення токсичності грунту за показниками розвитку зернівки пшениці (І–II етапи органогенезу за Ф. Куперман) виявилося можливим лише за високого рівня забруднення ґрунту: 5,0 ГДК Cd, Pb, Zn, Cu. У цьому разі пригнічувався розвиток первинного (зародкового) кореня. При менших рівнях забруднення (0,5–1,0 ГДК) на початкових етапах онтогенезу активізувався ріст зародкового кореня і пагона з колеоптилем, тобто ВМ у такому разі виконували роль мікроелементів (табл. 1).

Таблиця 1. Визначення токсичності штучно забрудненого ВМ дерново-середньопідзолистого ґрунту за показниками стану тест-рослин

Варіанти	Вид фітотестування
	Продуктивність, тест-рослина – ячмінь ярий (Hordeum)		Стадія онтогенезу, тест-рослина – зернівка пшениці (Triticum)
			зародковий корінь		пагін, см
	т/га	% до контролю	см	% до контролю	см	% до контролю
Контроль	2,63	-	4,82	-	1,33	-
0,5 ГДК Cd, Pb, Cu, Zn	3,05	+ 16,0	5,59	+ 16,0	1,95	+ 46,6
1,0 ГДК Cd, Pb, Cu, Zn	2,23	- 15,4	4,56	-6,4	2,20	+ 65,4
5,0 ГДК Cd, Pb, Cu, Zn	повна загибель	_	3,41	-29,3	1,16	- 12,8
HIP 0.05 (Рф >FT)	0,31	-	1,02	-	0,68	-

Використання поліномінального рівняння залежності активності фізіологічних функцій тест-організму від рівня забруднення ґрунту ВМ дало змогу провести порівняльну оцінку фітотестів за показниками морфологічного розвитку (біопродуктивність ячменю) і онтогенетичного розвитку (довжина зародкового кореня пшениці). Рівень активної толерантності становив 4,0 і 8,1 у. о. відповідно (рис. 4).

Рис. 4. Фітотесіування забруднення дерново-середньопідзолистого ґрунту ВМ: 1 – ячмінь (урожай зерна, т/га); 2 – зародковий корінь пшениці (довжина, см)

Широкого використання також набули методи біотестування, пов'язані з якісним і кількісним складом мікробного ценозу, активністю біохімічних процесів та ін. В екотоксикологічних дослідженнях давно і з успіхом використовують показники активності ферментів ґрунту.

У ґрунті представлено широкий спектр ферментів, кількісний і якісний склад яких залежить, передусім, від властивостей грунту (механічного складу, родючості, зволоження тощо). Для використання ферментів в якості біотестів слід враховувати специфічність їхньої дії і чутливість щодо антропогенного чинника. Н. Черних (1991 р.) використовував для біотестування забруднення ґрунту ВМ каталазну, інвертазну, уреазну, фосфатазну активність; Н. Павлюкова, Л. Долгова (1993 р.) для тестування забруднення ґрунтів фенолами і роданідами – активність поліфенолоксидази; І. Ромейко (1969 р.) для тестування способів оранки – активність протеази тощо. Відомо, що із гідролаз, які каталізують розкладання вуглецевих сполук у ґрунті, доцільно вивчати інвертазу, амілазу, целлюлазу; із протеаз і амідаз, що беруть участь у розкладанні азотистих речовин – уреазу, аспарагіназу; із ферментів, що беруть участь у розкладанні органічних сполук фосфору – фітазу, нуклеазу, фосфатазу; із групи окисно-відновлювальних ферментів – поліфенол-оксидазу, пероксидазу, каталазу і дегідрогеназу.

За активністю ферментів групи оксидоредуктаз – поліфенолокси-дазою і пероксидазою, згідно з М. Коконовою, можна робити висновок про інтенсивність загальної направленості процесів у ґрунті, оскільки оксидоредуктази беруть участь у синтезі і мінералізації гумусу, а також чутливі до зміни рН ґрунтового середовища. Найрухоміші компоненти гумусових речовин за участі поліфенолоксидази можуть приєднувати атомарний кисень, перетворюючись на сполуки типу оксигеназ. Оксигенази за участі пероксидази здатні передавати поглинутий з повітря кисень рослинам, перетворюючись на сполуки типу хінонів. Водночас, хінони здатні поглинати надлишок водню, що утворюється в клітинах, і знову перетворюватися на гумусові речовини. Мінеральні добрива активно впливають саме на ці процеси, що і зумовлює можливість проведення екотоксикологічного контролю мінеральних добрив за активності названих ферментів (не виключаючи можливості залучення ширшого спектру ферментів).

Фізіологічно і хімічно кислі мінеральні добрива (сульфат амонію, хлористий калій), впливаючи на реакцію ґрунтового розчину, можуть опосередковано діяти на гомеостатичний стан грунту, зокрема на активність ґрунтових ферментів. Встановлено, що у місці контакту гранули добрива і ґрунту може відбуватися дуже сильне підкислення середовища (рН близько 1). Внаслідок цього виникають «мініопіки», які, насамперед, негативно впливають на біоту ґрунтової системи. Токсичну дію щодо ферментів може проявляти також рухомий алюміній, який переходить у ґрунтовий розчин при зниженні рівня рН. Особливо активно ці процеси відбуваються у бідних на органічну речовину дерново-підзолистих ґрунтах.

В Інституті агроекології та біотехнології УААН було проведено дослідження на дерново-середньопідзолистому ґрунті і чорноземі типовому малогумусному з встановлення ефективності біотестування за показниками активності ферментів групи оксидоредуктаз щодо педо-хімічних властивостей мінеральних добрив. Використовували фізіологічне кислі азотні добрива та хімічно кислі калійні. Одержані результати показали, що підвищення кислотності ґрунту при застосуванні мінеральних добрив на дерново-середньопідзолистому ґрунті значною мірою було зумовлено вмістом рухомого алюмінію. Його кількість зростала пропорційно внесеним добривам з 2,4 мг/100 г ґрунту на контролі до 5,1 мг/100 г ґрунту у варіанті із застосуванням 240 кг/га NPK. Підвищення кислотності ґрунту призвело до зниження активності оксидоредуктаз на 9,5–25,3%. У тісній зворотній залежності від обмінної кислотності і вмісту іонів алюмінію перебувала активність ферменту – поліфенолоксидази. її кількість зменшилась з 0,440 до 0,329 мг пурпургаліну на 1 г ґрунту. Коефіцієнт кореляції, який визначав залежність між рівнем кислотності, вмістом іонів водню та іонів алюмінію, становив – 0,980–0,998. Активність пероксидази меншою мірою залежала від вмісту рухомого алюмінію: спостерігали лише середній корелятивний зв'язок г= –0,540–0,604. Це зумовлено особливостями ферментів, що досліджували – для поліфенолоксидази оптимальною є нейтральна та слаболужна реакція ґрунтового розчину і тому її активність знижується при переході до кислих умов. Оптимальні рівні рН для пероксидази, навпаки, розміщуються у кислому інтервалі, тому при зміні рівня кислотності перокси-даза має вищий рівень толерантності.

При застосуванні добрив на чорноземі типовому, який характеризується вищою буферною здатністю, також підвищувалася обмінна кислотність, але це не супроводжувалося підвищенням вмісту рухомого алюмінію. Обмінна кислотність формувалася, в основному, за рахунок іонів водню. Депресивного впливу педохімічних властивостей мінеральних добрив на активність ферментів за цих умов не спостерігали, про що свідчить підвищення рівня їхньої активності (табл. 2).

Одержані результати засвідчили, що активність ферментів групи оксидоредуктаз залежить від вмісту іонів алюмінію, які за певних концентрацій можуть проявляти токсичні властивості щодо біологічних об'єктів.

Активність ферментів може бути чутливим показником і щодо забруднення ґрунту біохімічне активними речовинами. Так, при збільшенні рівня забруднення Cd, Pb, Zn, Cu з 0,5 ГДК до 5,0 ГДК значно знижувалась активність пероксидази і поліфенолоксидази щодо фону на 15,1–64,1% і 25,8–82,7% відповідно (табл. 3). Ферменти ґрунту, за даними Е. Хоффман (1990р.), на відміну від живих організмів, є стабільнішими показниками, оскільки при відмиранні організмів адсорбуються ґрунтовими частками і тривалий час зберігають свою активність. Депресивний вплив забруднення ґрунту ВМ на рівні 1,0–5,0 ГДК спостерігали впродовж тривалого часу. Через рік після створення штучних фонів забруднення активність поліфенолоксидази становила 86,6–91,3%, пероксидази 82,3–88,5% контролю.

Апроксимація одержаних даних з використанням ступеневого рівняння залежності активності ґрунтових ферментів групи оксидоредуктаз від рівня забруднення грунту ВМ дала можливість провести порівняльну оцінку біотестування за активністю поліфенолоксидази і пероксидази. Рівень толерантності цих ґрунтових ферментів був близький і становив відповідно 1,5 і 1,7 у. о. (рис. 5).

Поряд з активністю ферментів, сприятливим щодо забруднення є такий показник стану ґрунту, як нітрифікаційна здатність, що є опосередкованим показником активності певної групи ґрунтових бактерій роду Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosospira і Nitrobacter. Нітрифікато-ри групи Nitrosomonas окислюють аміак до нітритів, групи Nitrobacter – нітрити до нітратів.

Таблиця 2. Активність ферментів групи оксидоредуктаз при застосуванні мінеральних добрив на дерново-середньопідзолистому ґрунті і чорноземі типовому

Кількість добрив, кг/га	Кислотність ґрунту, мг-екв/100 г ґрунту		Вміст АІ, мг/ЮОг ґрунту	Ферментативна активність ґрунту, мг пурпургаліну на 1 г ґрунту
	загальна	зумовлена Н+		поліфенолоксидаза	пероксидаза
	f1	f2	f3	f4	f5
Ґрунт - дерново-середньопідзолистий
Контроль	0,41	0,14	2,40	0,440* 100%**	0,293 100%
120 РК	0,53	0,16	3,38	0,398 90,5%	0,372 127,0%
210 NPK	0,63	0,16	4,20	0,354 80,5%	0,260 88,7%
240 NPK	0,69	0,12	5,10	0,329 74,7%	0,240 81,9%
R(f1-f4)= - 0,998 R(f3-f4)= - 0,996 R(f2-f5)= 0,604 R(f2-f4)= - 0,980 R(f1-f5)= - 0,540 R(f3-f5)= - 0,569
Ґрунт - чорнозем типовий малогумусний
Контроль	0,34	0,12	2,02	0,332 100%	0,300 100%
120 РК	0,38	0,12	2,34	0,444 133,7%	0,409 136,3%
210 NPK	0,44	0,31	1,17	0,429 129,2%	0,300 100%
240 NPK	0,49	0,31	1,62	0,459 138,3%	0,354 118,0%
НІР 0,05 (FТ>Рф)	0,15	0,03	0,37	–	------
R (f1-f4) = 0,781 R (f3-f4) = -0,129 R (f2-f5) = 0,294 R (f2-f4) = 0,658 R (f1-f5) = - 0,491 R (f3-f5) = 0,302
* – фактичний вміст, ** – % до контролю

Таблиця 3. Реакція біологічних індикаторів на забруднення грунту ВМ

Рівень забруднення ґрунту	Біологічні тести стану ґрунтової системи
	Нітрифікаційна здатність		Ферментативна активність
			поліфенолоксидаза		пероксидаза
	мг N<V на 100 г ґрунту	% щодо фону	мг пурпургаліну/ЮОг ґрунту	% щодо фону	мг пурпургаліну/100 г ґрунту	% щодо фону
Фон	45,4	-	103,2	-	86,4	-
0,5 ГДК Cd, Pb, Zn, Cu	18,5	-59,8	87,6	-15,1	64,1	-25,8
1 ,0 ГДК Cd, Pb, Zn, Cu	13,5	-70,7	45,4	-56,0	32,9	-61,9
5,0 ГДК Cd, Pb, Zn, Cu	3,7	-96,3	37,0	-64,1	14,9	-82,7
HIP 0,05 (FT > Рф)	4,2	-	5,3	-	4,9	-

Рис. 5. Біотестування забруднення дерново-середньопідзолистого ґрунту ВМ за показниками активності ґрунтових ферментів: 1 – поліфенолоксидаза; 2 – пероксидаза (мг пурпургаліну/г грунту)

Дослідами Інституту експериментальної біології і екології (Словаччина) доведено, що завдяки високій вибагливості нітрифікаторів щодо фізико-хімічних умов середовища, можна вважати нітрифікацію об'єктивним і чутливим показником стану ґрунтової екосистеми. У дослідах Інституту агроекології та біотехнології УААН нітрифікаційна здатність при створенні штучних фонів забруднення ґрунту ВМ зменшувалася на 59,8%–96,3% порівняно з фоном при збільшенні рівня забруднення.

Депресивний вплив ВМ на бактерії-нітрифікатори був помітним і через рік після створення штучних рівнів забруднення грунту. Так, нітрифікаційна здатність грунту на контролі становила 42,4 мг/кг NO3~, при рівні забруднення 0,5 ГДК – 28,7 мг/кг, 1,0 ГДК – 20,2 мг/кг, 5,0 ГДК – 8,6 мг /кг NO3. Це свідчить про високу сприйнятливість даного виду біотестування щодо БАЕ.

Апроксимація одержаних даних з високим рівнем достовірності (R2= 0,978), використання ступеневого рівняння залежності нітрифі-каційної здатності ґрунту від рівня забруднення ВМ, дало можливість встановити ефективність даного виду біотестування: рівень толерантності становив 1,4 у. о. (рис. 6).

Рис. 6. Біотестування забруднення дерново-середньопідзолистого ґрунту ВМ за показниками нітрифікаційної здатності ґрунту (мг/кг NO,~)

Таким чином, визначення ефективності біоіндикаційних процесів щодо забруднення ґрунту БАЕ за рівнем активної толерантності (25% рівень депресії), дає змогу розташувати біоіндикаційні методи у такій нисхідній послідовності: індикація за активністю нітрифікуючих бактерій > індикація за показниками активності біохімічних процесів у ґрунті > фітоіндикація на онтогенетичному рівні > фітоіндикація за показниками біопродуктивності.